Kihesabu cha Mkononi wa DNA

Utangulizi

Kihesabu cha Mkononi wa DNA ni chombo muhimu kwa wanabiolojia wa molekuli, wanagenetiki, na teknisheni wa maabara wanaohitaji kubaini kwa usahihi mkono wa DNA katika sampuli zao. Kupima mkono wa DNA ni utaratibu wa msingi katika maabara ya biolojia ya molekuli, ukihudumu kama hatua muhimu ya kudhibiti ubora kabla ya kuendelea na matumizi ya chini kama PCR, upigaji picha, cloning, na mbinu nyingine za molekuli. Kihesabu hiki kinatumia kanuni za spektrofotometriki ili kuhesabu mkono wa DNA kulingana na kunyonya UV katika 260nm (A260), ikitumia kipimo cha kawaida cha kubadilisha na kuzingatia yoyote ya upungufu wa sampuli ya awali.

Kihesabu chetu rafiki kwa mtumiaji kinarahisisha mchakato wa kubaini mkono (ng/μL) na kiasi cha jumla cha DNA katika sampuli yako, kikiondoa haja ya hesabu za mikono na kupunguza hatari ya makosa ya kihesabu. Iwe unajiandaa kwa sampuli za upigaji picha wa kizazi kijacho, unakadiria maandalizi ya plasmid, au unakadiria mavuno ya uondoaji wa DNA ya jenomu, chombo hiki kinatoa matokeo ya haraka na ya kuaminika kusaidia utafiti wako na michakato ya uchunguzi.

Jinsi Mkononi wa DNA Unavyohesabiwa

Kanuni ya Msingi

Hesabu ya mkono wa DNA inategemea Sheria ya Beer-Lambert, ambayo inasema kwamba kunyonya kwa suluhisho kunategemea moja kwa moja mkono wa spishi inayonyonya katika suluhisho na urefu wa njia ya mwanga kupitia suluhisho hilo. Kwa DNA yenye nyuzi mbili, kunyonya kwa 1.0 katika 260nm (A260) katika cuvette ya urefu wa cm 1 inalingana na mkono wa takriban 50 ng/μL.

Fomula

Mkononi wa DNA unahesabiwa kwa kutumia fomula ifuatayo:

$\text{Mkononi wa DNA (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Kiwango cha Upungufu}$

Ambapo:

A260 ni kipimo cha kunyonya katika 260nm
50 ni kipimo cha kawaida kwa DNA yenye nyuzi mbili (50 ng/μL kwa A260 = 1.0)
Kiwango cha Upungufu ni kiwango ambacho sampuli ya awali ilipunguzwa kwa ajili ya kipimo

Kiasi cha jumla cha DNA katika sampuli kinaweza kisha kuhesabiwa kwa:

$\text{DNA Jumla (μg)} = \frac{\text{Mkononi (ng/μL)} \times \text{Kiasi (μL)}}{1000}$

Kuelewa Vigezo

Kunyonya katika 260nm (A260):
- Hii ni kipimo cha jinsi mwanga wa UV katika wimbi la 260nm unavyonyonzwa na sampuli ya DNA
- Nucleotides za DNA (hasa msingi wa nitrojeni) hunyonya mwanga wa UV kwa kilele cha kunyonya katika 260nm
- Kadiri kunyonya kunavyoongezeka, ndivyo DNA ilivyo nyingi katika suluhisho
Kipimo cha Kubadilisha (50):
- Kipimo cha kawaida cha 50 ng/μL kinahusiana moja kwa moja na DNA yenye nyuzi mbili
- Kwa DNA yenye nyuzi moja, kipimo ni 33 ng/μL
- Kwa RNA, kipimo ni 40 ng/μL
- Kwa oligonucleotides, kipimo kinatofautiana kulingana na mfuatano
Kiwango cha Upungufu:
- Ikiwa sampuli ilipunguzwa kabla ya kipimo (mfano, sehemu 1 ya sampuli hadi sehemu 9 za buffer = kiwango cha upungufu cha 10)
- Hesabu kama: (Kiasi cha Sampuli + Kiasi cha Diluent) ÷ Kiasi cha Sampuli
- Inatumika kubaini mkono katika sampuli ya awali, isiyo na upungufu
Kiasi:
- Kiasi cha jumla cha suluhisho la DNA katika microliters (μL)
- Inatumika kuhesabu kiasi cha jumla cha DNA katika sampuli

