محاسبه غلظت DNA

مقدمه

محاسبه غلظت DNA ابزاری ضروری برای زیست‌شناسان مولکولی، ژنتیک‌دانان و تکنسین‌های آزمایشگاهی است که نیاز دارند تا به‌طور دقیق غلظت DNA در نمونه‌های خود را تعیین کنند. اندازه‌گیری غلظت DNA یک فرآیند بنیادی در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی مولکولی است که به‌عنوان یک مرحله کنترل کیفیت حیاتی قبل از ادامه با کاربردهای پایین‌دست مانند PCR، توالی‌یابی، کلونینگ و سایر تکنیک‌های مولکولی عمل می‌کند. این محاسبه‌گر از اصول اسپکتروفتومتری برای محاسبه غلظت DNA بر اساس جذب UV در 260 نانومتر (A260) استفاده می‌کند و از عامل تبدیل استاندارد استفاده کرده و هرگونه رقیق‌سازی نمونه اصلی را در نظر می‌گیرد.

محاسبه‌گر کاربرپسند ما فرآیند تعیین غلظت (ng/μL) و مقدار کل DNA در نمونه شما را ساده می‌کند و نیاز به محاسبات دستی را از بین می‌برد و خطر خطاهای ریاضی را کاهش می‌دهد. چه در حال آماده‌سازی نمونه‌ها برای توالی‌یابی نسل بعدی، چه در حال کمی‌سازی آماده‌سازی‌های پلاسمید یا ارزیابی بازده استخراج DNA ژنومی باشید، این ابزار نتایج سریع و قابل اعتمادی را برای حمایت از تحقیقات و جریان‌های تشخیصی شما ارائه می‌دهد.

نحوه محاسبه غلظت DNA

اصل اساسی

محاسبه غلظت DNA بر اساس قانون Beer-Lambert استوار است که بیان می‌کند جذب یک محلول به‌طور مستقیم با غلظت گونه‌های جذب‌کننده در محلول و طول مسیر نور از طریق محلول متناسب است. برای DNA دو رشته‌ای، یک جذب 1.0 در 260 نانومتر (A260) در یک کووت با طول مسیر 1 سانتی‌متر معادل غلظت تقریبی 50 ng/μL است.

فرمول

غلظت DNA با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‌شود:

$\text{غلظت DNA (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{عامل رقیق‌سازی}$

که در آن:

• A260 خوانش جذب در 260 نانومتر است
• 50 عامل تبدیل استاندارد برای DNA دو رشته‌ای است (50 ng/μL برای A260 = 1.0)
• عامل رقیق‌سازی عاملی است که نمونه اصلی برای اندازه‌گیری رقیق شده است

مقدار کل DNA در نمونه سپس می‌تواند با استفاده از:

$\text{کل DNA (μg)} = \frac{\text{غلظت (ng/μL)} \times \text{حجم (μL)}}{1000}$

محاسبه شود.

درک متغیرها

1. جذب در 260 نانومتر (A260):

   • این اندازه‌گیری میزان نوری است که نور UV در طول موج 260 نانومتر توسط نمونه DNA جذب می‌شود
   • نوکلئوتیدهای DNA (به‌ویژه بازهای نیتروژنی) نور UV را با حداکثر جذب در 260 نانومتر جذب می‌کنند
   • هرچه جذب بیشتر باشد، DNA بیشتری در محلول وجود دارد

2. عامل تبدیل (50):

   • عامل تبدیل استاندارد 50 ng/μL به‌طور خاص برای DNA دو رشته‌ای است
   • برای DNA تک رشته‌ای، این عامل 33 ng/μL است
   • برای RNA، این عامل 40 ng/μL است
   • برای الیگونوکلئوتیدها، این عامل بسته به توالی متفاوت است

3. عامل رقیق‌سازی:

   • اگر نمونه قبل از اندازه‌گیری رقیق شده باشد (به‌عنوان مثال، 1 قسمت نمونه به 9 قسمت بافر = عامل رقیق‌سازی 10)
   • به‌صورت زیر محاسبه می‌شود: (حجم نمونه + حجم رقیق‌کننده) ÷ حجم نمونه
   • برای تعیین غلظت در نمونه اصلی و غیربه‌هم‌ریخته استفاده می‌شود

4. حجم:

   • حجم کل محلول DNA شما به میکرولیتر (μL)
   • برای محاسبه مقدار کل DNA در نمونه استفاده می‌شود

