DNAリガーゼ計算機

はじめに

DNAリガーゼは、DNA断片を共有結合で結合するために使用される重要な分子生物学的技術です。 DNAリガーゼ計算機は、研究者にとって不可欠なツールであり、成功したリガーション反応に必要なベクターとインサートDNAの最適な量を決定するのに役立ちます。この計算機は、ベクター（プラスミド）とインサートDNA断片の間の正確なモル比を計算することにより、効率的な分子クローニング実験を保証し、試薬の無駄や失敗した反応を最小限に抑えます。

リガーション反応は、遺伝子工学、合成生物学、分子クローニング手順の基本です。これにより、科学者は遺伝子の挿入を行い、プラスミドベクターに挿入して、宿主生物に変換することができます。これらの反応の成功は、DNA成分の適切な量を使用することに大きく依存しており、まさにこの計算機がその決定を助けます。

発現ベクターの構築、遺伝子ライブラリの作成、またはルーチンのサブクローニングを行っている場合でも、このDNAリガーゼ計算機は実験条件を最適化し、成功率を高めるのに役立ちます。DNAサンプルに関するいくつかの重要なパラメータを入力することで、特定のリガーション反応に必要な正確な体積を迅速に取得できます。

数式/計算

DNAリガーゼ計算機は、結合されるDNA断片の異なるサイズと濃度を考慮した基本的な分子生物学の公式を使用します。主な計算は、ベクターDNAに対するインサートDNAの必要量を、各々の長さと望ましいモル比に基づいて決定します。

インサート量の計算

必要なインサートDNAの量（ナノグラム単位）は、次の公式を使用して計算されます：

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

ここで：

• ng of vector = 反応に使用されるベクターDNAの量（通常50-100 ng）
• kb size of insert = インサートDNA断片の長さ（キロベース単位）
• kb size of vector = ベクターDNAの長さ（キロベース単位）
• molar ratio = インサート分子とベクター分子の望ましい比率（通常3:1から5:1）

体積計算

必要なインサートDNAの量が決定されたら、反応に必要な体積が計算されます：

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

例計算

実際の例を通して計算してみましょう：

• ベクター濃度：50 ng/μL
• ベクターの長さ：3000 bp（3 kb）
• インサート濃度：25 ng/μL
• インサートの長さ：1000 bp（1 kb）
• 望ましいモル比（インサート：ベクター）：3:1
• 総反応体積：20 μL
• 使用するベクターの量：50 ng

ステップ1：必要なインサート量を計算します $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

ステップ2：体積を計算します $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

この計算により、反応中にベクター分子ごとに3つのインサート分子が存在することが保証され、リガーションの成功の可能性が最適化されます。

計算機の使用手順ガイド

私たちのDNAリガーゼ計算機は、直感的で簡単に使用できるように設計されています。以下の手順に従って、リガーション反応の最適な体積を計算してください：

1. ベクター情報を入力：

   • ベクターDNAの濃度をng/μL単位で入力します
   • ベクターの長さを塩基対（bp）単位で入力します
   • 反応に使用したいベクターDNAの量をng単位で指定します

2. インサート情報を入力：

   • インサートDNAの濃度をng/μL単位で入力します
   • インサートの長さを塩基対（bp）単位で入力します

3. 反応パラメータを設定：

   • 望ましいモル比（インサート：ベクター）を指定します - 通常は3:1から5:1の範囲です
   • 総反応体積をμL単位で入力します（通常は10-20 μL）

4. 結果を表示：

   • 計算機は自動的に表示します：
     • 必要なベクター体積（μL）
     • 必要なインサート体積（μL）
     • 加えるべきバッファ/水の体積（μL）
     • 総反応体積（μL）
     • 反応中のベクターおよびインサートDNAの量（ng）

5. 結果をコピー（オプション）：

   • 「結果をコピー」ボタンを使用して、すべての計算をクリップボードにコピーし、ラボノートやプロトコルに貼り付けます

計算機は、すべての入力が正の数であること、および総体積が必要なDNA体積に対して十分であることを確認するための検証チェックを行います。エラーが検出された場合は、入力を修正するための役立つエラーメッセージが表示されます。

