DNA连接计算器

介绍

DNA连接是分子生物学中一种关键的技术，用于将DNA片段通过共价键连接在一起。DNA连接计算器是研究人员的重要工具，帮助确定成功连接反应所需的载体和插入DNA的最佳量。通过计算载体（质粒）和插入DNA片段之间的正确摩尔比，这个计算器确保高效的分子克隆实验，同时最小化试剂浪费和失败反应。

连接反应是基因工程、合成生物学和分子克隆程序的基础。它们使科学家能够通过将感兴趣的基因插入质粒载体中，创建重组DNA分子，以便随后转化到宿主生物中。这些反应的成功在很大程度上依赖于使用适当的DNA组分量，而这正是这个计算器帮助确定的。

无论您是在构建表达载体、创建基因文库，还是进行常规的亚克隆，这个DNA连接计算器将帮助您优化实验条件并提高成功率。通过输入一些关于您的DNA样本的关键参数，您可以快速获得特定连接反应所需的确切体积。

公式/计算

DNA连接计算器使用一个基本的分子生物学公式，该公式考虑了被连接的DNA片段的不同大小和浓度。主要计算确定所需的插入DNA量相对于载体DNA的量，基于它们各自的长度和所需的摩尔比。

插入量计算

所需的插入DNA量（以纳克为单位）使用以下公式计算：

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

其中：

• ng of vector = 反应中使用的载体DNA量（通常为50-100 ng）
• kb size of insert = 插入DNA片段的长度，以千碱基（kb）为单位
• kb size of vector = 载体DNA的长度，以千碱基（kb）为单位
• molar ratio = 插入分子与载体分子的所需比率（通常为3:1到5:1）

体积计算

一旦确定了所需的插入DNA量，就可以计算反应所需的体积：

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

示例计算

让我们通过一个实际的例子来演示：

• 载体浓度：50 ng/μL
• 载体长度：3000 bp（3 kb）
• 插入浓度：25 ng/μL
• 插入长度：1000 bp（1 kb）
• 所需摩尔比（插入：载体）：3:1
• 总反应体积：20 μL
• 使用的载体量：50 ng

步骤1：计算所需的插入量 $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

步骤2：计算体积 $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

这个计算确保在反应中每个载体分子都有三个插入分子，从而优化成功连接的机会。

使用计算器的逐步指南

我们的DNA连接计算器旨在直观且简单。请按照以下步骤计算您的连接反应的最佳体积：

1. 输入载体信息：

   • 输入您的载体浓度（ng/μL）
   • 输入载体长度（bp）
   • 指定您希望在反应中使用的载体DNA量（ng）

2. 输入插入信息：

   • 输入您的插入浓度（ng/μL）
   • 输入插入长度（bp）

3. 设置反应参数：

   • 指定所需的摩尔比（插入：载体） - 通常在3:1到5:1之间
   • 输入总反应体积（μL）（通常为10-20 μL）

4. 查看结果：

   • 计算器将自动显示：
     • 所需的载体体积（μL）
     • 所需的插入体积（μL）
     • 添加的缓冲液/水体积（μL）
     • 总反应体积（μL）
     • 反应中的载体和插入DNA量（ng）

5. 复制结果（可选）：

   • 使用“复制结果”按钮将所有计算复制到剪贴板，以便用于您的实验室笔记或协议

计算器执行验证检查，以确保所有输入都是正数，并且总量足以满足所需的DNA体积。如果检测到任何错误，提示信息将帮助您纠正输入。

用例

DNA连接计算器在众多分子生物学应用中都非常有价值：

分子克隆

最常见的用例是标准的分子克隆，研究人员在此过程中将基因或DNA片段插入质粒载体。计算器确保为以下情况提供最佳条件：

• 在不同表达载体之间的基因亚克隆
• 通过连接多个基因片段创建融合蛋白
• 构建报告基因测定
• 建立质粒文库

合成生物学

在合成生物学中，通常需要组装多个DNA片段：

• Gibson组装反应受益于精确的插入：载体比率
• Golden Gate组装系统需要特定的DNA浓度
• BioBrick标准化遗传元件的组装
• 构建合成遗传电路