Jinsi ya Kutumia Kihesabu Hiki

Fuata hatua hizi ili kubaini kwa usahihi mkono wa DNA yako:

Andaa Sampuli Yako:
- Hakikisha sampuli yako ya DNA imevunjika na kuchanganywa vizuri
- Ikiwa mkono unaotarajiwa ni mkubwa, andaa upungufu ili kuhakikisha kipimo kinanguka ndani ya wigo wa moja kwa moja (kawaida A260 kati ya 0.1 na 1.0)
Pima Kunyonya:
- Tumia spektrofotometer au kifaa cha nanodrop kupima kunyonya katika 260nm
- Pia pima kunyonya katika 280nm ili kutathmini usafi (uwiano wa A260/A280)
- Tumia buffer ile ile iliyotumika kuyeyusha/kupunguza DNA yako kama rejeleo la blank
Ingiza Thamani katika Kihesabu:
- Ingiza thamani ya A260 iliyopimwa katika sehemu ya "Kunyonya katika 260nm"
- Ingiza kiasi cha jumla cha suluhisho lako la DNA katika microliters
- Ingiza kiwango cha upungufu (tumia 1 ikiwa hakuna upungufu ulifanywa)
Tafsiri Matokeo:
- Kihesabu kitatoa mkono wa DNA katika ng/μL
- Kiasi cha jumla cha DNA katika sampuli kitakuwa kimeonyeshwa katika μg
- Tumia hizi thamani kubaini kiasi sahihi kinachohitajika kwa matumizi ya chini
Kadiria Usafi wa DNA (ikiwa A280 ilipimwa):
- Uwiano wa A260/A280 wa ~1.8 unadhihirisha DNA safi
- Uwiano wa chini unaweza kuashiria uchafuzi wa protini
- Uwiano wa juu unaweza kuashiria uchafuzi wa RNA

Matumizi

Kupima mkono wa DNA ni muhimu katika matumizi mengi ya biolojia ya molekuli na bioteknolojia:

Cloning ya Molekuli

Kabla ya kuunganisha vipande vya DNA kwenye vektori, kujua mkono sahihi kunaruhusu watafiti kuhesabu uwiano bora wa kuingiza-kwa-vektori, kuongeza ufanisi wa kubadilisha. Kwa mfano, uwiano wa 3:1 wa kuingiza hadi vektori mara nyingi huleta matokeo bora, ambayo yanahitaji vipimo vya sahihi vya mkono wa vipengele vyote.

PCR na qPCR

Mikondo ya PCR kwa kawaida inahitaji 1-10 ng ya DNA ya sampuli kwa uimarishaji bora. DNA kidogo sana inaweza kusababisha kushindwa kwa uimarishaji, wakati DNA nyingi sana inaweza kuzuia mchakato. Kwa PCR ya kiasi (qPCR), hata hivyo, uhesabuji sahihi wa DNA unahitajika ili kuhakikisha mikondo sahihi ya viwango vya kawaida na kuhesabu kwa uaminifu.

Upigaji Picha wa Kizazi Kijacho (NGS)

Mifumo ya maandalizi ya maktaba ya NGS inaelekeza kiasi sahihi cha DNA, mara nyingi katika wigo wa 1-500 ng kulingana na jukwaa na matumizi. Kupima mkono kwa usahihi ni muhimu kwa maandalizi ya maktaba na uwakilishi wa usawa wa sampuli katika mikondo ya upigaji picha wa multiplex.

Majaribio ya Transfection

Wakati wa kuingiza DNA katika seli za eukariyoti, kiasi bora cha DNA kinatofautiana kulingana na aina ya seli na mbinu ya transfection. Kawaida, 0.5-5 μg ya DNA ya plasmid hutumiwa kwa kila kisanduku katika muundo wa kisanduku 6, ikihitaji kupima mkono kwa usahihi ili kuandaa majaribio.

Uchambuzi wa DNA wa Kisheria

Katika matumizi ya kisheria, sampuli za DNA mara nyingi ni chache na za thamani. Kupima kwa usahihi kunaruhusu wanasayansi wa kisheria kubaini ikiwa DNA ya kutosha ipo kwa ajili ya profiling na kuandaa kiwango cha DNA kinachotumika katika uchambuzi wa baadaye.