使用例

DNAリガーゼ計算機は、数多くの分子生物学的アプリケーションで価値があります：

分子クローニング

最も一般的な使用例は、標準的な分子クローニングであり、研究者は遺伝子やDNA断片をプラスミドベクターに挿入します。計算機は以下の最適な条件を保証します：

• 異なる発現ベクター間での遺伝子のサブクローニング
• 複数の遺伝子断片を結合して融合タンパク質を作成
• レポータ遺伝子アッセイの構築
• プラスミドライブラリの構築

合成生物学

合成生物学では、複数のDNA断片がしばしば組み合わされるため：

• ギブソンアセンブリ反応は、正確なインサート：ベクター比から恩恵を受けます
• ゴールデンゲートアセンブリシステムは、特定のDNA濃度を必要とします
• 標準化された遺伝子部品のバイオブリックアセンブリ
• 合成遺伝子回路の構築

診断キットの開発

分子診断ツールを開発する際には：

• 疾患特異的遺伝子マーカーのクローニング
• 陽性コントロールプラスミドの構築
• qPCRのためのキャリブレーションスタンダードの開発

タンパク質発現システム

タンパク質生産に取り組む研究者のために：

• 高コピー発現ベクターのためのインサート：ベクター比の最適化
• 誘導性発現システムの構築
• タンパク質精製のための分泌ベクターの作成

CRISPR-Cas9アプリケーション

ゲノム編集アプリケーションにおいて：

• CRISPRベクターへのガイドRNAのクローニング
• 相同修復のためのドナータンプレートの作成
• スクリーニング用のガイドRNAライブラリの構築

難しいリガーション

計算機は特に難しいリガーションシナリオにとって価値があります：

• 大きなインサートのクローニング（>5 kb）
• 非常に小さな断片の挿入（<100 bp）
• 効率が低い鈍端リガーション
• 複数断片のアセンブリ反応

代替手段

私たちのDNAリガーゼ計算機は、従来のリガーション反応のための正確な計算を提供しますが、DNA断片を結合するためのいくつかの代替アプローチも存在します：

1. ギブソンアセンブリ：重複したDNA断片を結合するために、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼを単一チューブ反応で使用します。従来のリガーション計算は必要ありませんが、濃度比は依然として重要です。

2. ゴールデンゲートアセンブリ：方向性のある、スカーなしの複数断片のアセンブリのためにタイプIIS制限酵素を使用します。すべての断片の等モル量が必要です。

3. SLIC（配列およびリガーション非依存クローニング）：エクソヌクレアーゼを使用して、相補的なオーバーハングを作成し、互いにアニーリングします。通常、断片の等モル比を使用します。

4. In-Fusionクローニング：オーバーラップのある断片を結合する商業システムです。断片サイズに基づく特定の比率を使用します。

5. ゲートウェイクローニング：リガーションの代わりに特異的な組換えを使用します。特定のエントリーおよびデスティネーションベクターが必要です。

6. 経験的テスト：いくつかのラボでは、異なるインサート：ベクター比（1:1、3:1、5:1、10:1）で複数のリガーション反応を設定し、最適なものを決定することを好みます。

7. ソフトウェア計算機：Vector NTIやSnapGeneのような商業ソフトウェアパッケージには、制限部位分析などの追加機能を持つリガーション計算機が含まれています。

歴史

DNAリガーゼ計算の開発は、分子クローニング技術の進化と平行しており、これは分子生物学とバイオテクノロジーを革命的に変えました。

初期の開発（1970年代）

分子クローニングのためのDNAリガーゼの概念は、1970年代初頭にポール・バーグ、ハーバート・ボイヤー、スタンリー・コーエンの先駆的な研究によって生まれました。彼らは最初の組換えDNA分子を開発しました。この期間、リガーション反応は主に経験的であり、研究者は最適な条件を決定するために試行錯誤を行っていました。

制限酵素とDNAリガーゼの発見は、DNA分子を切断し再結合するための基本的なツールを提供しました。T4 DNAリガーゼは、T4バクテリオファージに感染した大腸菌から単離され、鈍端およびコヒーシブエンドの両方のDNA断片をリガートする能力から、標準的な酵素となりました。