نحوه استفاده از این محاسبه‌گر

برای تعیین دقیق غلظت DNA خود، مراحل زیر را دنبال کنید:

1. نمونه خود را آماده کنید:

   • اطمینان حاصل کنید که نمونه DNA شما به‌طور صحیح حل و مخلوط شده است
   • اگر انتظار می‌رود غلظت بالا باشد، یک رقیق‌سازی برای اطمینان از اینکه خوانش در محدوده خطی قرار دارد (معمولاً A260 بین 0.1 و 1.0) انجام دهید

2. اندازه‌گیری جذب:

   • از یک اسپکتروفتومتر یا دستگاه نانو دراپ برای اندازه‌گیری جذب در 260 نانومتر استفاده کنید
   • همچنین جذب در 280 نانومتر را برای ارزیابی خلوص (نسبت A260/A280) اندازه‌گیری کنید
   • از همان بافری که برای حل/رقیق‌سازی DNA خود استفاده کرده‌اید به‌عنوان مرجع خالی استفاده کنید

3. ورود مقادیر به محاسبه‌گر:

   • مقدار A260 اندازه‌گیری شده را در فیلد "جذب در 260 نانومتر" وارد کنید
   • حجم کل محلول DNA خود را به میکرولیتر وارد کنید
   • عامل رقیق‌سازی را وارد کنید (اگر رقیق‌سازی انجام نشده است، از 1 استفاده کنید)

4. تفسیر نتایج:

   • محاسبه‌گر غلظت DNA را به‌صورت ng/μL نمایش خواهد داد
   • مقدار کل DNA در نمونه به μg نشان داده خواهد شد
   • از این مقادیر برای تعیین حجم مناسب مورد نیاز برای کاربردهای پایین‌دست استفاده کنید

5. ارزیابی خلوص DNA (اگر A280 اندازه‌گیری شده باشد):

   • نسبت A260/A280 حدود 1.8 نشان‌دهنده DNA خالص است
   • نسبت‌های پایین‌تر ممکن است نشان‌دهنده آلودگی پروتئینی باشد
   • نسبت‌های بالاتر ممکن است نشان‌دهنده آلودگی RNA باشد

موارد استفاده

اندازه‌گیری غلظت DNA در بسیاری از کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی حیاتی است:

کلونینگ مولکولی

قبل از متصل کردن قطعات DNA به وکتورها، دانستن غلظت دقیق اجازه می‌دهد تا محققان نسبت بهینه بین وارد و وکتور را محاسبه کنند و کارایی تبدیل را به حداکثر برسانند. به‌عنوان مثال، نسبت مولی 3:1 از وارد به وکتور معمولاً بهترین نتایج را به‌دست می‌دهد که نیاز به اندازه‌گیری‌های دقیق غلظت هر دو مؤلفه دارد.

PCR و qPCR

واکنش‌های PCR معمولاً به 1-10 ng از DNA الگو برای بهینه‌سازی تقویت نیاز دارند. DNA خیلی کم ممکن است منجر به عدم موفقیت در تقویت شود، در حالی که مقدار زیاد می‌تواند واکنش را مهار کند. برای PCR کمی (qPCR)، حتی اندازه‌گیری دقیق‌تر DNA ضروری است تا اطمینان حاصل شود که منحنی‌های استاندارد دقیق و کمی‌سازی قابل اعتمادی وجود دارد.

توالی‌یابی نسل بعدی (NGS)

پروتکل‌های آماده‌سازی کتابخانه NGS مقادیر ورودی دقیق DNA را مشخص می‌کنند که معمولاً در محدوده 1-500 ng بسته به پلتفرم و کاربرد است. اندازه‌گیری دقیق غلظت برای موفقیت در آماده‌سازی کتابخانه و نمایندگی متوازن نمونه‌ها در دویدن‌های توالی‌یابی چندگانه ضروری است.

آزمایش‌های ترنسفکشن

هنگامی که DNA به سلول‌های یوکاریوتی معرفی می‌شود، مقدار بهینه DNA بسته به نوع سلول و روش ترنسفکشن متفاوت است. معمولاً 0.5-5 μg از DNA پلاسمیدی در هر چاهک در یک فرمت 6 چاهکی استفاده می‌شود که نیاز به اندازه‌گیری دقیق غلظت برای استانداردسازی آزمایش‌ها دارد.

