آلة حاسبة لربط الحمض النووي

المقدمة

يعد ربط الحمض النووي تقنية حيوية في علم الأحياء الجزيئي تُستخدم لربط قطع الحمض النووي معًا بواسطة روابط تساهمية. تُعد آلة حاسبة لربط الحمض النووي أداة أساسية للباحثين، حيث تساعد في تحديد الكميات المثلى من الحمض النووي الناقل والحمض النووي المُدخل المطلوبة لتفاعلات الربط الناجحة. من خلال حساب النسب المولارية الصحيحة بين الحمض النووي الناقل (البلازميد) وقطع الحمض النووي المُدخل، تضمن هذه الآلة الحاسبة تجارب استنساخ جزيئي فعالة مع تقليل المواد المهدرة والتفاعلات الفاشلة.

تعتبر تفاعلات الربط أساسية للهندسة الوراثية، وعلم الأحياء الاصطناعي، وإجراءات الاستنساخ الجزيئي. فهي تسمح للعلماء بإنشاء جزيئات الحمض النووي المؤتلف عن طريق إدخال جينات معينة في الناقلات البلازميدية لتحويلها بعد ذلك إلى الكائنات الحية المضيفة. يعتمد نجاح هذه التفاعلات بشكل كبير على استخدام الكميات المناسبة من مكونات الحمض النووي، وهو ما تساعد هذه الآلة الحاسبة في تحديده بدقة.

سواء كنت تقوم بإنشاء ناقلات تعبير، أو إنشاء مكتبات جينية، أو إجراء استنساخ روتيني، ستساعدك آلة حاسبة ربط الحمض النووي هذه في تحسين ظروف تجربتك وزيادة معدل نجاحك. من خلال إدخال بعض المعلمات الرئيسية حول عينات الحمض النووي الخاصة بك، يمكنك بسرعة الحصول على الأحجام الدقيقة المطلوبة لتفاعل الربط المحدد لديك.

الصيغة / الحساب

تستخدم آلة حاسبة ربط الحمض النووي صيغة أساسية في علم الأحياء الجزيئي تأخذ في الاعتبار الأحجام والتركيزات المختلفة لقطع الحمض النووي التي يتم ربطها. يتم حساب الكمية الأساسية المطلوبة من الحمض النووي المُدخل بالنسبة إلى الحمض النووي الناقل بناءً على أطوالهما والنسبة المولارية المطلوبة.

حساب كمية المُدخل

يتم حساب كمية الحمض النووي المُدخل المطلوبة (بالنانوجرام) باستخدام الصيغة التالية:

$\text{ng من المُدخل} = \text{ng من الناقل} \times \frac{\text{حجم المُدخل بالكيلا قاعدة}}{\text{حجم الناقل بالكيلا قاعدة}} \times \text{النسبة المولارية}$

حيث:

• ng من الناقل = كمية الحمض النووي الناقل المستخدمة في التفاعل (عادة 50-100 نانوغرام)
• حجم المُدخل بالكيلا قاعدة = طول قطعة الحمض النووي المُدخل بالكيلا قاعدة (kb)
• حجم الناقل بالكيلا قاعدة = طول الحمض النووي الناقل بالكيلا قاعدة (kb)
• النسبة المولارية = النسبة المطلوبة من جزيئات المُدخل إلى جزيئات الناقل (عادة 3:1 إلى 5:1)

حسابات الحجم

بمجرد تحديد الكمية المطلوبة من الحمض النووي المُدخل، يتم حساب الأحجام المطلوبة للتفاعل:

$\text{حجم الناقل (ميكرولتر)} = \frac{\text{ng من الناقل}}{\text{تركيز الناقل (ng/ميكرولتر)}}$

$\text{حجم المُدخل (ميكرولتر)} = \frac{\text{ng من المُدخل}}{\text{تركيز المُدخل (ng/ميكرولتر)}}$

$\text{حجم المحلول/الماء (ميكرولتر)} = \text{إجمالي حجم التفاعل (ميكرولتر)} - \text{حجم الناقل (ميكرولتر)} - \text{حجم المُدخل (ميكرولتر)}$

مثال على الحساب

دعنا نعمل من خلال مثال عملي:

• تركيز الناقل: 50 ng/ميكرولتر
• طول الناقل: 3000 قاعدة (3 kb)
• تركيز المُدخل: 25 ng/ميكرولتر
• طول المُدخل: 1000 قاعدة (1 kb)
• النسبة المولارية المطلوبة (مُدخل:ناقل): 3:1
• إجمالي حجم التفاعل: 20 ميكرولتر
• كمية الناقل المستخدمة: 50 ng

الخطوة 1: حساب الكمية المطلوبة من المُدخل $\text{ng من المُدخل} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

الخطوة 2: حساب الأحجام $\text{حجم الناقل} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/ميكرولتر}} = 1 \text{ ميكرولتر}$

$\text{حجم المُدخل} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/ميكرولتر}} = 2 \text{ ميكرولتر}$

$\text{حجم المحلول/الماء} = 20 \text{ ميكرولتر} - 1 \text{ ميكرولتر} - 2 \text{ ميكرولتر} = 17 \text{ ميكرولتر}$

يضمن هذا الحساب وجود ثلاث جزيئات مُدخل مقابل كل جزيء ناقل في التفاعل، مما يزيد من فرص الربط الناجح.

دليل خطوة بخطوة لاستخدام الآلة الحاسبة

تم تصميم آلة حاسبة ربط الحمض النووي لدينا لتكون بديهية وسهلة الاستخدام. اتبع هذه الخطوات لحساب الأحجام المثلى لتفاعل الربط الخاص بك:

1. أدخل معلومات الناقل:

   • أدخل تركيز الناقل لديك بالـ ng/ميكرولتر
   • أدخل طول الناقل بالقاعدة (bp)
   • حدد كمية الحمض النووي الناقل الذي تريد استخدامه في التفاعل (ng)

2. أدخل معلومات المُدخل:

   • أدخل تركيز المُدخل لديك بالـ ng/ميكرولتر
   • أدخل طول المُدخل بالقاعدة (bp)

3. حدد معلمات التفاعل:

   • حدد النسبة المولارية المطلوبة (مُدخل:ناقل) - عادة بين 3:1 و 5:1
   • أدخل إجمالي حجم التفاعل بالميكرولتر (عادة 10-20 ميكرولتر)

4. عرض النتائج:

   • ستعرض الآلة الحاسبة تلقائيًا:
     • حجم الناقل المطلوب (ميكرولتر)
     • حجم المُدخل المطلوب (ميكرولتر)
     • حجم المحلول/الماء المطلوب (ميكرولتر)
     • إجمالي حجم التفاعل (ميكرولتر)
     • كمية الناقل والمُدخل في التفاعل (ng)

5. نسخ النتائج (اختياري):

   • استخدم زر "نسخ النتائج" لنسخ جميع الحسابات إلى الحافظة الخاصة بك لمفكرة المختبر أو البروتوكولات الخاصة بك

تقوم الآلة الحاسبة بإجراء فحوصات للتحقق من صحة المدخلات لضمان أن جميع المدخلات هي أرقام موجبة وأن الحجم الإجمالي كافٍ للأحجام المطلوبة من الحمض النووي. إذا تم اكتشاف أي أخطاء، ستوجهك رسائل الخطأ المفيدة لتصحيح المدخلات.

حالات الاستخدام

تعد آلة حاسبة ربط الحمض النووي قيمة عبر العديد من التطبيقات في علم الأحياء الجزيئي:

الاستنساخ الجزيئي

تتمثل الحالة الأكثر شيوعًا في الاستنساخ الجزيئي القياسي، حيث يقوم الباحثون بإدخال جينات أو قطع من الحمض النووي في ناقلات بلازميد. تضمن الآلة الحاسبة ظروفًا مثلى لـ:

• استنساخ الجينات بين ناقلات التعبير المختلفة
• إنشاء بروتينات اندماجية عن طريق ربط عدة قطع جينية
• بناء تجارب جينات التقرير
• إنشاء مكتبات البلازميد

علم الأحياء الاصطناعي

في علم الأحياء الاصطناعي، حيث يتم تجميع عدة قطع من الحمض النووي غالبًا:

• تستفيد تفاعلات تجميع جيبسون من النسب الدقيقة بين المُدخل والناقل
• تتطلب أنظمة تجميع غولدن غيت تركيزات محددة من الحمض النووي
• تجميع أجزاء جينية معيارية (BioBrick)
• بناء دوائر جينية اصطناعية

