מחשבון ליגציה של DNA

מבוא

ליגציה של DNA היא טכניקת ביולוגיה מולקולרית קריטית המשמשת לחיבור מקטעי DNA יחד עם קשרים קוולנטיים. ה- מחשבון ליגציה של DNA הוא כלי חיוני עבור חוקרים, המסייע לקבוע את הכמויות האופטימליות של DNA וקטור ודנ"א של הוספה הנדרשות לתגובות ליגציה מוצלחות. על ידי חישוב יחס המולים הנכון בין DNA וקטור (פלסמיד) ו-DNA הוספה, מחשבון זה מבטיח ניסויים יעילים בהנדסה גנטית תוך צמצום חומרים בזבזניים ותגובות כושלות.

תגובות ליגציה הן יסודיות להנדסה גנטית, ביולוגיה סינתטית ולפרוצדורות של קלונינג מולקולרי. הן מאפשרות למדענים ליצור מולקולות DNA רקומביננטיות על ידי הכנסת גנים של עניין לתוך וקטורי פלסמיד לצורך העברה לאורגניזמים מארחים. הצלחת תגובות אלו תלויה במידה רבה בשימוש בכמויות המתאימות של רכיבי DNA, מה שדווקא מחשבון זה מסייע לקבוע.

בין אם אתה בונה וקטורי ביטוי, יוצר ספריות גנים או מבצע תת-קלונינג שגרתי, מחשבון הליגציה של DNA הזה יעזור לך לייעל את התנאים הניסיוניים שלך ולהגביר את שיעור ההצלחה שלך. על ידי הזנת כמה פרמטרים מרכזיים לגבי דגימות ה-DNA שלך, תוכל במהירות לקבל את הנפחים המדויקים הנדרשים לתגובה הליגציה הספציפית שלך.

נוסחה/חישוב

מחשבון הליגציה של DNA משתמש בנוסחה בסיסית של ביולוגיה מולקולרית שמתחשבת בגודל ובמרכזי המקטעים של DNA הנמצאים בחיבור. החישוב הראשי קובע כמה DNA הוספה נדרשת ביחס ל-DNA וקטור בהתבסס על האורכים שלהם ועל יחס המולר הרצוי.

חישוב כמות ההוספה

כמות ה-DNA הוספה הנדרשת (בנג) מחושבת באמצעות הנוסחה הבאה:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

איפה:

• ng of vector = כמות DNA וקטור בשימוש בתגובה (בדרך כלל 50-100 ng)
• kb size of insert = אורך מקטע ה-DNA של ההוספה בקילובסיסים (kb)
• kb size of vector = אורך ה-DNA של הוקטור בקילובסיסים (kb)
• molar ratio = יחס המולרים הרצוי של מולקולות ההוספה למולקולות הוקטור (בדרך כלל 3:1 עד 5:1)

חישובי נפח

לאחר שהכמות הנדרשת של DNA ההוספה נקבעת, מחושבים הנפחים הנדרשים לתגובה:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

דוגמת חישוב

בואו נעבור על דוגמה מעשית:

• ריכוז הוקטור: 50 ng/μL
• אורך הוקטור: 3000 bp (3 kb)
• ריכוז ההוספה: 25 ng/μL
• אורך ההוספה: 1000 bp (1 kb)
• יחס מולרי רצוי (הוספה:וקטור): 3:1
• נפח התגובה הכולל: 20 μL
• כמות הוקטור לשימוש: 50 ng

שלב 1: חישוב כמות ההוספה הנדרשת $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

שלב 2: חישוב הנפחים $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

חישוב זה מבטיח שיש שלוש מולקולות הוספה לכל מולקולת וקטור בתגובה, ומייעל את הסיכויים להצלחה בליגציה.

מדריך שלב-אחר-שלב לשימוש במחשבון

מחשבון הליגציה של DNA שלנו מיועד להיות אינטואיטיבי ופשוט. עקוב אחרי הצעדים הבאים כדי לחשב את הנפחים האופטימליים לתגובה הליגציה שלך:

1. הזן מידע על הוקטור:

   • הכנס את ריכוז הוקטור שלך ב-ng/μL
   • הזן את אורך הוקטור בבסיסים (bp)
   • ציין את כמות ה-DNA של הוקטור שברצונך להשתמש בתגובה (ng)

2. הזן מידע על ההוספה:

   • הכנס את ריכוז ההוספה שלך ב-ng/μL
   • הזן את אורך ההוספה בבסיסים (bp)