تجزیه و تحلیل DNA قانونی

در کاربردهای قانونی، نمونه‌های DNA معمولاً محدود و با ارزش هستند. کمی‌سازی دقیق به دانشمندان قانونی اجازه می‌دهد تا تعیین کنند آیا DNA کافی برای پروفایل‌سازی وجود دارد و مقدار DNA مورد استفاده در تحلیل‌های بعدی را استاندارد کنند.

هضم آنزیم‌های محدودکننده

آنزیم‌های محدودکننده دارای واحدهای فعالیت خاصی هستند که به ازای هر μg DNA تعریف شده‌اند. دانستن غلظت دقیق DNA اجازه می‌دهد تا نسبت‌های مناسب آنزیم به DNA تعیین شود و اطمینان حاصل شود که هضم کامل بدون فعالیت ستاره‌ای (برش غیرخاص) انجام می‌شود.

جایگزین‌ها برای اندازه‌گیری اسپکتروفتومتری

در حالی که اسپکتروفتومتری UV رایج‌ترین روش برای کمی‌سازی DNA است، چندین جایگزین وجود دارد:

1. روش‌های فلورومتریک:

   • رنگدانه‌های فلورسانس مانند PicoGreen، Qubit و SYBR Green به‌طور خاص به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شوند
   • حساس‌تر از اسپکتروفتومتری هستند (می‌توانند به اندازه 25 pg/mL شناسایی کنند)
   • کمتر تحت تأثیر آلودگی‌هایی مانند پروتئین‌ها، RNA یا نوکلئوتیدهای آزاد قرار می‌گیرند
   • نیاز به یک فلورومتر و مواد شیمیایی خاص دارند

2. الکتروفورز آگارز:

   • DNA می‌تواند با مقایسه شدت باند با استانداردهای با غلظت شناخته شده کمی‌سازی شود
   • به‌طور همزمان اطلاعاتی درباره اندازه و یکپارچگی DNA ارائه می‌دهد
   • کمتر دقیق‌تر از روش‌های اسپکتروفتومتری یا فلورومتریک است
   • زمان‌بر است اما برای تأیید بصری مفید است

3. PCR واقعی‌زمان:

   • روش بسیار حساسی برای کمی‌سازی توالی‌های خاص DNA است
   • می‌تواند غلظت‌های بسیار پایین (تا چند کپی) را شناسایی کند
   • نیاز به پرایمرهای خاص و تجهیزات پیچیده‌تر دارد
   • زمانی که کمی‌سازی خاص توالی مورد نیاز است، استفاده می‌شود

4. PCR دیجیتال:

   • کمی‌سازی مطلق بدون منحنی‌های استاندارد
   • برای اهداف با فراوانی کم بسیار دقیق است
   • گران‌قیمت و نیاز به تجهیزات خاص دارد
   • برای شناسایی جهش‌های نادر و تحلیل تغییرات تعداد کپی استفاده می‌شود

تاریخچه اندازه‌گیری غلظت DNA

توانایی اندازه‌گیری دقیق غلظت DNA به‌طور قابل توجهی در کنار پیشرفت‌های زیست‌شناسی مولکولی تکامل یافته است:

روش‌های اولیه (1950-1960)

پس از کشف ساختار DNA توسط واتسون و کریک در سال 1953، دانشمندان شروع به توسعه روش‌هایی برای جداسازی و کمی‌سازی DNA کردند. رویکردهای اولیه به آزمایش‌های رنگ‌سنجی مانند واکنش دی‌فنل‌آمین وابسته بودند که هنگام واکنش با قندهای دئوکسی‌ریبو در DNA رنگ آبی تولید می‌کرد. این روش‌ها نسبتاً حساس و مستعد تداخل بودند.

عصر اسپکتروفتومتری (1970)

کاربرد اسپکتروفتومتری UV برای کمی‌سازی اسیدهای نوکلئیک در دهه 1970 به‌طور گسترده‌ای رواج یافت. دانشمندان دریافتند که DNA نور UV را با حداکثر در 260 نانومتر جذب می‌کند و اینکه رابطه بین جذب و غلظت در یک محدوده خاص خطی است. عامل تبدیل 50 ng/μL برای DNA دو رشته‌ای در این دوره تعیین شد.

انقلاب فلورومتریک (1980-1990)

توسعه رنگدانه‌های فلورسانس خاص DNA در دهه‌های 1980 و 1990 کمی‌سازی DNA را به‌ویژه برای نمونه‌های رقیق متحول کرد. رنگدانه‌های هوشت و بعداً PicoGreen امکان شناسایی بسیار حساس‌تری را نسبت به آنچه با اسپکتروفتومتری ممکن بود، فراهم کردند. این روش‌ها به‌ویژه با ظهور PCR که معمولاً نیاز به کمی‌سازی دقیق مقادیر کمی DNA داشت، اهمیت پیدا کردند.

