DNR Koncentracijos Skaičiuoklė

Įvadas

DNR koncentracijos skaičiuoklė yra esminis įrankis molekulinės biologijos, genetikos ir laboratorijų technikų specialistams, kuriems reikia tiksliai nustatyti DNR koncentraciją jų mėginiuose. DNR koncentracijos matavimas yra pagrindinė procedūra molekulinės biologijos laboratorijose, tarnaujanti kaip kritinė kokybės kontrolės žingsnis prieš tęsiant tolesnes programas, tokias kaip PCR, sekvenavimas, klonavimas ir kitos molekulinės technikos. Ši skaičiuoklė naudoja spektrofotometrinius principus DNR koncentracijai apskaičiuoti, remdamasi UV sugertimi 260 nm (A260), taikydama standartinį konversijos koeficientą ir atsižvelgdama į bet kokį originalaus mėginio praskiedimą.

Mūsų vartotojui patogi skaičiuoklė supaprastina DNR koncentracijos (ng/μL) ir bendros DNR kiekio jūsų mėginyje nustatymo procesą, pašalindama poreikį atlikti rankinius skaičiavimus ir sumažindama matematikos klaidų riziką. Nesvarbu, ar ruošiate mėginius naujos kartos sekvenavimui, kiekybiškai įvertinate plazmidžių paruošimus, ar vertinate genominės DNR ekstrakcijos derlių, šis įrankis suteikia greitus ir patikimus rezultatus, kad palaikytų jūsų tyrimus ir diagnostikos darbus.

Kaip Apskaičiuojama DNR Koncentracija

Pagrindinis Principas

DNR koncentracijos skaičiavimas remiasi Beer-Lambert įstatymu, kuris teigia, kad tirpalo sugertis yra tiesiogiai proporcinga absorbuojančių medžiagų koncentracijai tirpale ir šviesos kelio ilgiui per tirpalą. Dvigubos grandinės DNR atveju sugertis 1.0 260 nm (A260) 1 cm kelio ilgio cuvette atitinka maždaug 50 ng/μL koncentraciją.

Formulė

DNR koncentracija apskaičiuojama naudojant šią formulę:

$\text{DNR Koncentracija (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Praskiedimo Koeficientas}$

Kur:

• A260 yra sugerties rodmuo 260 nm
• 50 yra standartinis konversijos koeficientas dvigubos grandinės DNR (50 ng/μL, kai A260 = 1.0)
• Praskiedimo Koeficientas yra faktorius, kuriuo buvo praskiestas originalus mėginys matavimui

Bendra DNR kiekio mėginyje apskaičiavimas gali būti atliekamas taip:

$\text{Bendra DNR (μg)} = \frac{\text{Koncentracija (ng/μL)} \times \text{Tūris (μL)}}{1000}$

Kintamųjų Supratimas

1. Sugertis 260 nm (A260):

   • Tai yra UV šviesos, 260 nm bangos ilgio, sugerties matavimas DNR mėginyje
   • DNR nukleotidai (ypač azotinės bazės) sugeria UV šviesą su maksimalia sugertimi 260 nm
   • Kuo didesnė sugertis, tuo daugiau DNR yra tirpale

2. Konversijos Koeficientas (50):

   • Standartinis konversijos koeficientas 50 ng/μL yra specifinis dvigubai grandinei DNR
   • Viengubai grandinei DNR koeficientas yra 33 ng/μL
   • RNR koeficientas yra 40 ng/μL
   • Oligonukleotidams koeficientas skiriasi priklausomai nuo sekos

3. Praskiedimo Koeficientas:

   • Jei mėginys buvo praskiestas prieš matavimą (pvz., 1 dalis mėginio į 9 dalis buferio = praskiedimo koeficientas 10)
   • Apskaičiuojamas kaip: (Mėginio Tūris + Praskiedimo Tūris) ÷ Mėginio Tūris
   • Naudojamas nustatyti koncentraciją originaliame, nepraskiestame mėginyje

4. Tūris:

   • Bendras jūsų DNR tirpalo tūris mikrolitrais (μL)
   • Naudojamas apskaičiuojant bendrą DNR kiekį mėginyje