3. קבע פרמטרי תגובה:

   • ציין את יחס המולרים הרצוי (הוספה:וקטור) - בדרך כלל בין 3:1 ל-5:1
   • הזן את נפח התגובה הכולל ב-μL (בדרך כלל 10-20 μL)

4. צפה בתוצאות:

   • המחשבון יציג אוטומטית:
     • נפח הוקטור הנדרש (μL)
     • נפח ההוספה הנדרש (μL)
     • נפח הבופר/מים להוסיף (μL)
     • נפח התגובה הכולל (μL)
     • כמות הוקטור וההוספה בתגובה (ng)

5. העתק תוצאות (אופציונלי):

   • השתמש בכפתור "העתק תוצאות" כדי להעתיק את כל החישובים ללוח שלך עבור מחברת המעבדה או פרוטוקולים

המחשבון מבצע בדיקות אימות כדי להבטיח שכל הקלטים הם מספרים חיוביים ושסך הנפח מספיק עבור הנפחים הנדרשים של DNA. אם יזוהו שגיאות כלשהן, הודעות שגיאה מועילות ינחו אותך לתקן את הקלטים.

שימושים

מחשבון הליגציה של DNA הוא בעל ערך במגוון רחב של יישומים בביולוגיה מולקולרית:

קלונינג מולקולרי

מקרה השימוש הנפוץ ביותר הוא קלונינג מולקולרי סטנדרטי, שבו חוקרים מכניסים גנים או מקטעי DNA לתוך וקטורי פלסמיד. המחשבון מבטיח תנאים אופטימליים ל:

• תת-קלונינג של גנים בין וקטורי ביטוי שונים
• יצירת חלבונים מאוגדים על ידי חיבור מספר מקטעי גנים
• בניית ניסויים עם גני דיווח
• בניית ספריות פלסמידים

ביולוגיה סינתטית

בביולוגיה סינתטית, שבה לעיתים קרובות מרכיבים מספר מקטעי DNA:

• תגובות ליגציה של גיבסון נהנות מיחסי הוספה:וקטור מדויקים
• מערכות הרכבה של שער זהב דורשות ריכוזי DNA ספציפיים
• הרכבת חלקי גנטיקה סטנדרטיים של ביובריק
• בניית מעגלים גנטיים סינתטיים

פיתוח ערכות אבחון

בעת פיתוח כלים אבחוניים מולקולריים:

• קלונינג של סמנים גנטיים ספציפיים למחלות
• בניית פלסמידים של שליטה חיובית
• פיתוח תקני כיול עבור qPCR

מערכות ביטוי חלבונים

עבור חוקרים העובדים על ייצור חלבונים:

• אופטימיזציה של יחסי הוספה:וקטור עבור וקטורי ביטוי בעלי עותקים גבוהים
• בניית מערכות ביטוי מעוררות
• יצירת וקטורי סודר עבור טיהור חלבונים

יישומי CRISPR-Cas9

ביישומים של עריכת גנום:

• קלונינג של RNA מדריך לתוך וקטורי CRISPR
• יצירת תבניות תורמות לתיקון מכוון של הומולוגיה
• בניית ספריות של RNA מדריך עבור סינון

ליגציות מאתגרות

המחשבון הוא בעל ערך במיוחד עבור תרחישי ליגציה מאתגרים:

• קלונינג של הוספות גדולות (>5 kb)
• הכנסת מקטעים מאוד קטנים (<100 bp)
• ליגציות בקצוות שטוחים שיש להן יעילות נמוכה יותר
• תגובות הרכבה של מספר מקטעים

חלופות

בעוד שמחשבון הליגציה של DNA שלנו מספק חישובים מדויקים עבור תגובות ליגציה מסורתיות, מספר גישות חלופיות קיימות לחיבור מקטעי DNA:

1. הרכבת גיבסון: משתמשת באקסונוקלאז, פולימראז וליגאז בתגובה של צינור אחד כדי לחבר מקטעי DNA חופפים. אין צורך בחישוב ליגציה מסורתי, אך יחס הריכוזים עדיין חשוב.

2. הרכבת שער זהב: משתמשת באנזימים רסטריקציה מסוג IIS להרכבה כיוונית וללא צלקות של מספר מקטעים. דורשת כמויות שוות של כל המקטעים.

3. SLIC (קלונינג בלתי תלוי בליגציה): משתמשת באקסונוקלאז כדי ליצור קצוות חד-גדיליים המתאימים יחד. בדרך כלל משתמשת בריכוזים שווים של המקטעים.