عصر مدرن (2000-حال)

معرفی اسپکتروفتومترهای میکروحجم مانند NanoDrop در اوایل دهه 2000 کمی‌سازی روزمره DNA را با نیاز به تنها 0.5-2 μL از نمونه متحول کرد. این فناوری نیاز به رقیق‌سازی و کووت‌ها را از بین برد و فرآیند را سریع‌تر و راحت‌تر کرد.

امروز، تکنیک‌های پیشرفته‌ای مانند PCR دیجیتال و توالی‌یابی نسل بعدی مرزهای کمی‌سازی DNA را حتی بیشتر پیش برده‌اند و امکان کمی‌سازی مطلق توالی‌های خاص و شناسایی مولکول‌های منفرد را فراهم کرده‌اند. با این حال، اصل اسپکتروفتومتری پایه‌گذار اندازه‌گیری غلظت DNA در روال‌های آزمایشگاهی در سرتاسر جهان باقی مانده است.

مثال‌های عملی

بیایید به برخی از مثال‌های عملی محاسبات غلظت DNA بپردازیم:

مثال 1: آماده‌سازی پلاسمید استاندارد

یک محقق یک پلاسمید را خالص کرده و اندازه‌گیری‌های زیر را به‌دست آورده است:

• خوانش A260: 0.75
• رقیق‌سازی: 1:10 (عامل رقیق‌سازی = 10)
• حجم محلول DNA: 50 μL

محاسبه:

• غلظت = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• کل DNA = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

مثال 2: استخراج DNA ژنومی

پس از استخراج DNA ژنومی از خون:

• خوانش A260: 0.15
• بدون رقیق‌سازی (عامل رقیق‌سازی = 1)
• حجم محلول DNA: 200 μL

محاسبه:

• غلظت = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• کل DNA = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

مثال 3: آماده‌سازی DNA برای توالی‌یابی

یک پروتکل توالی‌یابی به طور دقیق 500 ng DNA نیاز دارد:

• غلظت DNA: 125 ng/μL
• مقدار مورد نیاز: 500 ng

حجم مورد نیاز = 500 ÷ 125 = 4 μL از محلول DNA

مثال‌های کد

در اینجا مثال‌هایی از نحوه محاسبه غلظت DNA در زبان‌های برنامه‌نویسی مختلف آورده شده است:

1' فرمول Excel برای غلظت DNA
2=A260*50*عامل_رقیق‌سازی
3
4' فرمول Excel برای مقدار کل DNA به μg
5=(A260*50*عامل_رقیق‌سازی*حجم)/1000
6
7' مثال در یک سلول با A260=0.5، عامل_رقیق‌سازی=2، حجم=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' نتیجه: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    محاسبه غلظت DNA به ng/μL
4    
5    پارامترها:
6    absorbance (float): خوانش جذب در 260 نانومتر
7    dilution_factor (float): عامل رقیق‌سازی نمونه
8    
9    برمی‌گرداند:
10    float: غلظت DNA به ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    محاسبه مقدار کل DNA به μg
17    
18    پارامترها:
19    concentration (float): غلظت DNA به ng/μL
20    volume_ul (float): حجم محلول DNA به μL
21    
22    برمی‌گرداند:
23    float: مقدار کل DNA به μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# مثال استفاده
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"غلظت DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"کل DNA: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // برمی‌گرداند غلظت DNA به ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // برمی‌گرداند مقدار کل DNA به μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// مثال استفاده
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`غلظت DNA: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`کل DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * محاسبه غلظت DNA به ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance خوانش جذب در 260 نانومتر
6     * @param dilutionFactor عامل رقیق‌سازی نمونه
7     * @return غلظت DNA به ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * محاسبه مقدار کل DNA به μg
15     * 
16     * @param concentration غلظت DNA به ng/μL
17     * @param volumeUL حجم محلول DNA به μL
18     * @return مقدار کل DNA به μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("غلظت DNA: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("کل DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# تابع R برای محاسبه غلظت DNA
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # برمی‌گرداند غلظت DNA به ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # برمی‌گرداند مقدار کل DNA به μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# مثال استفاده
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("غلظت DNA: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("کل DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

