Calculateur de Concentration Protéique | A280 vers mg/mL

Calculateur de concentration protéique

Un calculateur de concentration protéique convertit une mesure d’absorbance lumineuse obtenue avec un spectrophotomètre en quantité de protéines dissoutes dans une solution. Le résultat est généralement exprimé en milligrammes par millilitre (mg/mL) ou en microgrammes par millilitre (μg/mL). Le calcul repose sur la loi de Beer-Lambert, une relation chimique qui relie la quantité de lumière absorbée par un échantillon à la quantité d’une substance qu’il contient.

Comment mesurer la concentration d’une protéine

La plupart des protéines absorbent fortement la lumière ultraviolette à une longueur d’onde de 280 nanomètres (nm). Cette absorption provient principalement de deux acides aminés présents dans la structure des protéines : le tryptophane et la tyrosine. Un spectrophotomètre fait passer de la lumière à travers l’échantillon et mesure la quantité absorbée. Cette mesure est appelée absorbance, ou A280 lorsqu’elle est effectuée à 280 nm.

La mesure de l’absorbance à 280 nm est rapide et ne détruit pas l’échantillon. Elle se distingue ainsi des méthodes chimiques telles que les dosages de Bradford ou de BCA, décrits plus loin. Cette méthode fonctionne au mieux avec une protéine purifiée en solution, dont l’absorbance est comprise entre environ 0,1 et 1,0. Les mesures situées en dehors de cette plage sont moins fiables ; il est donc souvent nécessaire de diluer l’échantillon avant la mesure.

Formule de calcul de la concentration protéique

Le calculateur réarrange la loi de Beer-Lambert pour déterminer la concentration :

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentration protéique, en mg/mL
• A — absorbance à 280 nm (un nombre sans unité)
• DF — facteur de dilution, indiquant combien de fois l’échantillon initial a été dilué avant la mesure
• ε — coefficient d’extinction, une constante propre à la protéine, en L/(g·cm)
• l — longueur du trajet optique, c’est-à-dire la distance parcourue par la lumière dans l’échantillon, en cm (généralement 1 cm dans une cuvette standard, petit récipient en verre ou en plastique utilisé dans le spectrophotomètre)

Pour convertir le résultat en microgrammes par millilitre, il faut multiplier la valeur en mg/mL par 1 000. Pour déterminer la masse totale de protéines dans l’échantillon, il faut multiplier la concentration par le volume de l’échantillon exprimé en millilitres.

Exemple de calcul

Un échantillon présente une absorbance de 0,5 à 280 nm. Il n’a pas été dilué ; son facteur de dilution est donc 1, et la mesure a été effectuée dans une cuvette standard de 1 cm. La protéine est l’albumine sérique bovine (BSA), dont le coefficient d’extinction est de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Dans un échantillon de 1 mL, cela correspond à environ 0,75 mg de protéines au total, soit 750 μg/mL.

Coefficients d’extinction de protéines courantes

Chaque protéine absorbe la lumière différemment, car le nombre de résidus de tryptophane et de tyrosine varie d’une protéine à l’autre. Le coefficient d’extinction décrit cette propriété pour une protéine donnée à 280 nm, en L/(g·cm). Parmi les valeurs couramment utilisées figurent :

Un calculateur peut également accepter un coefficient d’extinction personnalisé pour une protéine qui ne figure pas dans cette liste. Pour une protéine dont la séquence en acides aminés est connue, cette valeur peut être estimée à l’aide d’une formule publiée par Gill et von Hippel en 1 989 : ε₂₈₀ = (résidus de tryptophane × 5 500) + (résidus de tyrosine × 1 490) + (résidus de cystine × 125). Cette formule donne un résultat en M⁻¹cm⁻¹, une unité molaire différente des valeurs massiques en L/(g·cm) présentées ci-dessus. Des outils gratuits comme ProtParam, hébergé par le serveur ExPASy, calculent directement cette valeur à partir de la séquence d’une protéine.

Longueur du trajet optique et facteur de dilution

La longueur du trajet optique correspond à la largeur de la cuvette contenant l’échantillon, mesurée en centimètres. Les cuvettes standard ont une largeur de 1 cm. Les spectrophotomètres à microvolume, qui mesurent de très petits échantillons, peuvent utiliser un trajet beaucoup plus court, par exemple 0,1 cm.

Le facteur de dilution tient compte de toute dilution effectuée avant la mesure. Si une solution concentrée devait présenter une absorbance supérieure à 1,0, il est courant de la diluer d’abord avec un tampon. Le facteur de dilution correspond au volume total après dilution divisé par le volume initial de l’échantillon. Par exemple, le mélange de 10 μL d’échantillon avec 990 μL de tampon donne un volume total de 1 000 μL et un facteur de dilution de 100.

Autres méthodes de mesure de la concentration protéique

L’absorbance à 280 nm est l’une des nombreuses méthodes couramment utilisées en laboratoire.

• Dosage de Bradford : utilise un colorant qui change de couleur lorsqu’il se lie aux protéines. Il convient bien aux échantillons non purifiés, mais le changement de couleur peut varier selon les protéines.
• Dosage de BCA : repose sur un changement de couleur provoqué par les liaisons peptidiques des protéines. Il est compatible avec de nombreux détergents, mais sa réalisation prend plus de temps qu’une mesure directe de l’absorbance.
• Méthode de Lowry : méthode plus ancienne, très sensible, mais qui réagit mal avec certains composants courants des tampons.

Ces trois méthodes détruisent l’échantillon. Une mesure directe de l’A280 ne le détruit pas ; le même échantillon peut donc être récupéré et réutilisé.

Foire aux questions

Quelle est la plage d’absorbance idéale pour cette méthode ?

Entre 0,1 et 1,0. En dessous de 0,1, la mesure manque de précision. Au-dessus de 1,0, la relation entre l’absorbance et la concentration peut ne plus être linéaire ; l’échantillon doit donc d’abord être dilué.

Pourquoi mesurer à 280 nm plutôt qu’à 260 nm ?

Les acides nucléiques, comme l’ADN et l’ARN, absorbent fortement à 260 nm. Les protéines absorbent davantage à 280 nm en raison de leur teneur en tryptophane et en tyrosine. Une mesure à 280 nm réduit les interférences dues aux éventuels acides nucléiques présents dans l’échantillon.

Comment trouver le coefficient d’extinction d’une protéine qui ne figure pas dans la liste ?

Pour une protéine dont la séquence est connue, un outil comme ProtParam le calcule à partir du nombre de résidus de tryptophane, de tyrosine et de cystine. Il est également possible de le mesurer directement en comparant l’absorbance de l’échantillon à celle d’une solution de concentration connue.

Cette méthode fonctionne-t-elle pour un mélange de protéines ?

Elle fonctionne au mieux pour une protéine unique et purifiée dont le coefficient d’extinction est connu. Un mélange de protéines inconnues, comme un lysat cellulaire, est généralement analysé avec le dosage de Bradford ou de BCA, car ces méthodes donnent une estimation plus homogène de la quantité totale de protéines.

Les détergents peuvent-ils perturber la mesure ?

Oui. De nombreux détergents absorbent la lumière près de 280 nm, ce qui peut fausser le résultat. L’utilisation d’un échantillon blanc contenant la même concentration de détergent aide à soustraire cette absorbance de fond. Des concentrations très élevées de détergent peuvent nécessiter l’emploi d’un dosage compatible avec les détergents, comme le dosage de BCA.