诊断试剂盒开发

在开发分子诊断工具时：

• 克隆特定疾病的遗传标记
• 构建阳性对照质粒
• 开发qPCR的校准标准

蛋白表达系统

对于从事蛋白质生产的研究人员：

• 优化高拷贝表达载体的插入：载体比率
• 构建诱导表达系统
• 创建用于蛋白质纯化的分泌载体

CRISPR-Cas9应用

在基因组编辑应用中：

• 将引导RNA克隆到CRISPR载体中
• 创建同源修复的供体模板
• 构建引导RNA文库以进行筛选

挑战性连接

该计算器在挑战性连接场景中特别有价值：

• 大插入克隆（>5 kb）
• 非常小的片段插入（<100 bp）
• 整平端连接效率较低
• 多片段组装反应

替代方案

虽然我们的DNA连接计算器为传统连接反应提供精确计算，但还有几种替代方法可以将DNA片段连接在一起：

1. Gibson组装：使用外切酶、聚合酶和连接酶在单管反应中连接重叠的DNA片段。无需传统的连接计算，但浓度比仍然很重要。

2. Golden Gate组装：使用类型IIS限制酶进行定向、无伤痕组装多个片段。需要所有片段的等摩尔量。

3. SLIC（序列和连接独立克隆）：使用外切酶创建单链粘附，彼此结合。通常使用片段的等摩尔比。

4. In-Fusion克隆：商业系统，允许具有15 bp重叠的片段连接。根据片段大小使用特定比例。

5. Gateway克隆：使用特定的重组而不是连接。需要特定的入口和目的载体。

6. 经验测试：一些实验室更喜欢设置多个连接反应，使用不同的插入：载体比率（1:1、3:1、5:1、10:1），并确定哪种效果最佳。

7. 软件计算器：商业软件包如Vector NTI和SnapGene包含连接计算器，具有额外的功能，如限制位点分析。

历史

DNA连接计算的开发与分子克隆技术的演变相平行，这些技术彻底改变了分子生物学和生物技术。

早期发展（1970年代）

DNA连接的概念在1970年代早期随着保罗·伯格、赫伯特·博耶和斯坦利·科恩的开创性工作而出现，他们开发了第一个重组DNA分子。在此期间，连接反应主要是经验性的，研究人员通过试错来确定最佳条件。

限制酶和DNA连接酶的发现提供了切割和重新连接DNA分子的基本工具。T4 DNA连接酶从感染大肠杆菌的T4噬菌体中分离出来，成为连接DNA片段的标准酶，因为它能够连接平端和粘性端。

精炼时期（1980年代-1990年代）

随着分子克隆变得更加常规，研究人员开始开发更系统的方法来进行连接反应。载体和插入DNA之间的摩尔比的重要性变得显而易见，导致了今天仍在使用的基本公式的发展。

在此期间，研究人员建立了过量的插入DNA（通常为3:1到5:1的摩尔比）通常会提高标准克隆应用的连接效率。这一知识最初通过实验室协议共享，并逐渐进入分子生物学手册和教科书中。

现代时代（2000年至今）

在2000年代，计算工具和在线计算器的出现使得精确的连接计算对研究人员更为可及。随着分子生物学技术变得更加复杂，对准确计算的需求变得更加关键，尤其是对于涉及多个片段或大插入的挑战性克隆项目。

如今，DNA连接计算是分子克隆工作流程的一个组成部分，专门的计算器如本计算器帮助研究人员优化实验。基本公式在很大程度上保持不变，尽管我们对影响连接效率的因素的理解有所提高。

