Calculateur de Concentration Protéique | A280 vers mg/mL

Calculateur de concentration en protéines

Un calculateur de concentration en protéines convertit une valeur d’absorbance mesurée par un spectrophotomètre en quantité de protéines dissoutes dans une solution. Le résultat est généralement exprimé en milligrammes par millilitre (mg/mL) ou en microgrammes par millilitre (μg/mL). Le calcul repose sur la loi de Beer-Lambert, une relation de chimie qui lie la quantité de lumière absorbée par un échantillon à la quantité de substance qu’il contient.

Comment la concentration en protéines est mesurée

La plupart des protéines absorbent fortement la lumière ultraviolette à une longueur d’onde de 280 nanomètres (nm). Cette absorption provient principalement de deux acides aminés, le tryptophane et la tyrosine, présents dans la structure de la protéine. Un spectrophotomètre envoie de la lumière à travers l’échantillon et mesure la part qu’il absorbe. Cette mesure s’appelle l’absorbance, ou A280 lorsqu’elle est prise à 280 nm.

La mesure de l’absorbance à 280 nm est rapide et ne détruit pas l’échantillon. Elle se distingue ainsi des méthodes chimiques comme le dosage de Bradford ou le dosage BCA, décrits plus loin. La méthode donne les meilleurs résultats sur une protéine purifiée en solution, avec une absorbance comprise entre environ 0,1 et 1,0. Les mesures hors de cette plage sont moins fiables ; un échantillon doit donc souvent être dilué avant la mesure.

Formule de la concentration en protéines

Le calculateur réarrange la loi de Beer-Lambert pour déterminer la concentration :

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentration en protéines, en mg/mL
• A — absorbance à 280 nm (un nombre sans unité)
• DF — facteur de dilution, c’est-à-dire le nombre de fois que l’échantillon d’origine a été dilué avant d’être mesuré
• ε — coefficient d’extinction, constante propre à la protéine, en L/(g·cm)
• l — longueur du trajet optique, c’est-à-dire la distance parcourue par la lumière dans l’échantillon, en cm (généralement 1 cm dans une cuve standard, un petit récipient en verre ou en plastique utilisé dans le spectrophotomètre)

Pour convertir le résultat en microgrammes par millilitre, multipliez la valeur en mg/mL par 1 000. Pour obtenir la masse totale de protéines de l’échantillon, multipliez la concentration par le volume de l’échantillon en millilitres.

Exemple de calcul

Un échantillon donne une absorbance de 0,5 à 280 nm. Il n’a pas été dilué ; le facteur de dilution est donc de 1, et la mesure a été faite dans une cuve standard de 1 cm. La protéine est l’albumine de sérum bovin (BSA), dont le coefficient d’extinction est de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Dans un échantillon de 1 mL, cela représente environ 0,75 mg de protéines au total, soit 750 μg/mL.

Coefficients d’extinction de protéines courantes

Chaque protéine absorbe la lumière différemment, car chacune contient un nombre différent de résidus de tryptophane et de tyrosine. Le coefficient d’extinction décrit cette absorption pour une protéine donnée à 280 nm, en L/(g·cm). Voici des valeurs couramment utilisées :

Un calculateur peut aussi accepter un coefficient d’extinction personnalisé pour une protéine absente de cette liste. Pour une protéine dont la séquence d’acides aminés est connue, cette valeur peut être estimée en additionnant l’absorbance de ses résidus de tryptophane, de tyrosine et de cystine, méthode publiée par Gill et von Hippel en 1989. ProtParam l’applique avec les coefficients mesurés par Pace et ses collègues en 1995 : ε₂₈₀ = (résidus de tryptophane × 5 500) + (résidus de tyrosine × 1 490) + (résidus de cystine × 125). Cette formule donne un résultat en M⁻¹cm⁻¹, une unité molaire, qui diffère des valeurs massiques en L/(g·cm) ci-dessus. Des outils gratuits comme ProtParam, hébergé par le serveur ExPASy, calculent directement cette valeur à partir d’une séquence protéique.

