Calculadora de Lligadura de DNA

Introducció

La lligadura de DNA és una tècnica crítica de biologia molecular utilitzada per unir fragments de DNA mitjançant enllaços covalents. La Calculadora de Lligadura de DNA és una eina essencial per als investigadors, ajudant a determinar les quantitats òptimes de DNA de vector i insert necessari per a reaccions de lligadura exitoses. Mitjançant el càlcul de les proporcions molars correctes entre el vector (plasmid) i els fragments de DNA d'inserció, aquesta calculadora assegura experiments d'clonació molecular eficients mentre minimitza els reactius malgastats i les reaccions fallides.

Les reaccions de lligadura són fonamentals per a l'enginyeria genètica, la biologia sintètica i els procediments de clonació molecular. Permeten als científics crear molècules de DNA recombinants inserint gens d'interès en vectors de plasmid per a la seva posterior transformació en organismes hoste. L'èxit d'aquestes reaccions depèn en gran mesura de l'ús de les quantitats apropiades de components de DNA, que és precisament el que aquesta calculadora ajuda a determinar.

Ja sigui que estiguis construint vectors d'expressió, creant biblioteques de gens o realitzant subclonacions rutinàries, aquesta calculadora de lligadura de DNA t'ajudarà a optimitzar les teves condicions experimentals i augmentar la teva taxa d'èxit. Mitjançant la introducció d'uns quants paràmetres clau sobre les teves mostres de DNA, pots obtenir ràpidament els volums exactes necessaris per a la teva reacció de lligadura específica.

Fórmula/Càlcul

La calculadora de lligadura de DNA utilitza una fórmula fonamental de biologia molecular que té en compte les diferents mides i concentracions dels fragments de DNA que s'uneixen. El càlcul principal determina quanta quantitat de DNA d'inserció es necessita en relació amb el DNA de vector en funció de les seves respectives llargades i la proporció molar desitjada.

Càlcul de la Quantitat d'Inserció

La quantitat de DNA d'inserció necessària (en nanograms) es calcula mitjançant la següent fórmula:

$\text{ng d'inserció} = \text{ng de vector} \times \frac{\text{kb de mida d'inserció}}{\text{kb de mida de vector}} \times \text{proporció molar}$

On:

• ng de vector = quantitat de DNA de vector utilitzada en la reacció (normalment 50-100 ng)
• kb de mida d'inserció = longitud del fragment de DNA d'inserció en kilobases (kb)
• kb de mida de vector = longitud del DNA de vector en kilobases (kb)
• proporció molar = proporció desitjada de molècules d'inserció a molècules de vector (normalment 3:1 a 5:1)

Càlculs de Volum

Un cop determinada la quantitat requerida de DNA d'inserció, es calculen els volums necessaris per a la reacció:

$\text{Volum de vector (μL)} = \frac{\text{ng de vector}}{\text{concentració de vector (ng/μL)}}$

$\text{Volum d'inserció (μL)} = \frac{\text{ng d'inserció}}{\text{concentració d'inserció (ng/μL)}}$

$\text{Volum de buffer/aigua (μL)} = \text{Volum total de reacció (μL)} - \text{Volum de vector (μL)} - \text{Volum d'inserció (μL)}$

Exemple de Càlcul

Anem a treballar un exemple pràctic:

• Concentració de vector: 50 ng/μL
• Longitud de vector: 3000 bp (3 kb)
• Concentració d'inserció: 25 ng/μL
• Longitud d'inserció: 1000 bp (1 kb)
• Proporció molar desitjada (inserció:vector): 3:1
• Volum total de reacció: 20 μL
• Quantitat de vector a utilitzar: 50 ng

Pas 1: Calcular la quantitat d'inserció necessària $\text{ng d'inserció} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Pas 2: Calcular els volums $\text{Volum de vector} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Volum d'inserció} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Volum de buffer/aigua} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Aquest càlcul assegura que hi ha tres molècules d'inserció per cada molècula de vector en la reacció, optimitzant les possibilitats d'una lligadura exitosa.