替代连接方法如Gibson组装和Golden Gate克隆的出现引入了新的计算需求，但DNA片段之间的摩尔比这一基本概念在这些技术中仍然很重要。

代码示例

以下是各种编程语言中DNA连接计算器的实现：

1' Excel VBA函数用于DNA连接计算器
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' 计算所需的插入量（ng）
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' 计算载体体积（μL）
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' 计算插入体积（μL）
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' 计算缓冲液/水体积（μL）
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' 在单元格中的使用示例：
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    计算DNA连接反应的体积。
5    
6    参数：
7    vector_concentration (float): 载体DNA浓度（ng/μL）
8    vector_length (float): 载体DNA长度（bp）
9    insert_concentration (float): 插入DNA浓度（ng/μL）
10    insert_length (float): 插入DNA长度（bp）
11    molar_ratio (float): 插入：载体的所需摩尔比
12    total_volume (float): 总反应体积（μL）
13    vector_amount (float): 使用的载体DNA量（ng，默认：50）
14    
15    返回：
16    dict: 包含计算的体积和量的字典
17    """
18    # 计算载体体积
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # 计算所需插入量
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # 计算插入体积
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # 计算缓冲液/水体积
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# 使用示例
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"载体: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"插入: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"缓冲液: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"总计: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // 将长度转换为kb进行计算
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // 计算所需插入量
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // 计算体积
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// 使用示例
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`载体: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`插入: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`缓冲液: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`总计: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // 将长度转换为kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // 计算所需插入量
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // 计算体积
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // 四舍五入到小数点后两位
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("载体: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("插入: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("缓冲液: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("总计: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // 将长度转换为kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // 计算所需插入量
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // 计算体积
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // 四舍五入到小数点后两位
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "载体: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "插入: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "缓冲液: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "总计: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

常见问题解答（FAQ）

DNA连接的最佳摩尔比是多少？

插入与载体的最佳摩尔比通常在3:1到5:1之间，适用于标准克隆应用。然而，这可能会根据具体的连接场景而有所不同：

• 对于平端连接：3:1到5:1
• 对于粘性端连接：1:1到3:1
• 对于大插入（>10 kb）：1:1到2:1
• 对于小插入（<500 bp）：5:1到10:1
• 对于多片段组装：每个插入与载体的比率为3:1

尽管使用了计算出的体积，我的连接反应为何失败？

除了摩尔比之外，还有几个因素可能影响连接效率：

1. DNA质量：确保载体和插入的末端清晰且无损伤
2. 去磷酸化：检查您的载体是否已去磷酸化，以防止自连接
3. 酶活性：验证您的连接酶是否活跃，并在正确的温度下使用
4. 孵育时间：某些连接反应受益于更长的孵育（在16°C下过夜）
5. 缓冲条件：确保使用正确的缓冲液并含有ATP
6. 污染物：纯化DNA以去除抑制剂，如EDTA或高盐

我在连接反应中应该使用多少载体DNA？

通常，建议在标准连接反应中使用50-100 ng的载体DNA。使用过多的载体可能导致未切割或自连接载体的背景增加，而使用过少则可能降低转化效率。对于挑战性的连接，您可能需要优化此数量。

我是否应该为平端连接和粘性端连接调整计算？

是的。平端连接通常比粘性端（粘附端）连接效率低。对于平端连接，使用：

• 更高的摩尔比（3:1到5:1或更高）
• 更多的T4 DNA连接酶（通常是2-3倍）
• 更长的孵育时间
• 考虑添加PEG以增强连接效率

如何计算多个插入的连接？

对于多个片段的组装：

1. 使用相同的公式单独计算每个插入量
2. 保持相同的总摩尔比（例如，对于两个插入，使用1.5:1.5:1的插入1:插入2:载体）
3. 调整总反应体积以容纳所有DNA片段
4. 考虑顺序连接或使用Gibson组装等方法进行多个片段的组装

我可以将剩余的连接反应用于转化吗？

是的，连接混合物通常可以在-20°C下存储并重新用于转化。然而，每次冷冻-解冻循环可能会降低效率。为了获得最佳效果：

1. 在冷冻前分装连接混合物
2. 在存储前热灭活连接酶（65°C下10分钟）
3. 在1-2个月内使用以获得最佳效果

我应该孵育我的连接反应多长时间？

最佳孵育时间因连接类型而异：

• 粘性端连接：在室温（22-25°C）下孵育1小时或在16°C下孵育4-16小时
• 平端连接：在室温下孵育2-4小时或在16°C下过夜（12-16小时）
• 快速连接（使用高浓度连接酶）：在室温下孵育5-15分钟