精緻化の時代（1980年代-1990年代）

分子クローニングがより一般的になるにつれて、研究者はリガーション反応に対するより体系的なアプローチを開発し始めました。ベクターとインサートDNAの間のモル比の重要性が明らかになり、今日でも使用されている基本的な公式の開発につながりました。

この期間中、研究者たちは、インサートDNAの過剰（通常3:1から5:1のモル比）が、標準的なクローニングアプリケーションのリガーション効率を一般的に改善することを確立しました。この知識は、最初はラボプロトコルを通じて共有され、徐々に分子生物学のマニュアルや教科書に取り入れられました。

現代の時代（2000年代-現在）

2000年代に計算ツールやオンライン計算機の出現により、正確なリガーション計算が研究者にとってよりアクセスしやすくなりました。分子生物学的技術がより洗練されるにつれて、正確な計算の必要性がより重要になり、特に複数の断片や大きなインサートを含む難しいクローニングプロジェクトにおいてその必要性が高まりました。

今日、DNAリガーゼ計算は分子クローニングのワークフローの不可欠な部分であり、このような専用の計算機が研究者の実験を最適化するのを助けています。基本的な公式はほとんど変更されていませんが、リガーション効率に影響を与える要因に対する理解は向上しています。

ギブソンアセンブリやゴールデンゲートクローニングのような代替クローニング方法の出現は、新しい計算ニーズを導入しましたが、DNA断片間のモル比の基本的な概念は、これらの技術全体で依然として重要です。

コード例

以下は、さまざまなプログラミング言語でのDNAリガーゼ計算機の実装です：

1' Excel VBA関数：DNAリガーゼ計算機
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' 必要なインサート量をng単位で計算
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' ベクター体積をμL単位で計算
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' インサート体積をμL単位で計算
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' バッファ/水の体積をμL単位で計算
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' セルでの使用例：
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    リガーション反応のための体積を計算します。
5    
6    パラメータ：
7    vector_concentration (float): ベクターDNAの濃度（ng/μL）
8    vector_length (float): ベクターDNAの長さ（塩基対）
9    insert_concentration (float): インサートDNAの濃度（ng/μL）
10    insert_length (float): インサートDNAの長さ（塩基対）
11    molar_ratio (float): インサート：ベクターの望ましいモル比
12    total_volume (float): 総反応体積（μL）
13    vector_amount (float): 使用するベクターDNAの量（ng）（デフォルト：50）
14    
15    戻り値：
16    dict: 計算された体積と量を含む辞書
17    """
18    # ベクター体積を計算
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # 必要なインサート量を計算
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # インサート体積を計算
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # バッファ/水の体積を計算
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# 使用例
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"ベクター: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"インサート: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"バッファ: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"合計: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // 計算のために長さをkbに変換
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // 必要なインサート量を計算
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // 体積を計算
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// 使用例
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`ベクター: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`インサート: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`バッファ: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`合計: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // 長さをkbに変換
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // 必要なインサート量を計算
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // 体積を計算
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // 小数点以下2桁に丸める
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("ベクター: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("インサート: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("バッファ: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("合計: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // 長さをkbに変換
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // 必要なインサート量を計算
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // 体積を計算
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // 小数点以下2桁に丸める
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "ベクター: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "インサート: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "バッファ: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "合計: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

よくある質問（FAQ）

DNAリガーゼの最適なモル比は何ですか？

インサートとベクターの最適なモル比は、通常、標準的なクローニングアプリケーションの場合、3:1から5:1の範囲です。ただし、これは特定のリガーションシナリオによって異なる場合があります：

• 鈍端リガーションの場合：3:1から5:1
• スティッキーエンドリガーションの場合：1:1から3:1
• 大きなインサート（>10 kb）の場合：1:1から2:1
• 小さなインサート（<500 bp）の場合：5:1から10:1
• 複数断片のアセンブリの場合：各インサートとベクターのために3:1

