Kalkulator Stężenia DNA

Wprowadzenie

Kalkulator stężenia DNA to niezbędne narzędzie dla biologów molekularnych, genetyków i techników laboratoryjnych, którzy muszą dokładnie określić stężenie DNA w swoich próbkach. Pomiar stężenia DNA jest podstawową procedurą w laboratoriach biologii molekularnej, stanowiącą kluczowy krok kontroli jakości przed przystąpieniem do dalszych aplikacji, takich jak PCR, sekwencjonowanie, klonowanie i inne techniki molekularne. Ten kalkulator wykorzystuje zasady spektrofotometrii do obliczenia stężenia DNA na podstawie absorbancji UV przy 260 nm (A260), stosując standardowy współczynnik konwersji i uwzględniając wszelkie rozcieńczenia oryginalnej próbki.

Nasz przyjazny dla użytkownika kalkulator upraszcza proces określania zarówno stężenia (ng/μL), jak i całkowitej ilości DNA w próbce, eliminując potrzebę ręcznych obliczeń i zmniejszając ryzyko błędów matematycznych. Niezależnie od tego, czy przygotowujesz próbki do sekwencjonowania nowej generacji, ilościowo określasz przygotowania plazmidów, czy oceniasz wydajność ekstrakcji DNA genomowego, to narzędzie zapewnia szybkie i niezawodne wyniki wspierające twoje badania i procesy diagnostyczne.

Jak oblicza się stężenie DNA

Podstawowa zasada

Obliczenie stężenia DNA opiera się na prawie Beer-Lamberta, które stwierdza, że absorbancja roztworu jest proporcjonalna do stężenia absorbującego gatunku w roztworze oraz długości drogi światła przez roztwór. Dla DNA podwójnie spiralnego, absorbancja 1.0 przy 260 nm (A260) w kuwecie o długości drogi 1 cm odpowiada stężeniu około 50 ng/μL.

Wzór

Stężenie DNA oblicza się za pomocą następującego wzoru:

$\text{Stężenie DNA (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Współczynnik rozcieńczenia}$

Gdzie:

• A260 to odczyt absorbancji przy 260 nm
• 50 to standardowy współczynnik konwersji dla DNA podwójnie spiralnego (50 ng/μL dla A260 = 1.0)
• Współczynnik rozcieńczenia to czynnik, o który oryginalna próbka została rozcieńczona do pomiaru

Całkowitą ilość DNA w próbce można następnie obliczyć za pomocą:

$\text{Całkowite DNA (μg)} = \frac{\text{Stężenie (ng/μL)} \times \text{Objętość (μL)}}{1000}$

Zrozumienie zmiennych

1. Absorbancja przy 260 nm (A260):

   • To pomiar tego, ile światła UV o długości fali 260 nm jest pochłaniane przez próbkę DNA
   • Nukleotydy DNA (szczególnie zasady azotowe) pochłaniają światło UV z maksymalnym pochłanianiem przy 260 nm
   • Im wyższa absorbancja, tym więcej DNA jest obecne w roztworze

2. Współczynnik konwersji (50):

   • Standardowy współczynnik konwersji 50 ng/μL dotyczy wyłącznie DNA podwójnie spiralnego
   • Dla DNA jednoniciowego współczynnik wynosi 33 ng/μL
   • Dla RNA współczynnik wynosi 40 ng/μL
   • Dla oligonukleotydów współczynnik różni się w zależności od sekwencji

3. Współczynnik rozcieńczenia:

   • Jeśli próbka została rozcieńczona przed pomiarem (np. 1 część próbki do 9 części buforu = współczynnik rozcieńczenia 10)
   • Obliczany jako: (Objętość próbki + Objętość rozcieńczalnika) ÷ Objętość próbki
   • Używany do określenia stężenia w oryginalnej, nierozcieńczonej próbce

