അബ്സോർബൻസ് വായനകളിൽ നിന്ന് (A260) ഡിഎൻഎ കേന്ദ്രീകൃത കണക്കാക്കുക, ക്രമീകരിക്കാവുന്ന ദ്രവ്യവാഹക ഘടകങ്ങളോടുകൂടി. മോളിക്യുലർ ബയോളജി ലാബുകൾക്കും ജീനറ്റിക് ഗവേഷണത്തിനും ആവശ്യമായ ഉപകരണം.
ഡിഎൻഎ കേന്ദ്രീകൃതിയുടെ കണക്കുകൂട്ടൽ താഴെ കൊടുത്തിരിക്കുന്ന ഫോർമുല ഉപയോഗിച്ച് ചെയ്യുന്നു:
ഒരു DNA concentration calculator എന്നത് ആണവ ജൈവശാസ്ത്രജ്ഞർ, ജനിതകശാസ്ത്രജ്ഞർ, ലാബ് സാങ്കേതിക വിദഗ്ധർ എന്നിവർക്കായി സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിക് വായനകളിൽ നിന്ന് DNA കണക്ഷൻ കൃത്യമായി നിർണ്ണയിക്കാൻ സഹായിക്കുന്ന ഒരു അനിവാര്യമായ ഓൺലൈൻ ഉപകരണം ആണ്. ഈ സൗജന്യ കാൽക്കുലേറ്റർ UV ആബ്സോർബൻസ് അളവുകൾക്ക് അടിസ്ഥാനമായ A260 രീതി ഉപയോഗിച്ച് ng/μL-ൽ കൃത്യമായ DNA കണക്ഷൻ മൂല്യങ്ങളിലേക്ക് മാറ്റുന്നു.
DNA concentration measurement എന്നത് ആണവ ജൈവശാസ്ത്ര ലാബുകളിൽ ഒരു അടിസ്ഥാന നടപടിയാണ്, PCR, സീക്വൻസിംഗ്, ക്ലോണിംഗ്, മറ്റ് ആണവ സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ എന്നിവയ്ക്ക് മുമ്പുള്ള ഒരു നിർണായക ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ ഘട്ടമായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു. നമ്മുടെ കാൽക്കുലേറ്റർ മാനുവൽ കാൽക്കുലേഷനുകൾ ഒഴിവാക്കുകയും നിങ്ങളുടെ സാമ്പിളുകളിൽ കണക്ഷൻ, മൊത്തം DNA അളവുകൾ എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കുമ്പോൾ പിശകുകൾ കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
DNA concentration കണക്കാക്കൽ Beer-Lambert നിയമത്തെ ആശ്രയിക്കുന്നു, ഇത് ഒരു ദ്രാവകത്തിന്റെ ആബ്സോർബൻസ് ആബ്സോർബിംഗ് സ്പീഷീസിന്റെ കണക്ഷനുമായി നേരിട്ട് അനുപാതത്തിൽ ഉണ്ട് എന്ന് പറയുന്നു. ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA-യ്ക്ക്, 1cm പാത നീളമുള്ള കുവേറ്റിൽ 260nm (A260) ൽ 1.0 ആബ്സോർബൻസ് ഏകദേശം 50 ng/μL കണക്ഷനോട് അനുബന്ധിക്കുന്നു.
DNA concentration കണക്കാക്കാൻ താഴെ കൊടുത്തിരിക്കുന്ന ഫോർമുല ഉപയോഗിക്കുന്നു:
എവിടെ:
സാമ്പിളിൽ മൊത്തം DNA അളവ് കണക്കാക്കാൻ:
260nm-ൽ ആബ്സോർബൻസ് (A260):
മാറ്റം ഘടകം (50):
ഡില്യൂഷൻ ഘടകം:
വോള്യം:
നിങ്ങളുടെ A260 വായനകളിൽ നിന്ന് DNA concentration കണക്കാക്കാൻ ഈ ലളിതമായ പ്രക്രിയ പിന്തുടരുക:
DNA concentration measurement നിരവധി ആണവ ജൈവശാസ്ത്രവും ഗവേഷണവും ആവശ്യങ്ങൾക്കായി അനിവാര്യമാണ്:
DNA ഫ്രാഗ്മെന്റുകൾ വെക്ടറുകളിൽ ലിഗേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ്, കൃത്യമായ കണക്ഷൻ അറിയുന്നത് ഗവേഷകർക്ക് ഏറ്റവും അനുയോജ്യമായ ഇൻസർട്ട്-ടു-വെക്ടർ അനുപാതം കണക്കാക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു, പരിവർത്തന കാര്യക്ഷമത പരമാവധി ചെയ്യുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, 3:1 മോളർ അനുപാതം ഇൻസർട്ട്-ടു-വെക്ടർ മികച്ച ഫലങ്ങൾ നൽകുന്നു, ഇത് രണ്ട് ഘടകങ്ങളുടെ കൃത്യമായ കണക്ഷൻ അളവുകൾ ആവശ്യമാണ്.