تطوير مجموعات التشخيص

عند تطوير أدوات التشخيص الجزيئي:

• استنساخ علامات جينية محددة للأمراض
• إنشاء بلازميدات تحكم إيجابية
• تطوير معايير المعايرة لـ qPCR

أنظمة التعبير البروتيني

للباحثين الذين يعملون على إنتاج البروتين:

• تحسين النسب بين المُدخل والناقل من أجل ناقلات التعبير عالية النسخ
• إنشاء أنظمة تعبير قابلة للتحريض
• إنشاء ناقلات إفراز لتنقية البروتين

تطبيقات كريسبر-كاس9

في تطبيقات تحرير الجينوم:

• استنساخ RNA الدليل في ناقلات كريسبر
• إنشاء قوالب مانحة للتصحيح الموجه بالتماثل
• بناء مكتبات من RNA الدليل للاختبار

الربط الصعب

تعد الآلة الحاسبة ذات قيمة خاصة في سيناريوهات الربط الصعبة:

• استنساخ المُدخلات الكبيرة (>5 kb)
• إدخال قطع صغيرة جدًا (<100 bp)
• الربط بنهايات مسطحة التي لها كفاءة أقل
• تفاعلات التجميع متعددة القطع

البدائل

بينما توفر آلة حاسبة ربط الحمض النووي لدينا حسابات دقيقة لتفاعلات الربط التقليدية، توجد عدة طرق بديلة لربط قطع الحمض النووي:

1. تجميع جيبسون: يستخدم إنزيمات إزالة النهايات، والبلمرة، والربط في تفاعل واحد، مما يسمح بربط قطع الحمض النووي المتداخلة. لا يلزم حساب الربط التقليدي، لكن النسب التركيزية لا تزال مهمة.

2. تجميع غولدن غيت: يستخدم إنزيمات تقييد من النوع IIS للتجميع الاتجاهي، بدون ندبة، لعدة قطع. يتطلب كميات متساوية من جميع القطع.

3. SLIC (الاستنساخ المستقل عن الربط): يستخدم إنزيمات إزالة النهايات لإنشاء نهايات مفردة تتداخل معًا. عادةً ما يستخدم نسبًا متساوية من القطع.

4. تجميع In-Fusion: نظام تجاري يسمح بربط القطع مع تداخلات 15 قاعدة. يستخدم نسبة محددة بناءً على أحجام القطع.

5. تجميع Gateway: يستخدم إعادة التركيب المحددة للموقع بدلاً من الربط. يتطلب ناقلات دخول ووجهة محددة.

6. الاختبار التجريبي: يفضل بعض المختبرات إعداد تفاعلات ربط متعددة مع نسب مُدخل:ناقل مختلفة (1:1، 3:1، 5:1، 10:1) وتحديد أيها يعمل بشكل أفضل لتركباتهم المحددة.

7. حاسبات البرمجيات: تتضمن حزم البرمجيات التجارية مثل Vector NTI وSnapGene آلات حاسبة للربط مع ميزات إضافية مثل تحليل مواقع التقييد.

التاريخ

تواكب تطوير حسابات ربط الحمض النووي تطور تقنيات الاستنساخ الجزيئي، التي أحدثت ثورة في علم الأحياء الجزيئي والتكنولوجيا الحيوية.

التطورات المبكرة (السبعينيات)

ظهر مفهوم ربط الحمض النووي للاستنساخ الجزيئي في أوائل السبعينيات مع الأعمال الرائدة لبول بيرغ، وهيربرت بوير، وستانلي كوهين، الذين طوروا أول جزيئات حمض نووي مؤتلف. خلال هذه الفترة، كانت تفاعلات الربط تعتمد إلى حد كبير على التجربة والخطأ، حيث استخدم الباحثون التجربة لتحديد الظروف المثلى.

أدى اكتشاف إنزيمات التقييد وإنزيم الربط إلى توفير الأدوات الأساسية لقص وإعادة ربط جزيئات الحمض النووي. أصبح إنزيم T4 DNA ligase، المعزول من بكتيريا E. coli المصابة بفيروس T4، هو الإنزيم القياسي لربط قطع الحمض النووي بسبب قدرته على ربط النهايات المسطحة والمتماسكة.