Kaip Naudoti Šią Skaičiuoklę

Sekite šiuos žingsnius, kad tiksliai nustatytumėte DNR koncentraciją:

1. Paruoškite Savo Mėginį:

   • Įsitikinkite, kad jūsų DNR mėginys yra tinkamai ištirpintas ir sumaišytas
   • Jei tikimasi, kad koncentracija bus didelė, paruoškite praskiedimą, kad užtikrintumėte, jog matavimas pateks į linijinį diapazoną (paprastai A260 tarp 0.1 ir 1.0)

2. Išmatuokite Sugertį:

   • Naudokite spektrofotometrą arba nanodrop prietaisą, kad išmatuotumėte sugertį 260 nm
   • Taip pat išmatuokite sugertį 280 nm, kad įvertintumėte grynumą (A260/A280 santykis)
   • Naudokite tą patį buferį, kuris buvo naudojamas DNR ištirpinimui/praskiedimui, kaip tuščią referenciją

3. Įveskite Vertes Skaičiuoklėje:

   • Įveskite išmatuotą A260 vertę į „Sugertis 260 nm“ laukelį
   • Įveskite bendrą DNR tirpalo tūrį mikrolitrais
   • Įveskite praskiedimo koeficientą (naudokite 1, jei nebuvo praskiedimo)

4. Interpretacija Rezultatų:

   • Skaičiuoklė parodys DNR koncentraciją ng/μL
   • Bendra DNR kiekis mėginyje bus rodomas μg
   • Naudokite šias vertes, kad nustatytumėte, kiek tūrio reikia tolesnėms programoms

5. Įvertinkite DNR Grynumą (jei buvo išmatuota A280):

   • A260/A280 santykis apie ~1.8 rodo gryną DNR
   • Mažesni santykiai gali rodyti baltymų užterštumą
   • Didesni santykiai gali rodyti RNR užterštumą

Naudojimo Atvejai

DNR koncentracijos matavimas yra būtinas daugybėje molekulinės biologijos ir biotechnologijos programų:

Molekulinis Klonavimas

Prieš liguojant DNR fragmentus į vektorius, žinoti tikslią koncentraciją leidžia tyrėjams apskaičiuoti optimalų įterpimo ir vektoriaus santykį, maksimalizuojant transformacijos efektyvumą. Pavyzdžiui, 3:1 molinis santykis tarp įterpimo ir vektoriaus dažnai duoda geriausius rezultatus, kuriems reikia tikslių koncentracijos matavimų abiem komponentams.

PCR ir qPCR

PCR reakcijoms paprastai reikia 1-10 ng šablono DNR optimaliam amplifikavimui. Per mažai DNR gali sukelti amplifikacijos nesėkmę, o per daug gali slopinti reakciją. Kiekybinei PCR (qPCR) netgi reikalingas tikslesnis DNR kiekybinių matavimų užtikrinimas, kad būtų užtikrinti tikslūs standartiniai kreivės ir patikimi kiekybiniai rezultatai.

Naujos Kartos Sekvenavimas (NGS)

NGS bibliotekos paruošimo protokolai nurodo tikslius DNR įvesties kiekius, dažnai nuo 1 iki 500 ng, priklausomai nuo platformos ir programos. Tikslios koncentracijos matavimas yra būtinas sėkmingam bibliotekos paruošimui ir subalansuotam mėginių atvaizdavimui daugiakanalėse sekvenavimo sesijose.

Transfekcijos Eksperimentai

Įvedant DNR į eukariotines ląsteles, optimalus DNR kiekis skiriasi priklausomai nuo ląstelių tipo ir transfekcijos metodo. Paprastai naudojama 0.5-5 μg plazmidinės DNR vienam 6 gerai plokštelės formate, reikalaujant tikslių koncentracijos matavimų, kad būtų standartizuoti eksperimentai.

Teismo DNR Analizė

Teismuose DNR mėginiai dažnai yra riboti ir brangūs. Tiksli kiekybė leidžia teismo ekspertams nustatyti, ar pakankamai DNR yra profiliavimui ir standartizuoti DNR kiekį tolesnėms analizėms.