4. Objętość:

   • Całkowita objętość roztworu DNA w mikrolitrach (μL)
   • Używana do obliczenia całkowitej ilości DNA w próbce

Jak korzystać z tego kalkulatora

Postępuj zgodnie z tymi krokami, aby dokładnie określić stężenie DNA:

1. Przygotuj swoją próbkę:

   • Upewnij się, że próbka DNA jest odpowiednio rozpuszczona i wymieszana
   • Jeśli oczekiwane stężenie jest wysokie, przygotuj rozcieńczenie, aby upewnić się, że odczyt mieści się w zakresie liniowym (zwykle A260 między 0.1 a 1.0)

2. Zmierz absorbancję:

   • Użyj spektrofotometru lub urządzenia nanodrop do pomiaru absorbancji przy 260 nm
   • Zmierz również absorbancję przy 280 nm, aby ocenić czystość (stosunek A260/A280)
   • Użyj tego samego buforu, który użyto do rozpuszczenia/rozcieńczenia DNA jako odniesienia

3. Wprowadź wartości do kalkulatora:

   • Wprowadź zmierzoną wartość A260 w polu "Absorbancja przy 260 nm"
   • Wprowadź całkowitą objętość roztworu DNA w mikrolitrach
   • Wprowadź współczynnik rozcieńczenia (użyj 1, jeśli nie dokonano rozcieńczenia)

4. Interpretuj wyniki:

   • Kalkulator wyświetli stężenie DNA w ng/μL
   • Całkowita ilość DNA w próbce zostanie pokazana w μg
   • Użyj tych wartości, aby określić odpowiednią objętość potrzebną do dalszych aplikacji

5. Oceń czystość DNA (jeśli zmierzono A280):

   • Stosunek A260/A280 około 1.8 wskazuje na czyste DNA
   • Niższe stosunki mogą wskazywać na zanieczyszczenie białkiem
   • Wyższe stosunki mogą sugerować zanieczyszczenie RNA

Przykłady zastosowania

Pomiar stężenia DNA jest kluczowy w licznych zastosowaniach biologii molekularnej i biotechnologii:

Klonowanie molekularne

Przed ligowaniem fragmentów DNA do wektorów, znajomość dokładnego stężenia pozwala badaczom obliczyć optymalny stosunek wstawki do wektora, maksymalizując efektywność transformacji. Na przykład, stosunek molowy 3:1 wstawki do wektora często daje najlepsze wyniki, co wymaga precyzyjnych pomiarów stężenia obu składników.

PCR i qPCR

Reakcje PCR zazwyczaj wymagają 1-10 ng DNA jako szablonu dla optymalnej amplifikacji. Zbyt mało DNA może prowadzić do niepowodzenia amplifikacji, podczas gdy zbyt dużo może hamować reakcję. W przypadku ilościowego PCR (qPCR) konieczne jest jeszcze dokładniejsze określenie ilości DNA, aby zapewnić dokładne krzywe standardowe i wiarygodną ilość.

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS)

Protokół przygotowania bibliotek NGS określa dokładne ilości DNA wejściowego, często w zakresie 1-500 ng w zależności od platformy i aplikacji. Dokładny pomiar stężenia jest niezbędny do udanego przygotowania biblioteki i zrównoważonego reprezentowania próbek w złożonych sekwencjonowania.

Eksperymenty transfekcyjne

Podczas wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych optymalna ilość DNA różni się w zależności od typu komórki i metody transfekcji. Zwykle używa się 0.5-5 μg DNA plazmidowego na studzienkę w formacie 6-studzienkowym, co wymaga precyzyjnego pomiaru stężenia w celu standaryzacji eksperymentów.

Analiza DNA w kryminalistyce

W zastosowaniach kryminalistycznych próbki DNA są często ograniczone i cenne. Dokładne określenie ilości pozwala naukowcom kryminalistycznym ustalić, czy wystarczająca ilość DNA jest obecna do profilowania oraz standaryzować ilość DNA używanego w kolejnych analizach.

