Calculadora de Dilución Celular

Una calculadora de dilución celular determina cuánto de la suspensión celular y cuánto diluyente deben mezclarse para alcanzar una concentración celular objetivo en un volumen final determinado. Se utiliza en cultivo celular, microbiología y otros trabajos de laboratorio en los que una muestra debe llevarse a una concentración exacta antes de usarse.

Qué significa diluir células

Diluir una suspensión celular no cambia cuántas células contiene. Solo cambia el volumen en el que se encuentran las células, lo que reduce la concentración. Una suspensión contada a 1.000.000 células por mililitro (células/mL) sigue conteniendo el mismo número total de células después de la dilución. Simplemente, ese número se distribuye en una mayor cantidad de líquido.

Los laboratorios diluyen las células antes de muchos procedimientos rutinarios: dividir un cultivo en crecimiento en nuevos matraces, sembrar un número fijo de células en cada pocillo de una placa, congelar células para almacenarlas o preparar una muestra para un contador celular o un citómetro de flujo.

Fórmula de dilución celular

El cálculo se basa en una regla. El número de células tomado de la suspensión inicial, multiplicado por su concentración, debe ser igual al número de células en el volumen final, multiplicado por la concentración objetivo:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — concentración inicial (de la suspensión madre), en células/mL
V₁ — volumen de suspensión madre que se utilizará, en mL
C₂ — concentración objetivo, en células/mL
V₂ — volumen final total necesario, en mL

Al despejar V₁ se obtiene el volumen de suspensión madre que debe pipetearse:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

El resto del volumen final es diluyente, normalmente medio de cultivo celular, solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otro tampón:

Volumen de diluyente = V₂ − V₁

La concentración objetivo (C₂) nunca puede ser mayor que la concentración inicial (C₁). La dilución solo reduce la concentración. Para aumentarla, es necesario centrifugar las células y resuspenderlas en una menor cantidad de líquido.

Cómo calcular una dilución celular

Cuente la suspensión madre con un hemocitómetro o un contador celular automático para obtener C₁.
Anote la concentración objetivo, C₂, que requiere el protocolo.
Determine el volumen final total, V₂, necesario.
Calcule V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Calcule el volumen de diluyente como V₂ − V₁.
Pipetee V₁ de la suspensión madre en un tubo y, a continuación, añada el volumen de diluyente de medio o tampón.

Ejemplo resuelto

Una suspensión madre tiene una concentración de 1.000.000 células/mL. Un protocolo requiere 100.000 células/mL en un volumen final de 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volumen de diluyente = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Tomar 1 mL de la suspensión madre y añadir 9 mL de medio produce 10 mL de suspensión a 100.000 células/mL.

Un segundo ejemplo

Un ensayo en una placa de 96 pocillos necesita 10.000 células por pocillo en 200 microlitros (μL) de medio por pocillo. Esto corresponde a una concentración objetivo de 50.000 células/mL, ya que 10.000 células divididas entre 0,2 mL equivalen a 50.000 células/mL. La suspensión madre tiene una concentración de 2.000.000 células/mL y se necesitan 20 mL en total para cubrir la placa, con un excedente para compensar las pérdidas durante el pipeteo.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volumen de diluyente = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Mezclar 0,5 mL de la suspensión madre con 19,5 mL de medio produce 20 mL a 50.000 células/mL, una dilución de 1 en 40.

Fuentes de error

La fórmula en sí es exacta. Los errores proceden de los números que se introducen en ella.

Error de recuento. Un recuento celular incorrecto conduce directamente a una dilución incorrecta. Contar los cuatro cuadrados de las esquinas de la cuadrícula del hemocitómetro y calcular su promedio reduce este riesgo.
Células aglomeradas. Una aglomeración de células parece una sola célula al microscopio, pero en realidad está formada por varias, por lo que reduce la concentración aparente.
Intervalo de la pipeta. Una pipeta utilizada fuera de su intervalo de volumen especificado produce resultados inexactos. Una pipeta de 1000 μL ajustada para dispensar 5 μL no es fiable; debe utilizarse una pipeta más pequeña.
Confusión de unidades. Mezclar células/mL con células/μL produce un error mil veces mayor o menor de lo debido.
Células muertas. Un recuento celular directo incluye las células muertas, a menos que se haya utilizado una tinción de viabilidad, como azul tripán. Esto puede sobrestimar el número de células vivas realmente presentes.

Límites de esta calculadora

La calculadora rechaza los números con los que no puede proporcionar una respuesta útil:

Cada valor debe ser mayor que cero.
La concentración objetivo no puede ser mayor que la concentración inicial.
La concentración inicial debe ser de 1 billón de células/mL (1 × 10¹²) o menos.
El volumen de suspensión madre calculado debe ser de al menos 0,001 mL, que equivale a 1 microlitro. Cualquier volumen menor no puede pipetearse con exactitud, por lo que la calculadora solicita otros valores. Aumentar el volumen total suele resolver el problema.

Los volúmenes se muestran con dos decimales, o con tres cuando el volumen de suspensión madre es inferior a 0,01 mL, para que un volumen pequeño nunca aparezca como 0,00 mL.

Preguntas frecuentes

¿Cuál es la fórmula para la dilución celular?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, donde C₁ y C₂ son las concentraciones inicial y objetivo, y V₁ y V₂ son el volumen tomado de la suspensión madre y el volumen final total.

¿Puede la concentración objetivo ser mayor que la concentración inicial?

No. La dilución solo reduce la concentración. Para alcanzar una concentración mayor es necesario centrifugar las células y resuspenderlas en un volumen menor.

¿Qué líquido debe utilizarse para diluir las células?

Se utiliza medio de cultivo completo cuando las células deben mantenerse sanas durante horas o días, por ejemplo, antes de sembrar una placa. La PBS o una solución salina tamponada similar sirve para diluciones breves, de menos de unos 30 minutos, antes de procesar las células. Se utiliza medio sin suero cuando las proteínas del suero interferirían con un ensayo posterior.

¿Funciona esta fórmula para bacterias o levaduras?

Sí. C₁V₁ = C₂V₂ se aplica a cualquier suspensión de partículas, incluidas las bacterias medidas en unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL), las levaduras y las partículas víricas medidas en unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL), siempre que se utilicen las mismas unidades en ambos lados de la ecuación.

¿Deben contarse las células muertas en la dilución?

Para sembrar un cultivo vivo, solo deben contarse las células viables. Si una suspensión tiene una viabilidad del 80 %, su concentración viable es 0,8 veces el recuento celular total, y esa concentración viable debe utilizarse como C₁.

¿Cómo pueden realizarse con exactitud diluciones muy grandes?

Las diluciones grandes, como 1 en 1000, suelen realizarse como una serie de pasos más pequeños llamados diluciones seriadas. Tres diluciones sucesivas de 1 en 10 alcanzan una dilución global de 1 en 1000, manteniendo cada paso de pipeteo dentro de un intervalo de volumen preciso.

Calculadora de Dilución Celular - Herramienta Precisa de Dilución de Laboratorio