我可以使用此计算器进行Gibson组装或Golden Gate组装吗？

此计算器专门为传统的限制酶和连接酶基础的克隆设计。对于Gibson组装，通常建议所有片段的等摩尔量（1:1比率），尽管基于长度的DNA量的基本计算是相似的。对于Golden Gate组装，所有组分的等摩尔比通常也被使用。

如何在我的计算中考虑载体去磷酸化？

载体的去磷酸化（去除5'磷酸基团）防止自连接，但不会改变量的计算。然而，对于去磷酸化的载体：

1. 使用新鲜的插入DNA，确保其完整的5'磷酸基团
2. 考虑使用稍高的插入：载体比率（4:1到6:1）
3. 确保更长的连接时间（至少在室温下1小时或在16°C下过夜）

我应该使用的最小总反应体积是多少？

通常，最小的实际反应体积为10 μL，这样可以确保充分混合并防止蒸发问题。如果您的计算DNA体积超过所需的反应体积，您有几种选择：

1. 使用更浓缩的DNA样本
2. 减少使用的载体量（例如，使用25 ng而不是50 ng）
3. 增加总反应体积
4. 考虑浓缩您的DNA样本

我应该在连接反应中使用多少载体DNA？

通常，建议在标准连接反应中使用50-100 ng的载体DNA。使用过多的载体可能导致未切割或自连接载体的背景增加，而使用过少则可能降低转化效率。对于挑战性的连接，您可能需要优化此数量。

我是否应该为平端连接和粘性端连接调整计算？

是的。平端连接通常比粘性端（粘附端）连接效率低。对于平端连接，使用：

• 更高的摩尔比（3:1到5:1或更高）
• 更多的T4 DNA连接酶（通常是2-3倍）
• 更长的孵育时间
• 考虑添加PEG以增强连接效率

如何计算多个插入的连接？

对于多个片段的组装：

1. 使用相同的公式单独计算每个插入量
2. 保持相同的总摩尔比（例如，对于两个插入，使用1.5:1.5:1的插入1:插入2:载体）
3. 调整总反应体积以容纳所有DNA片段
4. 考虑顺序连接或使用Gibson组装等方法进行多个片段的组装

我可以将剩余的连接反应用于转化吗？

是的，连接混合物通常可以在-20°C下存储并重新用于转化。然而，每次冷冻-解冻循环可能会降低效率。为了获得最佳效果：

1. 在冷冻前分装连接混合物
2. 在存储前热灭活连接酶（65°C下10分钟）
3. 在1-2个月内使用以获得最佳效果

我应该孵育我的连接反应多长时间？

最佳孵育时间因连接类型而异：

• 粘性端连接：在室温（22-25°C）下孵育1小时或在16°C下孵育4-16小时
• 平端连接：在室温下孵育2-4小时或在16°C下过夜（12-16小时）
• 快速连接（使用高浓度连接酶）：在室温下孵育5-15分钟

我可以使用此计算器进行Gibson组装或Golden Gate组装吗？

此计算器专门为传统的限制酶和连接酶基础的克隆设计。对于Gibson组装，通常建议所有片段的等摩尔量（1:1比率），尽管基于长度的DNA量的基本计算是相似的。对于Golden Gate组装，所有组分的等摩尔比通常也被使用。

如何在我的计算中考虑载体去磷酸化？

载体的去磷酸化（去除5'磷酸基团）防止自连接，但不会改变量的计算。然而，对于去磷酸化的载体：

1. 使用新鲜的插入DNA，确保其完整的5'磷酸基团
2. 考虑使用稍高的插入：载体比率（4:1到6:1）
3. 确保更长的连接时间（至少在室温下1小时或在16°C下过夜）

我应该使用的最小总反应体积是多少？

通常，最小的实际反应体积为10 μL，这样可以确保充分混合并防止蒸发问题。如果您的计算DNA体积超过所需的反应体积，您有几种选择：

1. 使用更浓缩的DNA样本
2. 减少使用的载体量（例如，使用25 ng而不是50 ng）
3. 增加总反应体积
4. 考虑浓缩您的DNA样本

参考文献

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/