Restrikcinių Enzimų Virškinimas

Restrikciniai fermentai turi specifinius veiklos vienetus, apibrėžtus per μg DNR. Žinant tikslią DNR koncentraciją, galima užtikrinti tinkamus fermento ir DNR santikius, užtikrinant visišką virškinimą be „žvaigždžių“ aktyvumo (nespecifinio pjovimo).

Alternatyvos Spektrofotometriniam Matavimui

Nors UV spektrofotometrija yra dažniausiai naudojama DNR kiekybinių matavimų metodika, egzistuoja keletas alternatyvų:

1. Fluorometriniai Metodai:

   • Fluorescenciniai dažai, tokie kaip PicoGreen, Qubit ir SYBR Green, konkrečiai jungiasi su dviguba grandine DNR
   • Didesnė jautrumas nei spektrofotometrija (gali aptikti net 25 pg/mL)
   • Mažiau paveikti užteršimo, pavyzdžiui, baltymų, RNR ar laisvų nukleotidų
   • Reikalauja fluorometro ir specifinių reagentų

2. Agarozės Gelio Elektroferezė:

   • DNR gali būti kiekybiškai įvertinta, palyginus juostos intensyvumą su žinomų koncentracijų standartais
   • Teikia informaciją apie DNR dydį ir vientisumą vienu metu
   • Mažiau tikslūs nei spektrofotometriniai ar fluorometriniai metodai
   • Laiko reikalaujantis, bet naudingas vizualiniam patvirtinimui

3. Real-Time PCR:

   • Labai jautrus metodas specifinėms DNR sekos kiekybėms nustatyti
   • Gali aptikti ekstremaliai mažas koncentracijas (iki kelių kopijų)
   • Reikalauja specifinių primerių ir sudėtingesnės įrangos
   • Naudojamas, kai reikia kiekybiškai įvertinti specifines sekas

4. Skaitmeninė PCR:

   • Absoliutus kiekybinių matavimų be standartinių kreivių
   • Ypač tikslus retų tikslų atžvilgiu
   • Brangus ir reikalauja specializuotos įrangos
   • Naudojamas retų mutacijų aptikimui ir kopijų skaičiaus variacijų analizei

DNR Koncentracijos Matavimo Istorija

Galimybė tiksliai matuoti DNR koncentraciją žymiai išsivystė kartu su molekulinės biologijos pažanga:

Ankstyvieji Metodai (1950-1960)

Po DNR struktūros atradimo, kurį atliko Watsonas ir Crickas 1953 m., mokslininkai pradėjo kurti metodus DNR izoliavimui ir kiekybiniam įvertinimui. Ankstyvieji metodai remiasi kolorimetriniais bandymais, tokiais kaip diphenylamine reakcija, kuri sukelia mėlyną spalvą, kai reaguoja su deoksiriboze DNR. Šie metodai buvo palyginti nejautrūs ir linkę į trikdžius.

Spektrofotometrinė Era (1970)

UV spektrofotometrijos taikymas nukleorūgščių kiekybiniam įvertinimui tapo plačiai paplitęs 1970-aisiais. Mokslininkai atrado, kad DNR sugeria UV šviesą su maksimumu 260 nm, ir kad santykis tarp sugerties ir koncentracijos yra linijinis tam tikrame diapazone. Standartinis konversijos koeficientas 50 ng/μL dvigubai grandinei DNR A260 = 1.0 buvo nustatytas šiuo laikotarpiu.

Fluorometrinė Revoliucija (1980-1990)

DNR specifinių fluorescencinių dažų plėtra 1980-aisiais ir 1990-aisiais revoliucionavo DNR kiekybinius matavimus, ypač skiedžiamiems mėginiams. Hoechst dažai ir vėliau PicoGreen leido daug jautriau aptikti nei buvo galima su spektrofotometrija. Šie metodai tapo ypač svarbūs su PCR atsiradimu, kuris dažnai reikalavo tikslių mažų DNR kiekių matavimų.

Šiuolaikinė Era (2000-Present)

Mikro tūrio spektrofotometrų, tokių kaip NanoDrop, pristatymas ankstyvaisiais 2000-aisiais transformavo kasdienius DNR kiekybinius matavimus, reikalaujant tik 0.5-2 μL mėginio. Ši technologija pašalino poreikį atlikti praskiedimus ir naudoti cuvettes, padarydama procesą greitesnį ir patogesnį.