Guia Pas a Pas per Utilitzar la Calculadora

La nostra calculadora de lligadura de DNA està dissenyada per ser intuïtiva i senzilla. Segueix aquests passos per calcular els volums òptims per a la teva reacció de lligadura:

1. Introdueix la Informació del Vector:

   • Introduïu la concentració del vostre vector en ng/μL
   • Introduïu la longitud del vector en parells de bases (bp)
   • Especifiqueu la quantitat de DNA de vector que voleu utilitzar en la reacció (ng)

2. Introdueix la Informació de l'Inserció:

   • Introduïu la concentració del vostre inserit en ng/μL
   • Introduïu la longitud de l'inserit en parells de bases (bp)

3. Estableix els Paràmetres de Reacció:

   • Especifiqueu la proporció molar desitjada (inserció:vector) - normalment entre 3:1 i 5:1
   • Introduïu el volum total de reacció en μL (normalment 10-20 μL)

4. Veure Resultats:

   • La calculadora mostrarà automàticament:
     • Volum de vector requerit (μL)
     • Volum d'inserció requerit (μL)
     • Volum de buffer/aigua a afegir (μL)
     • Volum total de reacció (μL)
     • Quantitat de DNA de vector i inserció en la reacció (ng)

5. Copia Resultats (opcional):

   • Utilitzeu el botó "Copia Resultats" per copiar tots els càlculs al vostre porta-bloc o protocols de laboratori

La calculadora realitza verificacions de validació per assegurar-se que totes les entrades són números positius i que el volum total és suficient per als volums de DNA requerits. Si es detecten errors, missatges d'error útils us guiaran per corregir les entrades.

Casos d'Ús

La calculadora de lligadura de DNA és valuosa en nombroses aplicacions de biologia molecular:

Clonació Molecular

El cas d'ús més comú és la clonació molecular estàndard, on els investigadors inserten gens o fragments de DNA en vectors de plasmid. La calculadora assegura condicions òptimes per a:

• Subclonació de gens entre diferents vectors d'expressió
• Creació de proteïnes de fusió unint múltiples fragments de gens
• Construcció d'assajos de gens reportadors
• Construcció de biblioteques de plasmids

Biologia Sintètica

En biologia sintètica, on sovint s'assemblen múltiples fragments de DNA:

• Les reaccions de Gibson Assembly es beneficien de proporcions precises d'inserció:vector
• Els sistemes d'assemblatge Golden Gate requereixen concentracions específiques de DNA
• Assemblatge de BioBrick de parts genètiques estàndarditzades
• Construcció de circuits genètics sintètics

Desenvolupament de Kits Diagnòstics

En el desenvolupament d'eines diagnòstiques moleculars:

• Clonació de marcadors genètics específics de malalties
• Construcció de plasmids de control positiu
• Desenvolupament d'estàndards de calibratge per a qPCR

Sistemes d'Expressió de Proteïnes

Per a investigadors que treballen en la producció de proteïnes:

• Optimització de proporcions d'inserció:vector per a vectors d'expressió d'alta còpia
• Construcció de sistemes d'expressió inducibles
• Creació de vectors de secreció per a la purificació de proteïnes

Aplicacions de CRISPR-Cas9

En aplicacions d'edició genòmica:

• Clonació d'ARNs guia en vectors CRISPR
• Creació de plantilles d'aportació per a reparació dirigida per homologia
• Construcció de biblioteques d'ARNs guia per a cribratge

Lligadures Desafiadores

La calculadora és particularment valuosa per a escenaris de lligadura desafiadors:

• Clonació d'inserts grans (>5 kb)
• Insercions de fragments molt petits (<100 bp)
• Lligadures d'extrems plans que tenen una eficàcia inferior
• Reaccions d'assemblatge de múltiples fragments

Alternatives

Si bé la nostra calculadora de lligadura de DNA proporciona càlculs precisos per a reaccions de lligadura tradicionals, existeixen diversos enfocaments alternatius per unir fragments de DNA:

1. Gibson Assembly: Utilitza exonuclease, polimerasa i ligasa en una reacció d'un sol tub per unir fragments de DNA superposats. No es necessita càlcul de lligadura tradicional, però les proporcions de concentració segueixen sent importants.