سوالات متداول

تفاوت بین غلظت DNA و خلوص DNA چیست؟

غلظت DNA به مقدار DNA موجود در یک محلول اشاره دارد که معمولاً به ng/μL یا μg/mL اندازه‌گیری می‌شود. این به شما می‌گوید که چه مقدار DNA دارید اما کیفیت آن را نشان نمی‌دهد. خلوص DNA وجود آلودگی‌ها در نمونه DNA شما را ارزیابی می‌کند و معمولاً با نسبت‌های جذب مانند A260/A280 (برای آلودگی پروتئینی) و A260/A230 (برای آلودگی ترکیبات آلی) اندازه‌گیری می‌شود. DNA خالص معمولاً نسبت A260/A280 حدود 1.8 و نسبت A260/A230 بین 2.0-2.2 دارد.

چرا عامل تبدیل برای DNA، RNA و پروتئین‌ها متفاوت است؟

عامل‌های تبدیل متفاوت هستند زیرا هر بیومولکول دارای ضریب انقراض منحصر به فردی (توانایی جذب نور) است که به ترکیب شیمیایی متفاوت آنها بستگی دارد. DNA دو رشته‌ای دارای عامل تبدیل 50 ng/μL در A260=1.0 است، در حالی که DNA تک رشته‌ای 33 ng/μL، RNA 40 ng/μL و پروتئین‌ها (که در 280 نانومتر اندازه‌گیری می‌شوند) به‌طور متوسط حدود 1 mg/mL در A280=1.0 دارند. این تفاوت‌ها ناشی از ترکیب‌های مختلف نوکلئوتیدها یا آمینواسیدها و خواص جذب مربوطه آنها است.

دقت اندازه‌گیری غلظت DNA با اسپکتروفتومتری چقدر است؟

اندازه‌گیری غلظت DNA با اسپکتروفتومتری معمولاً در محدوده خطی (معمولاً A260 بین 0.1 و 1.0) دقیق است و دقت آن حدود ±3-5% است. با این حال، دقت در غلظت‌های بسیار پایین (زیر 5 ng/μL) کاهش می‌یابد و می‌تواند تحت تأثیر آلودگی‌هایی مانند پروتئین‌ها، RNA، نوکلئوتیدهای آزاد یا برخی بافرها قرار گیرد. برای اندازه‌گیری‌های بسیار دقیق نمونه‌های رقیق یا زمانی که خلوص بالا مورد نیاز است، روش‌های فلورومتریک مانند Qubit یا PicoGreen توصیه می‌شود زیرا آنها به‌طور خاص به DNA دو رشته‌ای حساس‌تر هستند.

چگونه نسبت A260/A280 را تفسیر کنم؟

نسبت A260/A280 خلوص نمونه DNA شما را از نظر آلودگی پروتئینی نشان می‌دهد:

• نسبت حدود 1.8 به‌عنوان "خالص" برای DNA به‌طور کلی پذیرفته می‌شود
• نسبت‌های زیر 1.8 ممکن است نشان‌دهنده آلودگی پروتئینی باشند
• نسبت‌های بالای 2.0 ممکن است نشان‌دهنده آلودگی RNA باشند
• pH و قدرت یونی محلول نیز می‌تواند بر این نسبت تأثیر بگذارد

در حالی که به‌عنوان یک بررسی کیفیت مفید است، نسبت A260/A280 تضمینی برای DNA عملکردی نیست، زیرا سایر آلودگی‌ها یا تخریب DNA ممکن است بر این نسبت تأثیر نگذارد.

آیا می‌توانم غلظت DNA را در محلول‌های رنگی اندازه‌گیری کنم؟

اندازه‌گیری غلظت DNA در محلول‌های رنگی با استفاده از اسپکتروفتومتری می‌تواند چالش‌برانگیز باشد زیرا رنگ ممکن است در یا نزدیک 260 نانومتر جذب کند و با اندازه‌گیری DNA تداخل ایجاد کند. در چنین مواردی:

1. یک اسکن طول موج (220-320nm) انجام دهید تا الگوهای جذب غیرعادی را بررسی کنید
2. از یک روش فلورومتریک مانند Qubit استفاده کنید که کمتر تحت تأثیر رنگ نمونه قرار می‌گیرد
3. DNA را بیشتر خالص کنید تا ترکیبات رنگی را حذف کنید
4. اگر طیف جذب ترکیب مداخله‌گر شناخته شده باشد، اصلاحات ریاضی را اعمال کنید