Šiandien pažangūs metodai, tokie kaip skaitmeninė PCR ir naujos kartos sekvenavimas, dar labiau stumia DNR kiekybinių matavimų ribas, leidžiant absoliučiai kiekybiškai įvertinti specifines sekas ir vieno molekulės aptikimą. Tačiau pagrindinis spektrofotometrinis principas, nustatytas prieš dešimtmečius, išlieka kasdienio DNR koncentracijos matavimo pagrindu laboratorijose visame pasaulyje.

Praktiniai Pavyzdžiai

Pažvelkime į keletą praktinių DNR koncentracijos skaičiavimo pavyzdžių:

Pavyzdys 1: Standartinis Plazmidės Paruošimas

Tyrėjas išvalė plazmidę ir gavo šiuos matavimus:

• A260 rodmuo: 0.75
• Praskiedimas: 1:10 (praskiedimo koeficientas = 10)
• DNR tirpalo tūris: 50 μL

Apskaičiavimas:

• Koncentracija = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• Bendra DNR = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

Pavyzdys 2: Genominės DNR Ekstrakcija

Po genominės DNR ekstrakcijos iš kraujo:

• A260 rodmuo: 0.15
• Be praskiedimo (praskiedimo koeficientas = 1)
• DNR tirpalo tūris: 200 μL

Apskaičiavimas:

• Koncentracija = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• Bendra DNR = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

Pavyzdys 3: DNR Ruošimas Sekvenavimui

Sekvenavimo protokolas reikalauja tiksliai 500 ng DNR:

• DNR koncentracija: 125 ng/μL
• Reikalingas kiekis: 500 ng

Reikalingas tūris = 500 ÷ 125 = 4 μL DNR tirpalo

Kodo Pavyzdžiai

Štai pavyzdžiai, kaip apskaičiuoti DNR koncentraciją įvairiose programavimo kalbose:

1' Excel formulė DNR koncentracijai
2=A260*50*PraskiedimoKoeficientas
3
4' Excel formulė bendrai DNR kiekiui μg
5=(A260*50*PraskiedimoKoeficientas*Tūris)/1000
6
7' Pavyzdys ląstelėje su A260=0.5, PraskiedimoKoeficientas=2, Tūris=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Rezultatas: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Apskaičiuoti DNR koncentraciją ng/μL
4    
5    Parametrai:
6    absorbance (float): Sugerties rodmuo 260 nm
7    dilution_factor (float): Mėginio praskiedimo koeficientas
8    
9    Grąžina:
10    float: DNR koncentracija ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Apskaičiuoti bendrą DNR kiekį μg
17    
18    Parametrai:
19    concentration (float): DNR koncentracija ng/μL
20    volume_ul (float): DNR tirpalo tūris μL
21    
22    Grąžina:
23    float: Bendra DNR kiekis μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Pavyzdžio naudojimas
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNR Koncentracija: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Bendra DNR: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Grąžina DNR koncentraciją ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Grąžina bendrą DNR kiekį μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Pavyzdžio naudojimas
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNR Koncentracija: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Bendra DNR: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Apskaičiuoti DNR koncentraciją ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance Sugerties rodmuo 260 nm
6     * @param dilutionFactor Mėginio praskiedimo koeficientas
7     * @return DNR koncentracija ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Apskaičiuoti bendrą DNR kiekį μg
15     * 
16     * @param concentration DNR koncentracija ng/μL
17     * @param volumeUL DNR tirpalo tūris μL
18     * @return Bendra DNR kiekis μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNR Koncentracija: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Bendra DNR: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# R funkcija DNR koncentracijos apskaičiavimui
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Grąžina DNR koncentraciją ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Grąžina bendrą DNR kiekį μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Pavyzdžio naudojimas
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNR Koncentracija: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Bendra DNR: %.2f μg\n", total_dna))
23

Dažnai Užduodami Klausimai

Koks yra skirtumas tarp DNR koncentracijos ir DNR grynumo?