2. Assemblatge Golden Gate: Utilitza enzims de restricció tipus IIS per a l'assemblatge direccional i sense cicatrius de múltiples fragments. Requereix quantitats equimolars de tots els fragments.

3. SLIC (Clonació Independent de Lligadura i Seqüència): Utilitza exonuclease per crear sobresortides d'una sola cadena que s'anneguen juntes. Normalment utilitza proporcions equimolars de fragments.

4. In-Fusion Cloning: Sistema comercial que permet unir fragments amb superposicions de 15 bp. Utilitza una proporció específica basada en les mides dels fragments.

5. Gateway Cloning: Utilitza recombinació específica de llocs en comptes de lligadura. Requereix vectors d'entrada i destinació específics.

6. Proves Empíriques: Algunes laboratoris prefereixen configurar múltiples reaccions de lligadura amb diferents proporcions d'inserció:vector (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) i determinar quina funciona millor per als seus constructes específics.

7. Calculadores de Programari: Paquets de programari comercials com Vector NTI i SnapGene inclouen calculadores de lligadura amb característiques addicionals com l'anàlisi de llocs de restricció.

Història

El desenvolupament dels càlculs de lligadura de DNA paral·lels l'evolució de les tècniques de clonació molecular, que han revolucionat la biologia molecular i la biotecnologia.

Primeres Desenvolupaments (1970)

El concepte de lligadura de DNA per a la clonació molecular va emergir a principis dels anys 70 amb el treball pioner de Paul Berg, Herbert Boyer i Stanley Cohen, que van desenvolupar les primeres molècules de DNA recombinants. Durant aquest període, les reaccions de lligadura eren en gran mesura empíriques, amb investigadors utilitzant el mètode d'assaig i error per determinar les condicions òptimes.

El descobriment d'enzims de restricció i DNA ligasa va proporcionar les eines essencials per tallar i tornar a unir molècules de DNA. La T4 DNA ligasa, aïllada d'E. coli infectades pel bacteriòfag T4, es va convertir en l'enzim estàndard per unir fragments de DNA gràcies a la seva capacitat per lligar tant extrems plans com cohesius.

Període de Refinament (1980-1990)

A mesura que la clonació molecular es va convertir en una pràctica més rutinària, els investigadors van començar a desenvolupar enfocaments més sistemàtics per a les reaccions de lligadura. La importància de les proporcions molars entre el DNA de vector i d'inserció es va fer evident, portant al desenvolupament de la fórmula bàsica que s'utilitza encara avui.

Durant aquest període, els investigadors van establir que un excés de DNA d'inserció (normalment una proporció de 3:1 a 5:1) millora generalment l'eficiència de lligadura per a aplicacions de clonació estàndard. Aquest coneixement es va compartir inicialment a través de protocols de laboratori i va arribar gradualment als manuals i llibres de text de biologia molecular.

Era Moderna (2000-Actualitat)

L'aparició d'eines computacionals i calculadores en línia als anys 2000 va fer que els càlculs precisos de lligadura fossin més accessibles per als investigadors. A mesura que les tècniques de biologia molecular es van fer més sofisticades, la necessitat de càlculs precisos es va fer més crítica, especialment per a projectes de clonació desafiadors que impliquen múltiples fragments o inserts grans.

Avui dia, els càlculs de lligadura de DNA són una part integral dels fluxos de treball de clonació molecular, amb calculadores dedicades com aquesta ajudant els investigadors a optimitzar els seus experiments. La fórmula bàsica ha romàs en gran mesura inalterada, tot i que la nostra comprensió dels factors que afecten l'eficiència de la lligadura ha millorat.