Trawienie enzymami restrykcyjnymi

Enzymy restrykcyjne mają określone jednostki aktywności zdefiniowane na μg DNA. Znajomość dokładnego stężenia DNA pozwala na prawidłowe proporcje enzymu do DNA, zapewniając pełne trawienie bez aktywności „gwiazdkowej” (cięcia niespecyficzne).

Alternatywy dla pomiaru spektrofotometrycznego

Chociaż spektrofotometria UV jest najczęściej stosowaną metodą do ilościowego określania DNA, istnieje kilka alternatyw:

1. Metody fluorometryczne:

   • Fluorescencyjne barwniki, takie jak PicoGreen, Qubit i SYBR Green, wiążą się specyficznie z DNA podwójnie spiralnym
   • Bardziej wrażliwe niż spektrofotometria (mogą wykrywać nawet 25 pg/mL)
   • Mniej podatne na zanieczyszczenia, takie jak białka, RNA czy wolne nukleotydy
   • Wymaga fluorometru i specyficznych reagentów

2. Elektroforeza w żelu agarozowym:

   • DNA można ilościowo określić, porównując intensywność pasm do standardów o znanym stężeniu
   • Jednocześnie dostarcza informacji o rozmiarze i integralności DNA
   • Mniej precyzyjna niż metody spektrofotometryczne lub fluorometryczne
   • Czasochłonna, ale przydatna do wizualnej weryfikacji

3. Real-Time PCR:

   • Wysoce wrażliwa metoda do ilościowego określania specyficznych sekwencji DNA
   • Może wykrywać ekstremalnie niskie stężenia (nawet do kilku kopii)
   • Wymaga specyficznych primerów i bardziej skomplikowanego sprzętu
   • Używana, gdy potrzebne jest ilościowe określenie specyficznych sekwencji

4. Cyfrowa PCR:

   • Absolutne ilościowe określenie bez krzywych standardowych
   • Ekstremalnie precyzyjna dla rzadkich celów
   • Droga i wymaga specjalistycznego sprzętu
   • Używana do wykrywania rzadkich mutacji i analizy wariacji liczby kopii

Historia pomiaru stężenia DNA

Możliwość dokładnego pomiaru stężenia DNA znacznie ewoluowała równolegle z postępami w biologii molekularnej:

Wczesne metody (lata 50-60)

Po odkryciu struktury DNA przez Watsona i Cricka w 1953 roku, naukowcy zaczęli opracowywać metody izolacji i ilościowego określania DNA. Wczesne podejścia opierały się na testach kolorometrycznych, takich jak reakcja z difenylaminą, która wytwarzała niebieski kolor w reakcji z deoksyrybozą w DNA. Metody te były stosunkowo mało wrażliwe i podatne na zakłócenia.

Era spektrofotometrii (lata 70)

Zastosowanie spektrofotometrii UV do ilościowego określania kwasów nukleinowych stało się powszechne w latach 70. Naukowcy odkryli, że DNA pochłania światło UV z maksymalnym pochłanianiem przy 260 nm oraz że związek między absorbancją a stężeniem był liniowy w pewnym zakresie. Współczynnik konwersji 50 ng/μL dla DNA podwójnie spiralnego przy A260 = 1.0 został ustalony w tym okresie.

Rewolucja fluorometryczna (lata 80-90)

Opracowanie barwników fluorescencyjnych specyficznych dla DNA w latach 80. i 90. zrewolucjonizowało ilościowe określanie DNA, szczególnie dla rozcieńczonych próbek. Barwniki Hoechst i później PicoGreen umożliwiły znacznie bardziej czułe wykrywanie niż było to możliwe przy spektrofotometrii. Metody te stały się szczególnie ważne wraz z pojawieniem się PCR, które często wymagało precyzyjnego określenia ilości minutowego DNA.