PCR പ്രതികരണങ്ങൾ സാധാരണയായി മികച്ച വർദ്ധനവിന് 1-10 ng-ന്റെ ടെംപ്ലേറ്റ് DNA ആവശ്യമാണ്. വളരെ കുറച്ച് DNA വർദ്ധനവിന്റെ പരാജയം ഉണ്ടാക്കാം, അതേസമയം വളരെ കൂടുതലായാൽ പ്രതികരണം തടയാം. ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (qPCR) നായി, കൃത്യമായ DNA അളവുകൾ ഉറപ്പാക്കാൻ കൂടുതൽ കൃത്യമായ അളവുകൾ ആവശ്യമാണ്, ഇത് കൃത്യമായ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകൾക്കും വിശ്വസനീയമായ അളവുകൾക്കും ആവശ്യമാണ്.
NGS ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കൽ പ്രോട്ടോകോളുകൾ കൃത്യമായ DNA ഇൻപുട്ട് അളവുകൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു, സാധാരണയായി 1-500 ng-ൽ, പ്ലാറ്റ്ഫോം, അപേക്ഷ എന്നിവയുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ. വിജയകരമായ ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കലിനും മൾട്ടിപ്ലക്സ്ഡ് സീക്വൻസിംഗ് റൺസിൽ സാമ്പിളുകളുടെ സമന്വയിത പ്രതിനിധാനം ഉറപ്പാക്കാൻ കൃത്യമായ കണക്ഷൻ അളവുകൾ അനിവാര്യമാണ്.
യൂക്കറിയോട്ടിക് കോശങ്ങളിൽ DNA അവതരിപ്പിക്കുമ്പോൾ, ഏറ്റവും അനുയോജ്യമായ DNA അളവ് കോശത്തിന്റെ തരം, ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ രീതി എന്നിവയുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു. സാധാരണയായി, 6-വെൽ പ്ലേറ്റ് ഫോർമാറ്റിൽ ഓരോ വെലിലും 0.5-5 μg പ്ലാസ്മിഡ് DNA ഉപയോഗിക്കുന്നു, പരീക്ഷണങ്ങൾ സ്റ്റാൻഡർഡ് ചെയ്യാൻ കൃത്യമായ കണക്ഷൻ അളവുകൾ ആവശ്യമാണ്.
ഫോറൻസിക് അപേക്ഷകളിൽ, DNA സാമ്പിളുകൾ സാധാരണയായി പരിമിതവും വിലമതിക്കപ്പെടുന്നതുമാണ്. കൃത്യമായ അളവുകൾ ഫോറൻസിക് ശാസ്ത്രജ്ഞരെ പ്രൊഫൈലിംഗിന് ആവശ്യമായ മതിയായ DNA ഉണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു, കൂടാതെ തുടര്‍ന്നുള്ള വിശകലനങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന DNA അളവുകൾ സ്റ്റാൻഡർഡ് ചെയ്യാൻ.
റെസ്ട്രിക്ഷൻ എൻസൈമുകൾ DNA-യുടെ μg-ൽ നിർവചിച്ച പ്രത്യേക പ്രവർത്തന യൂണിറ്റുകൾ ഉണ്ട്. കൃത്യമായ DNA കണക്ഷൻ അറിയുന്നത് ശരിയായ എൻസൈം-ടു-DNA അനുപാതങ്ങൾ ഉറപ്പാക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു, സ്റ്റാർ പ്രവർത്തനമില്ലാതെ (അന്യ-സ്പെസിഫിക് കട്ടിംഗ്) പൂര്‍ണമായ ഡിജസ്റ്റേഷൻ ഉറപ്പാക്കുന്നു.
UV സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രി DNA അളവിനുള്ള ഏറ്റവും സാധാരണമായ രീതി ആയിരിക്കുമ്പോൾ, നിരവധി ബദലുകൾ ഉണ്ട്:
ഫ്ലൂറോമെട്രിക് രീതി:
അഗാരോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറസിസ്:
റിയൽ-ടൈം PCR:
ഡിജിറ്റൽ PCR:
DNA concentration കൃത്യമായി അളക്കാനുള്ള കഴിവ് ആണവ ജൈവശാസ്ത്രത്തിലെ പുരോഗതികളോടൊപ്പം വളരെ മാറ്റം വന്നിട്ടുണ്ട്:
1953-ൽ വാട്ട്സൺ, ക്രിക്ക് എന്നിവരുടെ DNA ഘടനയുടെ കണ്ടെത്തലിന് ശേഷം, ശാസ്ത്രജ്ഞർ DNA-യെ വേർതിരിച്ച് അളക്കുന്നതിനുള്ള രീതി വികസിപ്പിക്കാൻ ആരംഭിച്ചു. പ്രാരംഭ സമീപനങ്ങൾ ഡിപ്ഹെനൈൽഅമൈൻ പ്രതികരണത്തെ പോലുള്ള നിറം അളവുകൾ ആശ്രയിച്ചിരുന്നുവെന്ന്, ഇത് DNA-യിലെ ഡിഒക്സിരിബോസ് ഷുഗറുകളുമായി പ്രതികരിക്കുമ്പോൾ നീല നിറം ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു. ഈ രീതി വളരെ കുറച്ച് സൻസിറ്റീവ് ആയിരുന്നു, ഇടപെടലുകൾക്ക് വിധേയമായിരുന്നു.