DNR koncentracija reiškia DNR kiekį tirpale, paprastai matuojamą ng/μL arba μg/mL. Tai pasako, kiek DNR turite, bet neparodo jos kokybės. DNR grynumas vertina užterštumo buvimą jūsų DNR mėginyje, paprastai matuojamas sugerties santykiais, tokiais kaip A260/A280 (baltymų užterštumas) ir A260/A230 (organinių junginių užterštumas). Gryna DNR paprastai turi A260/A280 santykį apie ~1.8 ir A260/A230 santykį 2.0-2.2.

Kodėl konversijos koeficientas skiriasi DNR, RNR ir baltymams?

Konversijos koeficientai skiriasi, nes kiekvienas biomolekulė turi unikalų išsklaidymo koeficientą (sugerties gebėjimą), priklausomai nuo jų cheminės sudėties. Dvigubai grandinė DNR turi konversijos koeficientą 50 ng/μL A260=1.0, tuo tarpu viengubai grandinei DNR koeficientas yra 33 ng/μL, RNR - 40 ng/μL, o baltymams (matuojamiems 280 nm) skiriasi, bet vidutiniškai yra apie 1 mg/mL A280=1.0. Šie skirtumai kyla iš skirtingų nukleotidų ar aminorūgščių sudėčių ir jų sugerties savybių.

Kiek tikslūs yra spektrofotometriniai DNR kiekybiniai matavimai?

Spektrofotometriniai DNR kiekybiniai matavimai paprastai yra tikslūs tam tikrame linijiniame diapazone (paprastai A260 tarp 0.1 ir 1.0), su ±3-5% tikslumu. Tačiau tikslumas mažėja labai mažose koncentracijose (žemiau 5 ng/μL) ir gali būti paveiktas užterštumo, pavyzdžiui, baltymų, RNR, laisvų nukleotidų ar tam tikrų buferių. Dėl labai tikslių matavimų skiedžiamuose mėginiuose arba kai reikalingas aukštas grynumas, rekomenduojama naudoti fluorometrinius metodus, tokius kaip Qubit arba PicoGreen, kurie yra labiau specifiniai dvigubai grandinei DNR.

Kaip interpretuoti A260/A280 santykį?

A260/A280 santykis rodo jūsų DNR mėginio grynumą, susijusį su baltymų užterštumu:

• Santykis apie ~1.8 paprastai laikomas „grynu“ DNR
• Santykiai žemiau 1.8 rodo baltymų užterštumą
• Santykiai virš 2.0 gali rodyti RNR užterštumą
• Tirpalo pH ir jonų stiprumas taip pat gali paveikti šį santykį

Nors tai naudinga kaip kokybės patikra, A260/A280 santykis negarantuoja funkcinės DNR, nes kiti užteršimai ar DNR degradacija gali neturėti įtakos šiam santykiui.

Ar galiu matuoti DNR koncentraciją spalvotuose tirpaluose?

Matuojant DNR koncentraciją spalvotuose tirpaluose naudojant spektrofotometriją gali būti sudėtinga, nes spalva gali sugerti 260 nm arba netoli jo, trukdydama DNR matavimui. Tokiais atvejais:

1. Atlikite bangos ilgio skenavimą (220-320 nm), kad patikrintumėte neįprastas sugerties tendencijas
2. Naudokite fluorometrinį metodą, pvz., Qubit, kuris mažiau paveiktas mėginio spalvos
3. Papildomai išvalykite DNR, kad pašalintumėte spalvotus junginius
4. Taikykite matematinį pataisymą, jei trukdančio junginio sugerties spektras yra žinomas

Koks yra minimalus tūris, reikalingas DNR koncentracijos matavimui?

Minimalus tūris priklauso nuo naudojamo prietaiso:

• Tradiciniai spektrofotometrai su cuvettes paprastai reikalauja 50-100 μL
• Mikro tūrio spektrofotometrai, tokie kaip NanoDrop, reikalauja tik 0.5-2 μL
• Fluorometriniai metodai paprastai reikalauja 1-20 μL mėginio plius reagentų tūrį
• Mikroplokštelių skaitytuvai paprastai naudoja 100-200 μL vienam gerai

Mikro tūrio spektrofotometrai revoliucionavo DNR kiekybinius matavimus, leidžiant matuoti brangius mėginius su minimaliais tūrio reikalavimais.

Kaip apskaičiuoti praskiedimo koeficientą?