فترة التحسين (1980-1990)

مع تحول الاستنساخ الجزيئي إلى إجراء روتيني، بدأ الباحثون في تطوير أساليب أكثر منهجية لتفاعلات الربط. أصبح من الواضح أهمية النسب المولارية بين الحمض النووي الناقل والمُدخل، مما أدى إلى تطوير الصيغة الأساسية المستخدمة حتى اليوم.

خلال هذه الفترة، أسس الباحثون أن استخدام كمية زائدة من الحمض النووي المُدخل (عادةً 3:1 إلى 5:1 نسبة مولارية من المُدخل إلى الناقل) يحسن عمومًا كفاءة الربط لتطبيقات الاستنساخ القياسية. تم تبادل هذه المعرفة في البداية من خلال بروتوكولات المختبر، وشيئًا فشيئًا أصبحت جزءًا من الأدلة والكتب المدرسية في علم الأحياء الجزيئي.

العصر الحديث (2000-الحاضر)

أدى ظهور الأدوات الحاسوبية والآلات الحاسبة عبر الإنترنت في العقد الأول من القرن الحادي والعشرين إلى جعل الحسابات الدقيقة للربط أكثر سهولة للباحثين. مع تطور تقنيات علم الأحياء الجزيئي، أصبحت الحاجة إلى الحسابات الدقيقة أكثر أهمية، خاصة للمشاريع الاستنساخية الصعبة التي تتضمن عدة قطع أو مُدخلات كبيرة.

اليوم، تُعتبر حسابات ربط الحمض النووي جزءًا لا يتجزأ من سير العمل في الاستنساخ الجزيئي، حيث تساعد الآلات الحاسبة المخصصة مثل هذه في تحسين تجارب الباحثين. ظلت الصيغة الأساسية دون تغيير إلى حد كبير، على الرغم من أن فهمنا للعوامل التي تؤثر على كفاءة الربط قد تحسن.

لقد أدت ظهور طرق الاستنساخ البديلة مثل تجميع جيبسون وتجميع غولدن غيت إلى إدخال احتياجات حسابية جديدة، لكن المفهوم الأساسي للنسب المولارية بين قطع الحمض النووي لا يزال مهمًا عبر هذه التقنيات.

أمثلة على الكود

إليك تطبيقات آلة حاسبة ربط الحمض النووي بلغات برمجة مختلفة:

1' دالة VBA في Excel لآلة حاسبة ربط الحمض النووي
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' حساب الكمية المطلوبة من المُدخل بالنانوجرام
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' حساب حجم الناقل بالميكرولتر
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' حساب حجم المُدخل بالميكرولتر
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' حساب حجم المحلول/الماء بالميكرولتر
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' مثال على الاستخدام في خلية:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    حساب الأحجام لتفاعل ربط الحمض النووي.
5    
6    المعلمات:
7    vector_concentration (float): تركيز الحمض النووي الناقل بالـ ng/ميكرولتر
8    vector_length (float): طول الحمض النووي الناقل بالقاعدة
9    insert_concentration (float): تركيز الحمض النووي المُدخل بالـ ng/ميكرولتر
10    insert_length (float): طول الحمض النووي المُدخل بالقاعدة
11    molar_ratio (float): النسبة المولارية المطلوبة من المُدخل:الناقل
12    total_volume (float): إجمالي حجم التفاعل بالميكرولتر
13    vector_amount (float): كمية الحمض النووي الناقل لاستخدامها بالـ ng (افتراضي: 50)
14    
15    العائدات:
16    dict: قاموس يحتوي على الأحجام والكميات المحسوبة
17    """
18    # حساب حجم الناقل
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # حساب حجم المُدخل
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # حساب حجم المحلول/الماء
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# مثال على الاستخدام
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"الناقل: {result['vector_volume']} ميكرولتر ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"المُدخل: {result['insert_volume']} ميكرولتر ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"المحلول: {result['buffer_volume']} ميكرولتر")
53print(f"الإجمالي: 20 ميكرولتر")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // تحويل الأطوال إلى kb للحساب
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // حساب الأحجام
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// مثال على الاستخدام
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`الناقل: ${result.vectorVolume} ميكرولتر (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`المُدخل: ${result.insertVolume} ميكرولتر (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`المحلول: ${result.bufferVolume} ميكرولتر`);
29console.log(`الإجمالي: 20 ميكرولتر`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // تحويل الأطوال إلى kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // حساب الأحجام
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // التقريب إلى منزلتين عشريتين
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("الناقل: %.2f ميكرولتر (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("المُدخل: %.2f ميكرولتر (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("المحلول: %.2f ميكرولتر%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("الإجمالي: 20 ميكرولتر%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // تحويل الأطوال إلى kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // حساب الأحجام
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // التقريب إلى منزلتين عشريتين
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "الناقل: " << result.vectorVolume << " ميكرولتر (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "المُدخل: " << result.insertVolume << " ميكرولتر (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "المحلول: " << result.bufferVolume << " ميكرولتر" << std::endl;
46    std::cout << "الإجمالي: 20 ميكرولتر" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