L'emergència de mètodes de clonació alternatius com Gibson Assembly i Golden Gate cloning ha introduït noves necessitats de càlcul, però el concepte fonamental de proporcions molars entre fragments de DNA continua sent important a través d'aquestes tècniques.

Exemples de Codi

Aquí hi ha implementacions de la calculadora de lligadura de DNA en diversos llenguatges de programació:

1' Funció VBA d'Excel per a la Calculadora de Lligadura de DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calcular la quantitat d'inserció requerida en ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calcular el volum de vector en μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calcular el volum d'inserció en μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calcular el volum de buffer/aigua en μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Exemple d'ús en una cel·la:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calcular volums per a una reacció de lligadura de DNA.
5    
6    Paràmetres:
7    vector_concentration (float): Concentració de DNA de vector en ng/μL
8    vector_length (float): Longitud del DNA de vector en parells de bases
9    insert_concentration (float): Concentració de DNA d'inserció en ng/μL
10    insert_length (float): Longitud del DNA d'inserció en parells de bases
11    molar_ratio (float): Proporció molar desitjada d'inserció:vector
12    total_volume (float): Volum total de reacció en μL
13    vector_amount (float): Quantitat de DNA de vector a utilitzar en ng (per defecte: 50)
14    
15    Retorna:
16    dict: Diccionari que conté volums i quantitats calculades
17    """
18    # Calcular volum de vector
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calcular quantitat d'inserció requerida
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calcular volum d'inserció
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calcular volum de buffer/aigua
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Exemple d'ús
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Inserció: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convertir longitud a kb per al càlcul
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calcular la quantitat d'inserció requerida
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calcular volums
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Exemple d'ús
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Inserció: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convertir longitud a kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calcular la quantitat d'inserció requerida
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calcular volums
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Arrodonir a 2 decimals
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Inserció: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convertir longitud a kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calcular la quantitat d'inserció requerida
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calcular volums
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Arrodonir a 2 decimals
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Inserció: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Preguntes Freqüents (FAQ)

Quina és la proporció molar òptima per a la lligadura de DNA?

La proporció molar òptima d'inserció a vector normalment varia entre 3:1 i 5:1 per a aplicacions de lligadura estàndard. No obstant això, això pot variar depenent de l'escenari de lligadura específic:

• Per a lligadures d'extrems adhesius: 1:1 a 3:1
• Per a lligadures d'extrems plans: 3:1 a 5:1
• Per a inserts grans (>10 kb): 1:1 a 2:1
• Per a inserts petits (<500 bp): 5:1 a 10:1
• Per a assemblatge de múltiples fragments: 3:1 per a cada inserció a vector

Per què falla la meva reacció de lligadura malgrat utilitzar els volums calculats?

Diversos factors poden afectar l'eficiència de lligadura més enllà de la proporció molar:

1. Qualitat del DNA: Assegura't que tant el vector com l'inserit tinguin extrems nets sense danys
2. Dephosphorylation: Comprova si el teu vector ha estat dephosphorylated, cosa que impedeix la lligadura pròpia
3. Activitat de l'enzim: Verifica que la teva ligasa estigui activa i s'utilitzi a la temperatura correcta
4. Temps d'incubació: Algunes lligadures es beneficien d'una incubació més llarga (durant la nit a 16°C)
5. Condicions de buffer: Assegura't que s'utilitzi el buffer correcte amb ATP
6. Contaminants: Purifica el DNA per eliminar inhibidors com EDTA o alta sal

Quanta quantitat de DNA de vector hauria d'utilitzar en una reacció de lligadura?

Normalment, es recomana utilitzar entre 50 i 100 ng de DNA de vector per a reaccions de lligadura estàndard. Utilitzar massa vector pot conduir a un major fons de vector no tallat o auto-lligat, mentre que massa poc pot reduir l'eficiència de transformació. Per a lligadures desafiadores, pot ser necessari optimitzar aquesta quantitat.