ന്യുക്ലിയിക് ആസിഡ് അളവിനായി UV സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിയുടെ പ്രയോഗം 1970-കളിൽ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെട്ടു. ശാസ്ത്രജ്ഞർ DNA 260nm-ൽ UV വെളിച്ചം ആബ്സോർബ് ചെയ്യുന്നതായി കണ്ടെത്തുകയും, ആബ്സോർബൻസ്, കണക്ഷൻ എന്നിവയുടെ ഇടയിൽ ഒരു രേഖീയ ബന്ധം ഉണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു. A260 = 1.0-ന് ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA-യ്ക്ക് 50 ng/μL എന്ന മാറ്റം ഘടകം ഈ കാലയളവിൽ സ്ഥാപിതമായിരുന്നു.
1980-കളിലും 1990-കളിലും DNA-സാധാരണമായ ഫ്ലോറസന്റ് ഡൈകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തത്, പ്രത്യേകിച്ച് ഡില്യൂട്ട് ചെയ്ത സാമ്പിളുകൾക്കായി DNA അളവിൽ വിപ്ലവം സൃഷ്ടിച്ചു. ഹോച്‌സ്റ്റ് ഡൈകൾ, പിന്നീട് PicoGreen, സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിക്ക് അപേക്ഷയേക്കാൾ കൂടുതൽ സൻസിറ്റീവ് ഡിറ്റക്ഷൻ അനുവദിച്ചു. ഈ രീതി PCR-ന്റെ വരവോടെ, ചെറിയ DNA അളവുകളുടെ കൃത്യമായ അളവുകൾ ആവശ്യമായപ്പോൾ പ്രത്യേകിച്ച് പ്രധാനമായിരുന്നു.
2000-കളുടെ തുടക്കത്തിൽ നാനോഡ്രോപ്പ് പോലുള്ള മൈക്രോവോളിയം സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്ററുകളുടെ പരിചയപ്പെടുത്തൽ, 0.5-2 μL സാമ്പിളുകൾ മാത്രം ആവശ്യമായതിനാൽ, സാധാരണ DNA അളവിൽ മാറ്റം വരുത്തി. ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ ഡില്യൂഷനുകൾക്കും കുവേറ്റുകൾക്കും ആവശ്യമില്ല, പ്രക്രിയയെ വേഗത്തിലാക്കുകയും കൂടുതൽ സൗകര്യപ്രദമാക്കുകയും ചെയ്തു.
ഇന്നത്തെ ദിവസം, ഡിജിറ്റൽ PCR, അടുത്ത തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് പോലുള്ള പുരോഗമിച്ച സാങ്കേതികവിദ്യകൾ DNA അളവിന്റെ അതിരുകൾ കൂടുതൽ മുന്നോട്ട് കൊണ്ടുപോയിട്ടുണ്ട്, പ്രത്യേക ശ്രേണികളുടെ കൃത്യമായ അളവുകൾക്കും ഏകകണിക ഡിറ്റക്ഷൻ അനുവദിക്കുന്നു. എന്നാൽ, ദശകങ്ങളായി സ്ഥാപിതമായ അടിസ്ഥാന സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിക് തത്വം ലോകമെമ്പാടുമുള്ള ലാബുകളിൽ സാധാരണ DNA concentration measurement-ന്റെ പിന്‍തുണയാണ്.
DNA concentration കണക്കാക്കലിന്റെ ചില പ്രായോഗിക ഉദാഹരണങ്ങളിലൂടെ നമുക്ക് കടക്കാം:
ഒരു ഗവേഷകൻ ഒരു പ്ലാസ്മിഡ് ശുദ്ധീകരിച്ച് താഴെ കൊടുത്തിരിക്കുന്ന അളവുകൾ കൈവശം വെച്ചിട്ടുണ്ട്:
നിങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനത്തിന് ഉപയോഗപ്പെടുന്ന കൂടുതൽ ഉപകരണങ്ങൾ കണ്ടെത്തുക.