حداقل حجم مورد نیاز برای اندازه‌گیری غلظت DNA چقدر است؟

حداقل حجم بستگی به دستگاه مورد استفاده دارد:

• اسپکتروفتومترهای سنتی با کووت‌ها معمولاً به 50-100 μL نیاز دارند
• اسپکتروفتومترهای میکروحجم مانند NanoDrop تنها به 0.5-2 μL نیاز دارند
• روش‌های فلورومتریک معمولاً به 1-20 μL از نمونه به‌علاوه حجم ماده شیمیایی نیاز دارند
• خواننده‌های میکروپلیت معمولاً به 100-200 μL در هر چاهک نیاز دارند

اسپکتروفتومترهای میکروحجم با اجازه دادن به اندازه‌گیری نمونه‌های ارزشمند با حداقل نیازهای حجمی، کمی‌سازی DNA را متحول کرده‌اند.

چگونه عامل رقیق‌سازی را محاسبه کنم؟

عامل رقیق‌سازی به‌صورت زیر محاسبه می‌شود:

$\text{عامل رقیق‌سازی} = \frac{\text{حجم کل (نمونه + رقیق‌کننده)}}{\text{حجم نمونه}}$

به‌عنوان مثال:

• اگر 1 μL DNA را به 99 μL بافر اضافه کنید، عامل رقیق‌سازی 100 است
• اگر 5 μL DNA را به 45 μL بافر اضافه کنید، عامل رقیق‌سازی 10 است
• اگر از DNA بدون رقیق‌سازی استفاده کنید، عامل رقیق‌سازی 1 است

همیشه از همان بافر برای رقیق‌سازی استفاده کنید که برای خالی کردن اسپکتروفتومتر استفاده شده است.

چگونه بین واحدهای مختلف غلظت تبدیل کنم؟

تبدیل‌های رایج غلظت DNA:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM از یک قطعه DNA 1000 bp ≈ 660 ng/μL

برای تبدیل از غلظت جرمی (ng/μL) به غلظت مولی (nM) برای یک قطعه DNA:

$\text{غلظت (nM)} = \frac{\text{غلظت (ng/μL)} \times 10^6}{\text{طول DNA (bp)} \times 660}$

چه عواملی می‌توانند منجر به اندازه‌گیری‌های نادرست غلظت DNA شوند؟

چندین عامل می‌توانند منجر به اندازه‌گیری‌های نادرست غلظت DNA شوند:

1. آلودگی: پروتئین‌ها، فنول، گوانیدین یا سایر مواد شیمیایی استخراج می‌توانند بر جذب تأثیر بگذارند
2. حباب‌ها: حباب‌های هوا در مسیر نور می‌توانند خوانش‌های نادرست ایجاد کنند
3. تخریب DNA: DNA تکه‌تکه شده ممکن است خواص جذب متفاوتی داشته باشد
4. خالی‌سازی نادرست: استفاده از بافر متفاوت برای خالی کردن نسبت به آنچه DNA در آن حل شده است
5. محلول غیر همگن: محلول‌های DNA به‌طور ناکافی مخلوط شده خوانش‌های ناهماهنگ می‌دهند
6. کالیبراسیون دستگاه: اسپکتروفتومترهای کالیبره نشده یا کثیف نتایج غیرقابل اعتماد تولید می‌کنند
7. اندازه‌گیری‌ها در خارج از محدوده خطی: مقادیر بسیار بالا یا بسیار پایین ممکن است دقیق نباشند

آیا می‌توانم از این محاسبه‌گر برای غلظت RNA استفاده کنم؟

در حالی که این محاسبه‌گر برای DNA دو رشته‌ای بهینه‌سازی شده است (با استفاده از عامل تبدیل 50 ng/μL)، می‌توانید آن را برای RNA با:

1. اندازه‌گیری A260 به‌طور معمول
2. ضرب کردن در 40 به‌جای 50 (عامل تبدیل خاص RNA)
3. اعمال عامل رقیق‌سازی مناسب

فرمول برای RNA به‌صورت زیر خواهد بود: $\text{غلظت RNA (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{عامل رقیق‌سازی}$

منابع

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

آیا آماده‌اید تا غلظت DNA خود را محاسبه کنید؟ از محاسبه‌گر ما در بالا برای دریافت نتایج دقیق به‌طور فوری استفاده کنید. به سادگی خوانش جذب، حجم و عامل رقیق‌سازی خود را وارد کنید تا هم غلظت و هم مقدار کل DNA در نمونه خود را تعیین کنید.