Калибратор за Лигиране на ДНК

Въведение

Лигирането на ДНК е критична техника в молекулярната биология, използвана за свързване на ДНК фрагменти заедно с ковалентни връзки. Калибраторът за Лигиране на ДНК е основен инструмент за изследователи, който помага да се определи оптималното количество векторна и вмъкната ДНК, необходимо за успешни реакции на лигиране. Чрез изчисляване на правилните моларни съотношения между векторната (плазмидна) и вмъкнатата ДНК фрагменти, този калибратор осигурява ефективни експерименти по молекулярно клониране, като същевременно минимизира загубата на реагенти и неуспешни реакции.

Реакциите на лигиране са основополагаещи за генетичното инженерство, синтетичната биология и процедурите по молекулярно клониране. Те позволяват на учените да създават рекомбинантни ДНК молекули, като вмъкват гени от интерес в плазмидни вектори за последваща трансформация в гостоприемни организми. Успехът на тези реакции зависи в голяма степен от използването на подходящи количества ДНК компоненти, което точно определя този калибратор.

Независимо дали изграждате експресионни вектори, създавате библиотеки от гени или извършвате рутинно субклиниране, този калибратор за лигиране на ДНК ще ви помогне да оптимизирате експерименталните условия и да увеличите процента на успех. Чрез въвеждане на няколко ключови параметъра за вашите ДНК проби, можете бързо да получите точните обеми, необходими за вашата специфична реакция на лигиране.

Формула/Изчисление

Калибраторът за лигиране на ДНК използва основна формула от молекулярната биология, която отчита различните размери и концентрации на ДНК фрагментите, които се свързват. Основното изчисление определя колко много вмъкната ДНК е необходима относително на векторната ДНК, базирано на техните съответни дължини и желаното моларно съотношение.

Изчисление на количеството вмъкната ДНК

Количество вмъкната ДНК, необходимо (в нанограми), се изчислява с помощта на следната формула:

$\text{ng на вмъкната} = \text{ng на вектора} \times \frac{\text{kb размер на вмъкната}}{\text{kb размер на вектора}} \times \text{моларно съотношение}$

Където:

• ng на вектора = количество векторна ДНК, използвано в реакцията (обикновено 50-100 ng)
• kb размер на вмъкната = дължина на вмъкнатия ДНК фрагмент в килобази (kb)
• kb размер на вектора = дължина на векторната ДНК в килобази (kb)
• моларно съотношение = желаното съотношение на вмъкнати молекули към векторни молекули (обикновено 3:1 до 5:1)

Обемни изчисления

След като се определи необходимото количество вмъкната ДНК, се изчисляват необходимите обеми за реакцията:

$\text{Обем на вектора (μL)} = \frac{\text{ng на вектора}}{\text{концентрация на вектора (ng/μL)}}$

$\text{Обем на вмъкнатата (μL)} = \frac{\text{ng на вмъкнатата}}{\text{концентрация на вмъкнатата (ng/μL)}}$

$\text{Обем на буфера/вода (μL)} = \text{Общ обем на реакцията (μL)} - \text{Обем на вектора (μL)} - \text{Обем на вмъкнатата (μL)}$

Примерно изчисление

Нека преминем през практически пример:

• Концентрация на вектора: 50 ng/μL
• Дължина на вектора: 3000 bp (3 kb)
• Концентрация на вмъкнатата: 25 ng/μL
• Дължина на вмъкнатата: 1000 bp (1 kb)
• Желано моларно съотношение (вмъкната:вектор): 3:1
• Общ обем на реакцията: 20 μL
• Количество вектор за използване: 50 ng

Стъпка 1: Изчислете необходимото количество вмъкната $\text{ng на вмъкнатата} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Стъпка 2: Изчислете обемите $\text{Обем на вектора} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Обем на вмъкнатата} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Обем на буфера/вода} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Това изчисление осигурява, че в реакцията има три молекули вмъкната за всяка молекула вектор, оптимизирайки шансовете за успешно лигиране.

Стъпка по стъпка ръководство за използване на калибратора

Нашият калибратор за лигиране на ДНК е проектиран да бъде интуитивен и лесен за използване. Следвайте тези стъпки, за да изчислите оптималните обеми за вашата реакция на лигиране:

1. Въведете информация за вектора:

   • Въведете концентрацията на вашата векторна ДНК в ng/μL
   • Въведете дължината на векторната ДНК в базови двойки (bp)
   • Уточнете количеството векторна ДНК, което искате да използвате в реакцията (ng)

2. Въведете информация за вмъкнатата:

   • Въведете концентрацията на вашата вмъкната ДНК в ng/μL
   • Въведете дължината на вмъкнатата ДНК в базови двойки (bp)

3. Настройте параметрите на реакцията:

   • Уточнете желаното моларно съотношение (вмъкната:вектор) - обикновено между 3:1 и 5:1
   • Въведете общия обем на реакцията в μL (обикновено 10-20 μL)

4. Вижте резултатите:

   • Калибраторът автоматично ще покаже:
     • Необходим обем на вектора (μL)
     • Необходим обем на вмъкнатата (μL)
     • Обем на буфера/водата, който да добавите (μL)
     • Общ обем на реакцията (μL)
     • Количества на вектора и вмъкнатата ДНК в реакцията (ng)

5. Копирайте резултатите (по желание):

   • Използвайте бутона "Копиране на резултати", за да копирате всички изчисления в клипборда за вашия лабораторен дневник или протоколи

Калибраторът извършва проверки за валидност, за да осигури, че всички входни данни са положителни числа и че общият обем е достатъчен за необходимите ДНК обеми. Ако бъдат открити грешки, полезни съобщения за грешки ще ви насочат да коригирате входовете.

Приложения

Калибраторът за лигиране на ДНК е ценен в множество приложения в молекулярната биология:

Молекулярно клониране

Най-честият случай на използване е стандартното молекулярно клониране, където изследователите вмъкват гени или ДНК фрагменти в плазмидни вектори. Калибраторът осигурява оптимални условия за:

• Субклиниране на гени между различни експресионни вектори
• Създаване на фузионни протеини чрез свързване на множество генни фрагменти
• Изграждане на тестове с репортерни гени
• Създаване на библиотеки от плазмиди

Синтетична биология

В синтетичната биология, където често се сглобяват множество ДНК фрагменти:

• Реакциите на Gibson Assembly се възползват от прецизни съотношения на вмъкната:вектор
• Системите за Golden Gate assembly изискват специфични концентрации на ДНК
• BioBrick сглобяване на стандартизирани генетични части
• Изграждане на синтетични генетични вериги

Разработка на диагностични комплекти

При разработването на молекулярни диагностични инструменти:

• Клониране на генетични маркери, специфични за заболяване
• Създаване на плазмиди за положителен контрол
• Разработка на калибровъчни стандарти за qPCR

Системи за експресия на протеини

За изследователи, работещи по производството на протеини:

• Оптимизиране на съотношенията на вмъкната:вектор за вектори с висока копие
• Създаване на индуцирани експресионни системи
• Създаване на вектори за секреция за пречистване на протеини

Приложения на CRISPR-Cas9

В приложенията за редактиране на геноми:

• Клониране на ръководни РНК в CRISPR вектори
• Създаване на донорни шаблони за хомоложно насочено възстановяване
• Изграждане на библиотеки от ръководни РНК за скрининг

Предизвикателни лигирания

Калибраторът е особено ценен за предизвикателни сценарии на лигиране:

• Клониране на големи вмъкнати (>5 kb)
• Вмъквания на много малки фрагменти (<100 bp)
• Лигирания с тъпи краища, които имат по-ниска ефективност
• Реакции за сглобяване на много фрагменти

Алтернативи

Докато нашият калибратор за лигиране на ДНК предоставя прецизни изчисления за традиционни реакции на лигиране, съществуват няколко алтернативни подхода за свързване на ДНК фрагменти:

1. Gibson Assembly: Използва екзонуклеаза, полимераза и лигаза в една реакция, за да свърже припокриващи се ДНК фрагменти. Не са необходими традиционни изчисления за лигиране, но съотношенията на концентрацията все още са важни.

2. Golden Gate Assembly: Използва тип IIS рестрикционни ензими за посочено, без белег свързване на множество фрагменти. Изисква еквимоларни количества от всички фрагменти.

3. SLIC (Сливане и независимо клониране): Използва екзонуклеаза за създаване на единични нишкови надвеси, които се свързват помежду си. Обикновено използва еквимоларни съотношения на фрагменти.

4. In-Fusion Cloning: Търговска система, която позволява свързването на фрагменти с 15 bp припокрития. Използва специфично съотношение, основано на размерите на фрагментите.

5. Gateway Cloning: Използва специфична рекомбинация вместо лигиране. Изисква специфични входни и дестинационни вектори.

6. Емпирично тестване: Някои лаборатории предпочитат да настроят множество реакции на лигиране с различни съотношения на вмъкната:вектор (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) и да определят кое работи най-добре за техните специфични конструкции.

7. Софтуерни калкулатори: Търговски софтуерни пакети като Vector NTI и SnapGene включват калкулатори за лигиране с допълнителни функции като анализ на рестрикционни сайтове.

История

Развитието на изчисленията за лигиране на ДНК съпровожда еволюцията на техниките за молекулярно клониране, които революционизираха молекулярната биология и биотехнологиите.