Ukatwaji wa Enzymu za Kizuizi

Enzymu za kizuizi zina vitengo maalum vya shughuli vinavyofafanuliwa kwa μg ya DNA. Kujua mkono sahihi wa DNA kunaruhusu uwiano sahihi wa enzyme-kwa-DNA, kuhakikisha kukatwa kamili bila shughuli za nyota (kukatwa kwa kisicho sahihi).

Mbinu Mbadala za Kupima Mkono wa Spectrophotometric

Ingawa spektrofotometriki ya UV ndiyo njia ya kawaida ya kupima mkono wa DNA, mbinu kadhaa mbadala zinaweza kutumika:

Mbinu za Fluorometric:
- Rangi za fluorescent kama PicoGreen, Qubit, na SYBR Green hujishughulisha kwa maalum na DNA yenye nyuzi mbili
- Nyeti zaidi kuliko spektrofotometriki (inaweza kugundua hata 25 pg/mL)
- Kidogo inathiriwa na uchafu kama protini, RNA, au nucleotides huru
- Inahitaji fluorometer na reagents maalum
Electrophoresis ya Agarose Gel:
- DNA inaweza kupimwa kwa kulinganisha nguvu za bendi na viwango vya kujulikana
- Inatoa habari kuhusu ukubwa wa DNA na uadilifu kwa wakati mmoja
- Si sahihi kama mbinu za spektrofotometriki au fluorometric
- Inachukua muda lakini ni muhimu kwa uthibitisho wa kuona
PCR ya Wakati Halisi:
- Mbinu yenye nyeti sana ya kupima mfuatano maalum wa DNA
- Inaweza kugundua viwango vya chini sana (hadi nakala chache)
- Inahitaji primers maalum na vifaa ngumu zaidi
- Inatumika wakati uhesabuji maalum wa mfuatano unahitajika
Digital PCR:
- Uhesabuji wa moja kwa moja bila viwango vya kawaida
- Sahihi sana kwa malengo ya chini ya wingi
- Ghali na inahitaji vifaa maalum
- Inatumika kwa kugundua mabadiliko nadra na uchambuzi wa idadi ya nakala

Historia ya Kupima Mkono wa DNA

Uwezo wa kupima kwa usahihi mkono wa DNA umebadilika sana sambamba na maendeleo katika biolojia ya molekuli:

Mbinu za Awali (1950s-1960s)

Baada ya kugundua muundo wa DNA na Watson na Crick mwaka 1953, wanasayansi walianza kuendeleza mbinu za kutenga na kupima DNA. Mbinu za awali zilitegemea mbinu za colorimetric kama vile mmenyuko wa diphenylamine, ambao ulizalisha rangi ya buluu wakati wa mmenyuko na sukari za deoxyribose katika DNA. Mbinu hizi zilikuwa na usahihi wa chini na zilikuwa na uwezekano wa kuingiliwa.

Enzi ya Spectrophotometric (1970s)

Matumizi ya spektrofotometriki ya UV katika kupima asidi za nucleic yalienea sana katika miaka ya 1970. Wanasayansi waligundua kuwa DNA hunyonya mwanga wa UV kwa kiwango cha juu katika 260nm, na kwamba uhusiano kati ya kunyonya na mkono ulikuwa wa moja kwa moja ndani ya wigo fulani. Kipimo cha kubadilisha cha 50 ng/μL kwa DNA yenye nyuzi mbili katika A260 = 1.0 kilianzishwa wakati huu.

Mapinduzi ya Fluorometric (1980s-1990s)

Maendeleo ya rangi maalum za fluorescent za DNA katika miaka ya 1980 na 1990 yalibadilisha kupima mkono wa DNA, hasa kwa sampuli za chini. Rangi za Hoechst na baadaye PicoGreen ziliwezesha kugundua kwa usahihi zaidi kuliko ilivyowezekana kwa spektrofotometriki. Mbinu hizi zilikuwa muhimu sana wakati wa kuanzishwa kwa PCR, ambayo mara nyingi ilihitaji kupima kwa usahihi kiasi kidogo cha DNA.

Enzi ya Kisasa (2000s-Hadi Sasa)

Utangulizi wa spektrofotometers za microvolume kama NanoDrop mwanzoni mwa miaka ya 2000 ulibadilisha kupima mkono wa DNA wa kawaida kwa kuhitaji tu 0.5-2 μL ya sampuli. Teknolojia hii iliondoa haja ya upungufu na cuvettes, ikifanya mchakato kuwa wa haraka na rahisi.