Longueur du trajet optique et facteur de dilution

La longueur du trajet optique est la largeur de la cuve contenant l’échantillon, mesurée en centimètres. Les cuves standard font 1 cm de large. Les spectrophotomètres à micro-volumes, qui mesurent de très petits échantillons, peuvent utiliser un trajet beaucoup plus court, par exemple 0,1 cm.

Le facteur de dilution tient compte de toute dilution effectuée avant la mesure. Si un échantillon concentré donnait une absorbance supérieure à 1,0, il est courant de le diluer d’abord dans un tampon. Le facteur de dilution est égal au volume total après dilution divisé par le volume de l’échantillon d’origine. Par exemple, mélanger 10 μL d’échantillon avec 990 μL de tampon donne un volume total de 1 000 μL, soit un facteur de dilution de 100.

Autres façons de mesurer la concentration en protéines

L’absorbance à 280 nm est l’une des nombreuses méthodes courantes utilisées en laboratoire.

• Dosage de Bradford : utilise un colorant qui change de couleur lorsqu’il se lie aux protéines. Il fonctionne bien sur des échantillons non purifiés, mais le changement de couleur peut varier d’une protéine à l’autre.
• Dosage BCA : repose sur un changement de couleur provoqué par les liaisons peptidiques de la protéine. Il est compatible avec de nombreux détergents, mais prend plus de temps qu’une mesure directe de l’absorbance.
• Méthode de Lowry : méthode plus ancienne, très sensible, mais qui réagit mal avec certains ingrédients courants des tampons.

Chacune de ces trois méthodes détruit l’échantillon. Une mesure directe de l’A280 ne le détruit pas ; le même échantillon peut donc être récupéré et réutilisé.

Foire aux questions

Quelle est la plage d’absorbance idéale pour cette méthode ?

Entre 0,1 et 1,0. En dessous de 0,1, la mesure est imprécise. Au-dessus de 1,0, la relation entre l’absorbance et la concentration peut ne plus être linéaire ; l’échantillon doit donc être dilué au préalable.

Pourquoi mesurer à 280 nm plutôt qu’à 260 nm ?

Les acides nucléiques, comme l’ADN et l’ARN, absorbent fortement à 260 nm. Les protéines absorbent davantage à 280 nm en raison de leur teneur en tryptophane et en tyrosine. Mesurer à 280 nm réduit les interférences des acides nucléiques éventuellement présents dans l’échantillon.

Comment trouver le coefficient d’extinction d’une protéine qui ne figure pas dans la liste ?

Pour une protéine de séquence connue, un outil comme ProtParam le calcule à partir du nombre de résidus de tryptophane, de tyrosine et de cystine. Il peut aussi être mesuré directement, en comparant l’absorbance de l’échantillon à celle d’une solution de concentration connue.

Cette méthode convient-elle à un mélange de protéines ?

Elle convient mieux à une protéine unique et purifiée dont le coefficient d’extinction est connu. Un mélange de protéines inconnues, comme un lysat cellulaire, se mesure généralement plutôt par le dosage de Bradford ou BCA, car ces méthodes donnent une estimation plus constante des protéines totales.

Les détergents peuvent-ils fausser la mesure ?

Oui. De nombreux détergents absorbent la lumière près de 280 nm, ce qui peut fausser le résultat. L’utilisation d’un blanc contenant la même concentration de détergent permet d’annuler cette absorbance de fond. Des concentrations de détergent très élevées peuvent nécessiter un dosage compatible avec les détergents, comme le BCA.

Références

1. SIB Swiss Institute of Bioinformatics, ExPASy. ProtParam documentation. Documentation de ProtParam — coefficient d’extinction à 280 nm dans l’eau à partir de Ext(Tyr) = 1490, Ext(Trp) = 5500 et Ext(Cystine) = 125 ; méthode de Gill et von Hippel (1989), coefficients de Pace et al. (1995).