Nowoczesna era (lata 2000-obecnie)

Wprowadzenie spektrofotometrów do pomiaru mikroobjętości, takich jak NanoDrop, na początku lat 2000 przekształciło rutynowe ilościowe określanie DNA, wymagając jedynie 0.5-2 μL próbki. Ta technologia wyeliminowała potrzebę rozcieńczeń i kuwet, przyspieszając i ułatwiając proces.

Dziś zaawansowane techniki, takie jak cyfrowa PCR i sekwencjonowanie nowej generacji, przesunęły granice ilościowego określania DNA jeszcze dalej, umożliwiając absolutne określenie specyficznych sekwencji i detekcję pojedynczych cząsteczek. Jednak podstawowa zasada spektrofotometrii ustalona dziesięciolecia temu pozostaje fundamentem rutynowego pomiaru stężenia DNA w laboratoriach na całym świecie.

Praktyczne przykłady

Przejdźmy przez kilka praktycznych przykładów obliczeń stężenia DNA:

Przykład 1: Standardowe przygotowanie plazmidu

Badacz oczyścił plazmid i uzyskał następujące pomiary:

• Odczyt A260: 0.75
• Rozcieńczenie: 1:10 (współczynnik rozcieńczenia = 10)
• Objętość roztworu DNA: 50 μL

Obliczenia:

• Stężenie = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• Całkowite DNA = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

Przykład 2: Ekstrakcja DNA genomowego

Po ekstrakcji DNA genomowego z krwi:

• Odczyt A260: 0.15
• Brak rozcieńczenia (współczynnik rozcieńczenia = 1)
• Objętość roztworu DNA: 200 μL

Obliczenia:

• Stężenie = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• Całkowite DNA = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

Przykład 3: Przygotowanie DNA do sekwencjonowania

Protokół sekwencjonowania wymaga dokładnie 500 ng DNA:

• Stężenie DNA: 125 ng/μL
• Wymagana ilość: 500 ng

Objętość potrzebna = 500 ÷ 125 = 4 μL roztworu DNA

Przykłady kodu

Oto przykłady, jak obliczyć stężenie DNA w różnych językach programowania:

1' Formuła Excela do obliczenia stężenia DNA
2=A260*50*WspółczynnikRozcieńczenia
3
4' Formuła Excela do obliczenia całkowitej ilości DNA w μg
5=(A260*50*WspółczynnikRozcieńczenia*Objętość)/1000
6
7' Przykład w komórce z A260=0.5, WspółczynnikRozcieńczenia=2, Objętość=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Wynik: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Oblicz stężenie DNA w ng/μL
4    
5    Parametry:
6    absorbance (float): Odczyt absorbancji przy 260 nm
7    dilution_factor (float): Współczynnik rozcieńczenia próbki
8    
9    Zwraca:
10    float: Stężenie DNA w ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Oblicz całkowitą ilość DNA w μg
17    
18    Parametry:
19    concentration (float): Stężenie DNA w ng/μL
20    volume_ul (float): Objętość roztworu DNA w μL
21    
22    Zwraca:
23    float: Całkowita ilość DNA w μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Przykład użycia
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Stężenie DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Całkowite DNA: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Zwraca stężenie DNA w ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Zwraca całkowitą ilość DNA w μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Przykład użycia
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`Stężenie DNA: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Całkowite DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Oblicz stężenie DNA w ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance Odczyt absorbancji przy 260 nm
6     * @param dilutionFactor Współczynnik rozcieńczenia próbki
7     * @return Stężenie DNA w ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Oblicz całkowitą ilość DNA w μg
15     * 
16     * @param concentration Stężenie DNA w ng/μL
17     * @param volumeUL Objętość roztworu DNA w μL
18     * @return Całkowita ilość DNA w μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("Stężenie DNA: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Całkowite DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# Funkcja R do obliczenia stężenia DNA
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Zwraca stężenie DNA w ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Zwraca całkowitą ilość DNA w μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Przykład użycia
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("Stężenie DNA: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Całkowite DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

Najczęściej zadawane pytania

Jaka jest różnica między stężeniem DNA a czystością DNA?