Leo, mbinu za kisasa kama digital PCR na upigaji picha wa kizazi kijacho zimepiga hatua zaidi katika kupima mkono wa DNA, kuruhusu kupima kwa usahihi mfuatano maalum na kugundua molekuli moja. Hata hivyo, kanuni ya msingi ya spektrofotometriki iliyowekwa miongo kadhaa iliyopita inabaki kuwa msingi wa kupima mkono wa DNA wa kawaida katika maabara duniani kote.

Mifano ya Vitendo

Hebu tupitie baadhi ya mifano ya vitendo ya hesabu za mkono wa DNA:

Mfano wa 1: Maandalizi ya Plasmid ya Kawaida

Mtafiti ana plasmid iliyosafishwa na kupata vipimo vifuatavyo:

Kipimo cha A260: 0.75
Upungufu: 1:10 (kiwango cha upungufu = 10)
Kiasi cha suluhisho la DNA: 50 μL

Hesabu:

Mkono = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
DNA Jumla = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

Mfano wa 2: Uondoaji wa DNA ya Jenomu

Baada ya kutoa DNA ya jenomu kutoka kwa damu:

Kipimo cha A260: 0.15
Hakuna upungufu (kiwango cha upungufu = 1)
Kiasi cha suluhisho la DNA: 200 μL

Hesabu:

Mkono = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
DNA Jumla = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

Mfano wa 3: Kuandaa DNA kwa Upigaji Picha

Protokali ya upigaji picha inahitaji hasa 500 ng ya DNA:

Mkono wa DNA: 125 ng/μL
Kiasi kinachohitajika: 500 ng

Kiasi kinachohitajika = 500 ÷ 125 = 4 μL ya suluhisho la DNA

Mifano ya Kanuni

Hapa kuna mifano ya jinsi ya kuhesabu mkono wa DNA katika lugha mbalimbali za programu:

1' Fomula ya Excel kwa mkono wa DNA
2=A260*50*KiwangoChaUpungufu
3
4' Fomula ya Excel kwa kiasi cha DNA katika μg
5=(A260*50*KiwangoChaUpungufu*Kiasi)/1000
6
7' Mfano katika seli na A260=0.5, KiwangoChaUpungufu=2, Kiasi=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Matokeo: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Hesabu mkono wa DNA katika ng/μL
4    
5    Parameta:
6    absorbance (float): Kipimo cha kunyonya katika 260nm
7    dilution_factor (float): Kiwango cha upungufu wa sampuli
8    
9    Inarudisha:
10    float: Mkono wa DNA katika ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Hesabu kiasi cha jumla cha DNA katika μg
17    
18    Parameta:
19    concentration (float): Mkono wa DNA katika ng/μL
20    volume_ul (float): Kiasi cha suluhisho la DNA katika μL
21    
22    Inarudisha:
23    float: Kiasi cha jumla cha DNA katika μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Mfano wa matumizi
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Mkononi wa DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"DNA Jumla: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Inarudisha mkono wa DNA katika ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Inarudisha kiasi cha jumla cha DNA katika μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Mfano wa matumizi
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`Mkononi wa DNA: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`DNA Jumla: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Hesabu mkono wa DNA katika ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance Kipimo cha kunyonya katika 260nm
6     * @param dilutionFactor Kiwango cha upungufu wa sampuli
7     * @return Mkono wa DNA katika ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Hesabu kiasi cha jumla cha DNA katika μg
15     * 
16     * @param concentration Mkono wa DNA katika ng/μL
17     * @param volumeUL Kiasi cha suluhisho la DNA katika μL
18     * @return Kiasi cha jumla cha DNA katika μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("Mkononi wa DNA: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("DNA Jumla: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# Kazi ya R kwa hesabu ya mkono wa DNA
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Inarudisha mkono wa DNA katika ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Inarudisha kiasi cha jumla cha DNA katika μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Mfano wa matumizi
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("Mkononi wa DNA: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("DNA Jumla: %.2f μg\n", total_dna))
23

Maswali Yanayoulizwa Mara kwa Mara

Ni tofauti gani kati ya mkono wa DNA na usafi wa DNA?