Praskiedimo koeficientas apskaičiuojamas taip:

$\text{Praskiedimo Koeficientas} = \frac{\text{Bendras Tūris (Mėginys + Praskiediklis)}}{\text{Mėginio Tūris}}$

Pavyzdžiui:

• Jei į 99 μL buferio pridedate 1 μL DNR, praskiedimo koeficientas yra 100
• Jei į 45 μL buferio pridedate 5 μL DNR, praskiedimo koeficientas yra 10
• Jei naudojate nepraskiestą DNR, praskiedimo koeficientas yra 1

Visada naudokite tą patį buferį praskiedimui, kaip buvo naudojama spektrofotometro tuščiame matavime.

Kaip konvertuoti tarp skirtingų koncentracijos vienetų?

Įprasti DNR koncentracijos vienetų konvertavimai:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM 1000 bp DNR fragmentui ≈ 660 ng/μL

Norint konvertuoti iš masės koncentracijos (ng/μL) į molinę koncentraciją (nM) DNR fragmentui:

$\text{Koncentracija (nM)} = \frac{\text{Koncentracija (ng/μL)} \times 10^6}{\text{DNR ilgis (bp)} \times 660}$

Kas gali sukelti netikslius DNR koncentracijos matavimus?

Keletas veiksnių gali sukelti netikslius DNR koncentracijos matavimus:

1. Užterštumas: Baltymai, fenolis, guanidinas ar kiti ekstrakcijos reagentai gali paveikti sugertį
2. Burbulai: Oro burbuliukai šviesos kelyje gali sukelti klaidingus rodmenis
3. DNR degradacija: Fragmentuota DNR gali turėti pakitusius sugerties savybes
4. Netinkamas tuščių matavimas: Naudojant kitokį buferį tuščiam matavimui nei tas, kuris buvo naudojamas DNR ištirpinimui
5. Nehomogeniškas tirpalas: Nepakankamai sumaišyti DNR tirpalai duoda nesuderinamus rodmenis
6. Priemonės kalibravimas: Neįkalibruoti ar nešvarūs spektrofotometrai gamina nepatikimus rezultatus
7. Matavimai už linijinio diapazono: Labai dideli arba labai maži sugerties rodmenys gali būti netikslūs

Ar galiu naudoti šią skaičiuoklę RNR koncentracijai?

Nors ši skaičiuoklė optimizuota dvigubai grandinei DNR (naudojant 50 ng/μL konversijos koeficientą), galite ją pritaikyti RNR, kad:

1. Išmatuotumėte A260 kaip įprasta
2. Dauginkite iš 40 vietoj 50 (RNR specifinis konversijos koeficientas)
3. Taikykite tinkamą praskiedimo koeficientą

RNR formulė būtų: $\text{RNR Koncentracija (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Praskiedimo Koeficientas}$

Nuorodos

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Nukleorūgščių kiekybinių matavimų su sugertimi ir fluorescencija. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molekulinis klonavimas: laboratorinis vadovas (3-asis leidimas). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). DNR ir RNR grynumo vertė, stebima 260 nm/280 nm sugerties santykiais. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Poveikis pH ir jonų stiprumui nukleorūgščių grynumo spektrofotometriniams vertinimams. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop mikro tūrio nukleorūgščių kiekybinių matavimų metodika. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). DNR kiekybinių matavimų klaidos naudojant DNR jungiančius fluorescencinius dažus ir pasiūlyti sprendimai. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Nukleorūgščių grynumo vertinimas. T042-Techninis Pranešimas.

8. Huberman, J. A. (1995). DNR sugerties matavimo svarba 240 nm taip pat kaip ir 260 ir 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Enolazės izoliavimas ir kristalizavimas. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Nukleorūgščių grynumo stebėjimas naudojant 260 nm/280 nm sugerties santykius. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Pasiruošę apskaičiuoti savo DNR koncentraciją? Naudokite mūsų skaičiuoklę aukščiau, kad gautumėte tikslius rezultatus iš karto. Tiesiog įveskite savo sugerties rodmenį, tūrį ir praskiedimo koeficientą, kad nustatytumėte tiek koncentraciją, tiek bendrą DNR kiekį jūsų mėginyje.