الأسئلة الشائعة (FAQ)

ما هي النسبة المولارية المثلى لربط الحمض النووي؟

تتراوح النسبة المولارية المثلى للمُدخل إلى الناقل عادةً بين 3:1 و 5:1 لتطبيقات الربط القياسية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف هذه النسبة اعتمادًا على السيناريو المحدد للربط:

• للربط بنهايات متماسكة: 3:1 إلى 5:1
• للربط بنهايات مسطحة: 1:1 إلى 3:1
• للمُدخلات الكبيرة (>10 kb): 1:1 إلى 2:1
• للمُدخلات الصغيرة (<500 bp): 5:1 إلى 10:1
• لتجميع متعدد القطع: 3:1 لكل مُدخل إلى ناقل

لماذا تفشل تفاعل الربط الخاص بي على الرغم من استخدام الأحجام المحسوبة؟

يمكن أن تؤثر عدة عوامل على كفاءة الربط بخلاف النسبة المولارية:

1. جودة الحمض النووي: تأكد من أن كلا من الناقل والمُدخل لهما نهايات نظيفة دون تلف
2. إزالة الفوسفات: تحقق مما إذا كان قد تم إزالة الفوسفات من الناقل، مما يمنع الربط الذاتي
3. نشاط الإنزيم: تحقق من أن إنزيم الربط نشط ويستخدم في درجة الحرارة الصحيحة
4. وقت الحضانة: تستفيد بعض تفاعلات الربط من وقت حضانة أطول (بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية)
5. ظروف المحلول: تأكد من استخدام المحلول الصحيح مع ATP
6. الملوثات: قم بتنقية الحمض النووي لإزالة المثبطات مثل EDTA أو الملح العالي

كم يجب أن أستخدم من الحمض النووي الناقل في تفاعل الربط؟

عادةً ما يُوصى باستخدام 50-100 نانوغرام من الحمض النووي الناقل لتفاعلات الربط القياسية. يمكن أن يؤدي استخدام كمية كبيرة جدًا من الناقل إلى زيادة الخلفية من الناقل غير المقطوع أو الربط الذاتي، بينما قد يقلل القليل جدًا من كفاءة التحويل. قد تحتاج إلى تحسين هذه الكمية لتفاعلات الربط الصعبة.

هل يجب أن أعدل الحسابات للربط بنهايات مسطحة مقابل النهايات المتماسكة؟

نعم. تعتبر الربطات بنهايات مسطحة عمومًا أقل كفاءة من الربطات بنهايات متماسكة. بالنسبة للربط بنهايات مسطحة، استخدم:

• نسب أعلى من المُدخل (3:1 إلى 5:1 أو حتى أعلى)
• المزيد من T4 DNA ligase (عادةً 2-3 مرات أكثر)
• أوقات حضانة أطول
• النظر في إضافة PEG لتعزيز كفاءة الربط

كيف أحسب الربط لعدة مُدخلات؟

لتجميع عدة قطع:

1. احسب كل كمية مُدخل بشكل فردي باستخدام نفس الصيغة
2. حافظ على نفس النسبة المولارية الإجمالية (على سبيل المثال، لمُدخلين، استخدم 1.5:1.5:1 مُدخل1:مُدخل2:ناقل)
3. اضبط إجمالي حجم التفاعل لاستيعاب جميع قطع الحمض النووي
4. اعتبر الربط المتسلسل أو استخدام طرق مثل تجميع جيبسون لعدة قطع

هل يمكنني استخدام هذه الآلة الحاسبة لتجميع جيبسون أو تجميع غولدن غيت؟

تم تصميم هذه الآلة الحاسبة خصيصًا لتفاعلات الربط التقليدية باستخدام إنزيمات التقييد والربط. لتجميع جيبسون، عادةً ما يُوصى بكميات متساوية من جميع القطع (نسبة 1:1)، على الرغم من أن الحساب الأساسي لكمية الحمض النووي بناءً على الطول مشابه. بالنسبة لتجميع غولدن غيت، تُستخدم أيضًا نسب متساوية من جميع المكونات.