Ранни разработки (1970-те)

Концепцията за лигиране на ДНК за молекулярно клониране се появи в началото на 1970-те с пионерската работа на Пол Берг, Хербърт Бойер и Стенли Коен, които разработиха първите рекомбинантни ДНК молекули. През този период реакциите на лигиране бяха предимно емпирични, като изследователите използваха проби и грешки, за да определят оптималните условия.

Откритията на рестрикционни ензими и ДНК лигаза предоставиха основните инструменти за рязане и повторно свързване на ДНК молекули. Т4 ДНК лигаза, изолирана от T4 бактериофаг, инфектираща E. coli, стана стандартен ензим за свързване на ДНК фрагменти поради способността си да лигира както тъпи, така и свързани краища.

Период на усъвършенстване (1980-1990)

Със ставането на молекулярното клониране по-рутинно, изследователите започнаха да разработват по-систематични подходи към реакциите на лигиране. Важността на моларните съотношения между векторната и вмъкнатата ДНК стана очевидна, което доведе до разработването на основната формула, която все още се използва днес.

През този период изследователите установиха, че излишната вмъкната ДНК (обикновено 3:1 до 5:1 моларно съотношение на вмъкната към вектор) обикновено подобрява ефективността на лигирането за стандартни приложения на клониране. Тази информация първоначално беше споделена чрез лабораторни протоколи и постепенно стигна до ръководства и учебници по молекулярна биология.

Съвременна ера (2000-до момента)

Появата на компютърни инструменти и онлайн калкулатори през 2000-те направи прецизните изчисления за лигиране по-достъпни за изследователите. С развитието на молекулярните биологични техники, необходимостта от точни изчисления стана по-критична, особено за предизвикателни проекти по клониране, включващи множество фрагменти или големи вмъквания.

Днес изчисленията за лигиране на ДНК са неразделна част от работните потоци по молекулярно клониране, като специализирани калибратори като този помагат на изследователите да оптимизират експериментите си. Основната формула остава почти непроменена, въпреки че разбирането ни за факторите, влияещи на ефективността на лигирането, се е подобрило.

Появата на алтернативни методи за клониране като Gibson Assembly и Golden Gate клониране е въвела нови нужди от изчисления, но основната концепция за моларни съотношения между ДНК фрагменти остава важна и в тези техники.

Примери за код

Ето реализации на калибратора за лигиране на ДНК на различни програмни езици:

1' Excel VBA Функция за Калибратор за Лигиране на ДНК
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Изчислява необходимото количество вмъкната ДНК в ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Изчислява обема на вектора в μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Изчислява обема на вмъкнатата в μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Изчислява обема на буфера/водата в μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Пример за използване в клетка:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Изчислете обемите за реакция на лигиране на ДНК.
5    
6    Параметри:
7    vector_concentration (float): Концентрация на векторната ДНК в ng/μL
8    vector_length (float): Дължина на векторната ДНК в базови двойки
9    insert_concentration (float): Концентрация на вмъкнатата ДНК в ng/μL
10    insert_length (float): Дължина на вмъкнатата ДНК в базови двойки
11    molar_ratio (float): Желано моларно съотношение на вмъкната:вектор
12    total_volume (float): Общ обем на реакцията в μL
13    vector_amount (float): Количество векторна ДНК за използване в ng (по подразбиране: 50)
14    
15    Връща:
16    dict: Речник, съдържащ изчислените обеми и количества
17    """
18    # Изчислете обема на вектора
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Изчислете необходимото количество вмъкната
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Изчислете обема на вмъкнатата
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Изчислете обема на буфера/водата
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Пример за използване
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Вектор: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Вмъкната: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Буфер: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Общо: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Преобразувайте дължините в kb за изчисление
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Изчислете необходимото количество вмъкната
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Изчислете обемите
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Пример за използване
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Вектор: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Вмъкната: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Буфер: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Общо: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Преобразувайте дължините в kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Изчислете необходимото количество вмъкната
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Изчислете обемите
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Закръглете до 2 десетични знака
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Вектор: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Вмъкната: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Буфер: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Общо: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Преобразувайте дължините в kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Изчислете необходимото количество вмъкната
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Изчислете обемите
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Закръглете до 2 десетични знака
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Вектор: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Вмъкната: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Буфер: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Общо: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Често задавани въпроси (ЧЗВ)

Какво е оптималното моларно съотношение за лигиране на ДНК?

Оптималното моларно съотношение на вмъкната към вектор обикновено варира от 3:1 до 5:1 за стандартни приложения на клониране. Въпреки това, това може да варира в зависимост от конкретния сценарий на лигиране:

• За лигирания с тъпи краища: 3:1 до 5:1
• За лигирания с свързани краища: 1:1 до 3:1
• За големи вмъквания (>10 kb): 1:1 до 2:1
• За малки вмъквания (<500 bp): 5:1 до 10:1
• За сглобяване на много фрагменти: 3:1 за всеки вмъкнат към вектор

Защо моята реакция на лигиране не успява, въпреки че използвам изчислените обеми?