Stężenie DNA odnosi się do ilości DNA obecnej w roztworze, zazwyczaj mierzonej w ng/μL lub μg/mL. Informuje cię, ile DNA masz, ale nie wskazuje na jego jakość. Czystość DNA ocenia obecność zanieczyszczeń w próbce DNA, zazwyczaj mierzona stosunkami absorbancji, takimi jak A260/A280 (dla zanieczyszczenia białkiem) i A260/A230 (dla zanieczyszczeń organicznych). Czyste DNA zazwyczaj ma stosunek A260/A280 około 1.8 i stosunek A260/A230 2.0-2.2.

Dlaczego współczynnik konwersji różni się dla DNA, RNA i białek?

Współczynniki konwersji różnią się, ponieważ każdy biomolekuł ma unikalny współczynnik ekstynkcji (zdolność do pochłaniania światła) z powodu różnej chemicznej kompozycji. DNA podwójnie spiralne ma współczynnik konwersji 50 ng/μL przy A260=1.0, podczas gdy DNA jednoniciowe wynosi 33 ng/μL, RNA 40 ng/μL, a białka (mierzone przy 280 nm) różnią się znacznie, ale średnio wynoszą około 1 mg/mL przy A280=1.0. Różnice te wynikają z różnych składów nukleotydów lub aminokwasów oraz ich właściwości absorbancji.

Jak dokładny jest spektrofotometryczny pomiar stężenia DNA?

Spektrofotometryczne określenie stężenia DNA jest zazwyczaj dokładne w zakresie liniowym (zwykle A260 między 0.1 a 1.0), z precyzją około ±3-5%. Jednak dokładność maleje przy bardzo niskich stężeniach (poniżej 5 ng/μL) i może być wpływana przez zanieczyszczenia, takie jak białka, RNA, wolne nukleotydy lub niektóre bufory. Dla bardzo dokładnych pomiarów rozcieńczonych próbek lub gdy wymagana jest wysoka czystość, zaleca się metody fluorometryczne, takie jak Qubit lub PicoGreen, które są bardziej specyficzne dla DNA podwójnie spiralnego.

Jak interpretować stosunek A260/A280?

Stosunek A260/A280 wskazuje na czystość próbki DNA w odniesieniu do zanieczyszczenia białkiem:

• Stosunek około 1.8 jest ogólnie akceptowany jako "czysty" dla DNA
• Stosunki poniżej 1.8 sugerują zanieczyszczenie białkiem
• Stosunki powyżej 2.0 mogą wskazywać na zanieczyszczenie RNA
• pH i siła jonowa roztworu mogą również wpływać na ten stosunek

Chociaż użyteczny jako kontrola jakości, stosunek A260/A280 nie gwarantuje funkcjonalnego DNA, ponieważ inne zanieczyszczenia lub degradacja DNA mogą nie wpływać na ten stosunek.

Czy mogę mierzyć stężenie DNA w kolorowych roztworach?

Mierzenie stężenia DNA w kolorowych roztworach za pomocą spektrofotometrii może być wyzwaniem, ponieważ kolor może pochłaniać przy 260 nm lub w pobliżu, zakłócając pomiar DNA. W takich przypadkach:

1. Wykonaj skanowanie długości fal (220-320 nm), aby sprawdzić, czy występują nietypowe wzorce absorbancji
2. Użyj metody fluorometrycznej, takiej jak Qubit, która jest mniej podatna na kolor próbki
3. Dalsza oczyszczenie DNA w celu usunięcia kolorowych związków
4. Zastosuj poprawki matematyczne, jeśli znany jest widmo absorbancji zakłócającego związku

Jaka jest minimalna objętość potrzebna do pomiaru stężenia DNA?