Haig d'ajustar els càlculs per a lligadures d'extrems plans en comparació amb les d'extrems adhesius?

Sí. Les lligadures d'extrems plans són generalment menys eficients que les d'extrems adhesius (extrems cohesius). Per a lligadures d'extrems plans, utilitza:

• Proporcions més altes (3:1 a 5:1 o fins i tot més altes)
• Més T4 DNA ligasa (normalment 2-3 vegades més)
• Temps d'incubació més llargs
• Considera afegir PEG per millorar l'eficiència de lligadura

Com calculo la lligadura per a múltiples inserts?

Per a l'assemblatge de múltiples fragments:

1. Calcula cada quantitat d'inserció individualment utilitzant la mateixa fórmula
2. Mantingues la mateixa proporció molar total (per exemple, per a dos inserts, utilitza 1.5:1.5:1 inserció1:inserció2:vector)
3. Ajusta el volum total de reacció per acomodar tots els fragments de DNA
4. Considera lligadures seqüencials o utilitzar mètodes d'assemblatge com Gibson Assembly per a múltiples fragments

Puc utilitzar aquesta calculadora per a Gibson Assembly o Golden Gate Assembly?

Aquesta calculadora està dissenyada específicament per a la clonació basada en enzims de restricció i lligasa tradicionals. Per a Gibson Assembly, normalment es recomanen quantitats equimolars de tots els fragments (proporció 1:1), tot i que el càlcul bàsic de la quantitat de DNA basat en la longitud és similar. Per a Golden Gate Assembly, també s'utilitzen normalment proporcions equimolars de tots els components.

Com compto la dephosphorylation del vector en els meus càlculs?

La dephosphorylation del vector (eliminant els grups fosfat 5') impedeix la lligadura pròpia però no canvia els càlculs de quantitat. No obstant això, per a vectors dephosphorylated:

1. Utilitza DNA d'inserció fresc amb fosfats 5' intactes
2. Considera utilitzar proporcions lleugerament més altes d'inserció:vector (4:1 a 6:1)
3. Assegura't temps de lligadura més llargs (almenys 1 hora a temperatura ambient o durant la nit a 16°C)

Quin és el volum mínim total de reacció que hauria d'utilitzar?

El volum mínim pràctic de reacció és normalment de 10 μL, que permet una mescla adequada i evita problemes d'evaporació. Si els teus volums de DNA calculats superen el volum de reacció desitjat, tens diverses opcions:

1. Utilitza mostres de DNA més concentrades
2. Redueix la quantitat de vector utilitzada (per exemple, 25 ng en comptes de 50 ng)
3. Augmenta el volum total de reacció
4. Considera concentrar les teves mostres de DNA

Quant de temps hauria d'incubar la meva reacció de lligadura?

Els temps d'incubació òptims varien segons el tipus de lligadura:

• Lligadures d'extrems adhesius: 1 hora a temperatura ambient (22-25°C) o 4-16 hores a 16°C
• Lligadures d'extrems plans: 2-4 hores a temperatura ambient o durant la nit (12-16 hores) a 16°C
• Lligadures ràpides (utilitzant ligasa d'alta concentració): 5-15 minuts a temperatura ambient

Puc reutilitzar la reacció de lligadura sobrant per a la transformació?

Sí, les mescles de lligadura es poden emmagatzemar normalment a -20°C i reutilitzar per a la transformació. No obstant això, cada cicle de congelació-descongelació pot reduir l'eficiència. Per obtenir els millors resultats:

1. Aliquota la mescla de lligadura abans de congelar
2. Inactiva la ligasa (65°C durant 10 minuts) abans de l'emmagatzematge
3. Utilitza dins d'1-2 mesos per obtenir els millors resultats

Referències

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/