كيف يمكنني حساب إزالة الفوسفات للناقل في حساباتي؟

لا تؤثر إزالة الفوسفات من الناقل (إزالة مجموعات الفوسفات 5') على حسابات الكمية، ولكن بالنسبة للناقلات التي تم إزالة الفوسفات منها:

1. استخدم الحمض النووي المُدخل الطازج مع مجموعات الفوسفات 5' سليمة
2. اعتبر استخدام نسب أعلى قليلاً من المُدخل:الناقل (4:1 إلى 6:1)
3. تأكد من أوقات الربط الأطول (على الأقل ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية)

ما هو الحد الأدنى لحجم التفاعل الإجمالي الذي يجب أن أستخدمه؟

عادةً ما يكون الحد الأدنى لحجم التفاعل العملي حوالي 10 ميكرولتر، مما يسمح بخلط كافٍ ويمنع مشاكل التبخر. إذا تجاوزت الأحجام المحسوبة من الحمض النووي الحجم المطلوب، لديك عدة خيارات:

1. استخدم عينات الحمض النووي بتركيز أعلى
2. قلل من كمية الناقل المستخدمة (على سبيل المثال، 25 ng بدلاً من 50 ng)
3. زد من إجمالي حجم التفاعل
4. اعتبر تركيز عينات الحمض النووي الخاصة بك

كم من الوقت يجب أن أحضن تفاعل الربط الخاص بي؟

تختلف أوقات الحضانة المثلى بناءً على نوع الربط:

• الربط بنهايات متماسكة: ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) أو 4-16 ساعة عند 16 درجة مئوية
• الربط بنهايات مسطحة: 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) عند 16 درجة مئوية
• الربط السريع (باستخدام إنزيم الربط عالي التركيز): 5-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة

هل يمكنني إعادة استخدام تفاعل الربط المتبقي للتحويل؟

نعم، يمكن عادةً تخزين خلطات الربط عند -20 درجة مئوية وإعادة استخدامها للتحويل. ومع ذلك، قد تقلل كل دورة تجميد-ذوبان من الكفاءة. للحصول على أفضل النتائج:

1. قم بتقسيم خليط الربط قبل التجميد
2. قم بتسخين الإنزيم (65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق) قبل التخزين
3. استخدمه في غضون 1-2 شهر للحصول على أفضل النتائج

المراجع

1. سامبروك ج، راسل د. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر (الطبعة الثالثة). مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور.

2. غرين م. ر، سامبروك ج. (2012). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر (الطبعة الرابعة). مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور.

3. إنجلر ج، كاندزيا ر، ماريونيت س. (2008). طريقة تجميع دقيقة، خطوة واحدة، مع قدرة عالية على الإنتاج. PLoS ONE، 3(11)، e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. جيبسون د. ج، يونغ ل، تشوانغ ر. ي، فينتر ج. س، هوتشيسون ج. أ، سميث ه. أ. (2009). التجميع الإنزيمي لجزيئات الحمض النووي حتى عدة مئات من الكيلوباز. طرق الطبيعة، 6(5)، 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. أسلانيديس ج، دي جونغ ب. ج. (1990). الاستنساخ المستقل عن الربط لمنتجات PCR (LIC-PCR). أبحاث الأحماض النووية، 18(20)، 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. زيمرمان س. ب، فيفير ب. ه. (1983). يسمح الازدحام الجزيئي بالربط بنهايات مسطحة بواسطة إنزيمات الربط من كبد الجرذ أو الإشريكية القولونية. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، 80(19)، 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - مرجع علم الأحياء الجزيئي. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. نيو إنجلاند بيولوجي (NEB) - بروتوكول الربط الحمضي النووي. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. ثيرمو فيشر العلمية - مرجع تقني للاستنساخ الجزيئي. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. بروميجا - دليل تقني للاستنساخ. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/