計算された体積を使用してもリガーション反応が失敗するのはなぜですか？

リガーション効率に影響を与える要因は、モル比を超えていくつかあります：

1. DNAの質：ベクターとインサートの両方が損傷のないクリーンなエンドを持っていることを確認してください
2. 脱リン酸化：ベクターが脱リン酸化されているか確認し、自己リガーションを防ぎます
3. 酵素活性：リガーゼが活性であり、正しい温度で使用されていることを確認してください
4. インキュベーション時間：一部のリガーションは、16°Cでの一晩のインキュベーションが有益です
5. バッファ条件：ATPを含む正しいバッファを使用してください
6. 汚染物質：EDTAや高塩濃度のような阻害剤を除去するためにDNAを精製してください

リガーション反応で使用するべきベクターDNAの量はどれくらいですか？

通常、標準的なリガーション反応には50-100 ngのベクターDNAが推奨されます。あまりにも多くのベクターを使用すると、未切断または自己リガーションされたベクターの高いバックグラウンドが発生する可能性があり、逆に少なすぎると変換効率が低下する可能性があります。難しいリガーションの場合は、この量を最適化する必要があるかもしれません。

鈍端リガーションとスティッキーエンドリガーションの計算を調整すべきですか？

はい。鈍端リガーションは一般的にスティッキーエンド（コヒーシブエンド）リガーションよりも効率が低いです。鈍端リガーションの場合は、以下を使用します：

• より高いモル比（3:1から5:1またはそれ以上）
• T4 DNAリガーゼをより多く使用する（通常2-3倍）
• より長いインキュベーション時間
• リガーション効率を高めるためにPEGを追加することを検討してください

複数のインサートのリガーションをどのように計算しますか？

複数の断片のアセンブリの場合：

1. 各インサート量を個別に同じ公式を使用して計算します
2. 同じ総モル比を維持します（例：2つのインサートの場合、1.5:1.5:1のインサート1:インサート2:ベクターを使用）
3. すべてのDNA断片を収容するために総反応体積を調整します
4. 複数の断片を含む場合は、逐次リガーションを検討するか、ギブソンアセンブリのようなアセンブリ手法を使用します

この計算機をギブソンアセンブリやゴールデンゲートアセンブリに使用できますか？

この計算機は、従来の制限酵素およびリガーゼベースのクローニング専用に設計されています。ギブソンアセンブリの場合、すべての断片の等モル量が一般的に推奨されますが、DNA量に基づく基本的な計算は似ています。ゴールデンゲートアセンブリの場合も、すべての構成要素の等モル比が通常使用されます。

ベクターの脱リン酸化を計算にどのように考慮すべきですか？

ベクターの脱リン酸化（5'リン酸基の除去）は自己リガーションを防ぎますが、量の計算には影響しません。ただし、脱リン酸化されたベクターの場合：

1. 新鮮なインサートDNAを使用して、完全な5'リン酸基を持つことを確認します
2. やや高いインサート：ベクター比（4:1から6:1）を使用することを検討してください
3. リガーション時間を長くする（通常は16°Cでの一晩）

最小の総反応体積はどれくらいにすべきですか？

最小の実用的な反応体積は通常10 μLであり、適切な混合を可能にし、蒸発の問題を防ぎます。計算されたDNA体積が希望する反応体積を超える場合、いくつかのオプションがあります：

1. DNAサンプルをより濃縮する
2. 使用するベクターの量を減らす（例：50 ngの代わりに25 ngを使用）
3. 総反応体積を増加させる
4. DNAサンプルを濃縮することを検討する

リガーション反応をインキュベートするのはどれくらいの時間が必要ですか？

最適なインキュベーション時間はリガーションの種類によって異なります：

• スティッキーエンドリガーション：室温（22-25°C）で1時間または16°Cで4-16時間
• 鈍端リガーション：室温で2-4時間または16°Cで一晩（12-16時間）
• クイックリガーション（高濃度リガーゼを使用）：室温で5-15分

残ったリガーション反応を変換に再利用できますか？

はい、リガーション混合物は通常-20°Cで保存し、変換に再利用することができます。ただし、各フリーズ-スロース循環は効率を低下させる可能性があります。最良の結果を得るために：

1. 凍結前にリガーション混合物を分注します
2. 保存前にリガーゼを加熱不活化します（65°Cで10分）
3. 最適な結果を得るために1-2ヶ月以内に使用します

参考文献

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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