Няколко фактора могат да повлияят на ефективността на лигирането извън моларното съотношение:

1. Качество на ДНК: Уверете се, че и векторът, и вмъкнатата имат чисти краища без повреди
2. Дефосфорилиране: Проверете дали вашият вектор е дефосфорилиран, което предотвратява само лигирането
3. Активност на ензима: Проверете дали вашата лигаза е активна и използвана при правилната температура
4. Време на инкубация: Някои лигиранета се възползват от по-дълга инкубация (през нощта при 16°C)
5. Условия на буфера: Уверете се, че се използва правилен буфер с ATP
6. Замърсители: Пречистете ДНК, за да премахнете инхибитори като EDTA или високи соли

Колко много векторна ДНК трябва да използвам в реакция на лигиране?

Обикновено се препоръчва 50-100 ng векторна ДНК за стандартни реакции на лигиране. Използването на твърде много вектор може да доведе до по-висок фон на неконструирани или само лигирани вектори, докато твърде малко може да намали ефективността на трансформацията. За предизвикателни лигиранета, може да се наложи да оптимизирате това количество.

Трябва ли да коригирам изчисленията си за лигирания с тъпи краища спрямо лигирания с свързани краища?

Да. Лигирането с тъпи краища обикновено е по-малко ефективно от лигирането с свързани краища. За лигирането с тъпи краища използвайте:

• По-високи моларни съотношения (3:1 до 5:1 или дори по-високи)
• Повече Т4 ДНК лигаза (обикновено 2-3 пъти повече)
• По-дълги времена на инкубация
• Помислете за добавяне на PEG, за да увеличите ефективността на лигирането

Как да изчисля лигиране за множество вмъквания?

За сглобяване на множество фрагменти:

1. Изчислете всяко количество вмъкната индивидуално, използвайки същата формула
2. Поддържайте същото общо моларно съотношение (например, за два вмъкнати, използвайте 1.5:1.5:1 вмъкната1:вмъкната2:вектор)
3. Коригирайте общия обем на реакцията, за да поберете всички ДНК фрагменти
4. Помислете за последователно лигиране или използване на методи за сглобяване като Gibson Assembly за множество фрагменти

Мога ли да използвам този калибратор за Gibson Assembly или Golden Gate Assembly?

Този калибратор е специално проектиран за традиционно клониране с рестрикционни ензими и лигаза. За Gibson Assembly, обикновено се препоръчват еквимоларни количества от всички фрагменти (1:1), въпреки че основното изчисление на количеството ДНК на база дължина е подобно. За Golden Gate Assembly, също се използват еквимоларни съотношения на всички компоненти.

Как да взема предвид дефосфорилирането на вектора в изчисленията си?

Дефосфорилирането на вектора (премахване на 5' фосфатни групи) предотвратява само лигирането, но не променя изчисленията за количествата. Въпреки това, за дефосфорилирани вектори:

1. Използвайте свежа вмъкната ДНК с непокътнати 5' фосфати
2. Помислете за използване на леко по-високи съотношения на вмъкната:вектор (4:1 до 6:1)
3. Уверете се, че времето за лигиране е по-дълго (поне 1 час при стайна температура или през нощта при 16°C)

Какъв е минималният общ обем на реакцията, който трябва да използвам?

Минималният практически обем на реакцията обикновено е 10 μL, което позволява адекватно смесване и предотвратява проблеми с изпарението. Ако вашите изчислени обеми на ДНК надвишават желаното количество, имате няколко опции:

1. Използвайте по-концентрирани ДНК проби
2. Намалете количеството на вектора, което използвате (например, 25 ng вместо 50 ng)
3. Увеличете общия обем на реакцията
4. Помислете за концентриране на вашите ДНК проби

Колко време трябва да инкубирам реакцията на лигиране?

Оптималните времена на инкубация варират в зависимост от типа на лигирането:

• Лигирането с свързани краища: 1 час при стайна температура (22-25°C) или 4-16 часа при 16°C
• Лигирането с тъпи краища: 2-4 часа при стайна температура или през нощта (12-16 часа) при 16°C
• Бързи лигиранета (използвайки висока концентрация на лигаза): 5-15 минути при стайна температура

Мога ли да повторно използвам остатъка от реакцията на лигиране за трансформация?

Да, смесите от лигирането обикновено могат да се съхраняват при -20°C и да се повторно използват за трансформация. Въпреки това, всяко замразяване-размразяване може да намали ефективността. За най-добри резултати:

1. Разделете сместа за лигиране преди замразяване
2. Загрейте, за да инактивирате лигазата (65°C за 10 минути) преди съхранение
3. Използвайте в рамките на 1-2 месеца за оптимални резултати

Референции

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/