Minimalna objętość zależy od używanego instrumentu:

• Tradycyjne spektrofotometry z kuwetami zazwyczaj wymagają 50-100 μL
• Spektrofotometry do pomiaru mikroobjętości, takie jak NanoDrop, potrzebują tylko 0.5-2 μL
• Metody fluorometryczne zazwyczaj wymagają 1-20 μL próbki plus objętość odczynnika
• Czytniki mikroplacków zazwyczaj używają 100-200 μL na studzienkę

Spektrofotometry do pomiaru mikroobjętości zrewolucjonizowały ilościowe określanie DNA, umożliwiając pomiary cennych próbek przy minimalnych wymaganiach objętościowych.

Jak obliczyć współczynnik rozcieńczenia?

Współczynnik rozcieńczenia oblicza się jako:

$\text{Współczynnik rozcieńczenia} = \frac{\text{Całkowita objętość (Próbka + Rozcieńczalnik)}}{\text{Objętość próbki}}$

Na przykład:

• Jeśli dodasz 1 μL DNA do 99 μL buforu, współczynnik rozcieńczenia wynosi 100
• Jeśli dodasz 5 μL DNA do 45 μL buforu, współczynnik rozcieńczenia wynosi 10
• Jeśli używasz nierozcieńczonego DNA, współczynnik rozcieńczenia wynosi 1

Zawsze używaj tego samego buforu do rozcieńczenia, co użyto do wyzerowania spektrofotometru.

Jak przeliczać między różnymi jednostkami stężenia?

Typowe przeliczenia jednostek stężenia DNA:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM fragmentu DNA o długości 1000 bp ≈ 660 ng/μL

Aby przeliczyć z masowego stężenia (ng/μL) na stężenie molowe (nM) dla fragmentu DNA:

$\text{Stężenie (nM)} = \frac{\text{Stężenie (ng/μL)} \times 10^6}{\text{Długość DNA (bp)} \times 660}$

Co może powodować niedokładne pomiary stężenia DNA?

Kilka czynników może prowadzić do niedokładnych pomiarów stężenia DNA:

1. Zanieczyszczenie: Białka, fenol, guanidyna lub inne odczynniki ekstrakcyjne mogą wpływać na absorbancję
2. Bąbelki: Bąbelki powietrza w drodze światła mogą powodować błędne odczyty
3. Degradacja DNA: Fragmentowane DNA może mieć zmienione właściwości absorbancji
4. Niewłaściwe zerowanie: Użycie innego buforu do zerowania niż ten, który użyto do rozpuszczenia DNA
5. Niejednorodny roztwór: Niewłaściwie wymieszane roztwory DNA dają niespójne odczyty
6. Kalibracja instrumentu: Niekalibrowane lub brudne spektrofotometry produkują niewiarygodne wyniki
7. Pomiar poza zakresem liniowym: Bardzo wysokie lub bardzo niskie wartości absorbancji mogą nie być dokładne

Czy mogę użyć tego kalkulatora do stężenia RNA?

Chociaż ten kalkulator jest zoptymalizowany dla DNA podwójnie spiralnego (używając współczynnika konwersji 50 ng/μL), możesz go dostosować dla RNA, wykonując:

1. Pomiar A260 jak zwykle
2. Mnożenie przez 40 zamiast 50 (współczynnik konwersji specyficzny dla RNA)
3. Zastosowanie odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia

Wzór dla RNA byłby: $\text{Stężenie RNA (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Współczynnik rozcieńczenia}$

Bibliografia

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Gotowy do obliczenia stężenia DNA? Użyj naszego kalkulatora powyżej, aby uzyskać dokładne wyniki natychmiast. Po prostu wprowadź swój odczyt absorbancji, objętość i współczynnik rozcieńczenia, aby określić zarówno stężenie, jak i całkowitą ilość DNA w próbce.