Mkono wa DNA unarejelea kiasi cha DNA kilichopo katika suluhisho, kwa kawaida kupimwa katika ng/μL au μg/mL. Inakupa habari kuhusu kiasi cha DNA ulichonacho lakini haisemi chochote kuhusu ubora wake. Usafi wa DNA unakadiria uwepo wa uchafu katika sampuli yako ya DNA, kwa kawaida kupimwa kwa uwiano wa kunyonya kama A260/A280 (kwa uchafuzi wa protini) na A260/A230 (kwa uchafuzi wa viungio vya kikaboni). DNA safi kwa kawaida ina uwiano wa A260/A280 wa ~1.8 na uwiano wa A260/A230 wa 2.0-2.2.

Kwa nini kipimo cha kubadilisha kinatofautiana kwa DNA, RNA, na protini?

Kipimo cha kubadilisha kinatofautiana kwa sababu kila biomolekyuli ina koefisienti ya kupoteza ya kipekee (uwezo wa kunyonya mwanga) kutokana na muundo wao tofauti wa kemikali. DNA yenye nyuzi mbili ina kipimo cha kubadilisha cha 50 ng/μL kwa A260=1.0, wakati DNA yenye nyuzi moja ni 33 ng/μL, RNA ni 40 ng/μL, na protini (zinapimwa katika 280nm) zinatofautiana sana lakini zinakaribia wastani wa 1 mg/mL kwa A280=1.0. Tofauti hizi zinatokana na muundo tofauti wa nucleotides au amino acids na mali zao za kunyonya.

Je, kupima mkono wa DNA kwa kutumia spektrofotometriki kuna usahihi kiasi gani?

Kupima mkono wa DNA kwa kutumia spektrofotometriki kwa kawaida kuna usahihi ndani ya wigo wa moja kwa moja (kawaida A260 kati ya 0.1 na 1.0), na usahihi wa takriban ±3-5%. Hata hivyo, usahihi hupungua katika viwango vya chini sana (chini ya 5 ng/μL) na unaweza kuathiriwa na uchafu kama protini, RNA, nucleotides huru, au buffers fulani. Kwa vipimo vya usahihi wa juu wa sampuli za chini au wakati usafi wa juu unahitajika, mbinu za fluorometric kama Qubit au PicoGreen zinapendekezwa kwa sababu zinahusiana zaidi na DNA yenye nyuzi mbili.

Ni vipi naweza kutafsiri uwiano wa A260/A280?

Uwiano wa A260/A280 unadhihirisha usafi wa sampuli yako ya DNA kwa heshabu ya uchafuzi wa protini:

Uwiano wa ~1.8 unachukuliwa kwa kawaida kuwa "safi" kwa DNA
Uwiano chini ya 1.8 unaweza kuashiria uchafuzi wa protini
Uwiano juu ya 2.0 unaweza kuashiria uchafuzi wa RNA
pH na nguvu za ionic za suluhisho zinaweza pia kuathiri uwiano huu

Ingawa ni muhimu kama kipimo cha ubora, uwiano wa A260/A280 hauhakikishi DNA inayofanya kazi, kwani uchafuzi mwingine au uharibifu wa DNA unaweza kutokuwepo kwa uwiano huu.

Naweza kupima mkono wa DNA katika suluhisho zenye rangi?

Kupima mkono wa DNA katika suluhisho zenye rangi kwa kutumia spektrofotometriki kunaweza kuwa changamoto kwani rangi inaweza kunyonya katika au karibu na 260nm, ikingilia kati na kipimo cha DNA. Katika hali hizi:

Fanya skani ya wimbi (220-320nm) ili kuangalia mifumo isiyo ya kawaida ya kunyonya
Tumia mbinu ya fluorometric kama Qubit, ambayo inaathiriwa kidogo na rangi ya sampuli
Safisha zaidi DNA ili kuondoa viungio vya rangi
Fanya marekebisho ya kihesabu ikiwa wigo wa kunyonya wa kiungio kinachovuruga unajulikana

Ni kiasi gani cha chini kinachohitajika kwa kupima mkono wa DNA?

Kiasi cha chini kinategemea kifaa kilichotumiwa:

Spectrophotometers za jadi zenye cuvettes kwa kawaida zinahitaji 50-100 μL
Spectrophotometers za micro-volume kama NanoDrop zinahitaji tu 0.5-2 μL
Mbinu za fluorometric kwa kawaida zinahitaji 1-20 μL ya sampuli pamoja na kiasi cha reagent
Wasomaji wa microplate kwa kawaida hutumia 100-200 μL kwa kila kisanduku

Spectrophotometers za micro-volume zimebadilisha kupima mkono wa DNA kwa kawaida kwa kuruhusu vipimo vya sampuli za thamani na kiasi kidogo.

Ni vipi naweza kuhesabu kiwango cha upungufu?

Kiwango cha upungufu kinahesabiwa kama:

$\text{Kiwango cha Upungufu} = \frac{\text{Kiasi Jumla (Sampuli + Diluent)}}{\text{Kiasi cha Sampuli}}$

Kwa mfano:

Ikiwa unatumia 1 μL ya DNA kwa 99 μL ya buffer, kiwango cha upungufu ni 100
Ikiwa unatumia 5 μL ya DNA kwa 45 μL ya buffer, kiwango cha upungufu ni 10
Ikiwa unatumia DNA isiyo na upungufu, kiwango cha upungufu ni 1

Daima tumia buffer ile ile kwa upungufu kama ilivyotumika kufuta spektrofotometer.

Ni vipi naweza kubadilisha kati ya vitengo tofauti vya mkono?

Mabadiliko ya kawaida ya vitengo vya mkono wa DNA:

1 ng/μL = 1 μg/mL
1 μg/mL = 0.001 mg/mL
1 ng/μL = 1000 pg/μL
1 μM ya kipande cha DNA cha 1000 bp ≈ 660 ng/μL

Ili kubadilisha kutoka mkono wa wingi (ng/μL) hadi mkono wa molar (nM) kwa kipande cha DNA:

$\text{Mkononi (nM)} = \frac{\text{Mkononi (ng/μL)} \times 10^6}{\text{urefu wa DNA (bp)} \times 660}$

Ni nini kinaweza kusababisha vipimo vya mkono wa DNA kuwa visivyo sahihi?

Sababu kadhaa zinaweza kusababisha vipimo vya mkono wa DNA kuwa visivyo sahihi:

Uchafuzi: Protini, phenol, guanidine, au reagents zingine za uondoaji zinaweza kuathiri kunyonya
Bubbles: Bubbles za hewa katika njia ya mwanga zinaweza kusababisha vipimo visivyo sahihi
Uharibifu wa DNA: DNA iliyovunjika inaweza kuwa na mali tofauti za kunyonya
Kufuta vibaya: Kutumia buffer tofauti kwa blank kuliko ile ambayo DNA imeyeyushwa
Suluhisho lisilo na homojeni: Suluhisho za DNA zisizochanganywa vizuri zinatoa vipimo visivyo sawa
Kalibrishaji ya kifaa: Spectrophotometers zisizokalibishwa au chafu zinatoa matokeo yasiyo ya kuaminika
Vipimo vya nje ya wigo wa moja kwa moja: Thamani za juu au za chini sana za kunyonya zinaweza kuwa si sahihi

Naweza kutumia kihesabu hiki kwa mkono wa RNA?

Ingawa kihesabu hiki kimeandaliwa kwa ajili ya DNA yenye nyuzi mbili (kwa kutumia kipimo cha 50 ng/μL), unaweza kukibadilisha kwa RNA kwa:

Kupima A260 kama kawaida
Kuongeza kwa 40 badala ya 50 (kipimo maalum cha RNA)
Kutumia kipimo sahihi cha upungufu

Fomula ya RNA itakuwa: $\text{Mkononi wa RNA (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Kiwango cha Upungufu}$

Marejeleo

Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.
Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.
Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.
Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.
Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.
Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.
Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.
Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Tayari kuhesabu mkono wa DNA yako? Tumia kihesabu chetu hapo juu ili kupata matokeo sahihi mara moja. Ingiza tu kipimo chako cha kunyonya, kiasi, na kiwango cha upungufu ili kubaini mkono na kiasi cha jumla cha DNA katika sampuli yako.

Kikokoto cha Mkononi wa DNA: Badilisha A260 kuwa ng/μL

Kikokoto cha Mkononi wa DNA

Vigezo vya Kuingiza

Matokeo ya Hesabu

Uonyeshaji wa Konzentrasi

Nyaraka