4. הרכבת In-Fusion: מערכת מסחרית המאפשרת חיבור של מקטעים עם חפיפות של 15 bp. משתמשת ביחס ספציפי בהתבסס על גודל המקטעים.

5. הרכבת Gateway: משתמשת ברקומבינציה ספציפית לאתר במקום בליגציה. דורשת וקטורי כניסה ויעד ספציפיים.

6. בדיקות אמפיריות: חלק מהמעבדות מעדיפות להקים מספר תגובות ליגציה עם יחסי הוספה:וקטור שונים (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) ולקבוע איזו מהן עובדת הכי טוב עבור הקונסטרוקטים הספציפיים שלהן.

7. מחשבי תוכנה: חבילות תוכנה מסחריות כמו Vector NTI ו-SnapGene כוללות מחשבוני ליגציה עם תכונות נוספות כמו ניתוח אתרי רסטריקציה.

היסטוריה

הפיתוח של חישובי ליגציה של DNA מקביל להתפתחות טכניקות קלונינג מולקולריות, שהפכו את הביולוגיה המולקולרית והביוטכנולוגיה.

פיתוחים מוקדמים (שנות ה-70)

המושג של ליגציה של DNA עבור קלונינג מולקולרי צץ בשנות ה-70 המוקדמות עם העבודה פורצת הדרך של פול ברג, הרברט בויור וסטנלי כהן, שפיתחו את המולקולות הראשונות של DNA רקומביננטי. במהלך תקופה זו, תגובות הליגציה היו בעיקר אמפיריות, כאשר חוקרים השתמשו בניסוי וטעייה כדי לקבוע את התנאים האופטימליים.

הגילוי של אנזימי רסטריקציה וליגאז DNA סיפק את הכלים החיוניים לחיתוך ולחיבור מולקולות DNA. ליגאז DNA T4, מבודד מ-E. coli המודבק בווירוס T4, הפך לאנזים הסטנדרטי לחיבור מקטעי DNA בזכות יכולתו לליגציה של קצוות שטוחים וקצוות תואמים.

תקופת שיפור (שנות ה-80-90)

כשהקלונינג המולקולרי הפך ליותר שגרתי, חוקרים החלו לפתח גישות יותר שיטתיות לתגובות ליגציה. החשיבות של יחס המולים בין DNA וקטור וההוספה הפכה ברורה, מה שהוביל לפיתוח הנוסחה הבסיסית שעדיין בשימוש היום.

במהלך תקופה זו, חוקרים קבעו כי שימוש בעודף DNA הוספה (בדרך כלל יחס של 3:1 עד 5:1) בדרך כלל משפר את יעילות הליגציה עבור יישומים סטנדרטיים של קלונינג. ידע זה שותף תחילה באמצעות פרוטוקולים מעבדתיים והדרגה בהדרגה לספרי ביולוגיה מולקולרית ומדריכים.

עידן מודרני (שנות ה-2000-נוכחי)

הגעת הכלים החישוביים ומחשבים מקוונים בשנות ה-2000 הפכה את החישובים המדויקים של ליגציה לנגישים יותר לחוקרים. ככל שהטכניקות של ביולוגיה מולקולרית הפכו למורכבות יותר, הצורך בחישובים מדויקים הפך לקריטי יותר, במיוחד עבור פרויקטי קלונינג מאתגרים הכוללים מספר מקטעים או הוספות גדולות.

היום, חישובי ליגציה של DNA הם חלק אינטגרלי מהעבודות של קלונינג מולקולרי, עם מחשבונים ייעודיים כמו זה המסייעים לחוקרים לייעל את ניסוייהם. הנוסחה הבסיסית נותרה כמעט ללא שינוי, אם כי ההבנה שלנו של הגורמים המשפיעים על יעילות הליגציה השתפרה.

הופעת שיטות קלונינג חלופיות כמו הרכבת גיבסון והרכבת שער זהב הציגה צרכים חישוביים חדשים, אך המושג הבסיסי של יחס המולים בין מקטעי DNA נשאר חשוב בכל השיטות הללו.

דוגמאות קוד

הנה מימושים של מחשבון הליגציה של DNA בשפות תכנות שונות:

1' פונקציית VBA של Excel עבור מחשבון ליגציה של DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' חישוב כמות ההוספה הנדרשת ב-ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' חישוב נפח הוקטור ב-μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' חישוב נפח ההוספה ב-μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' חישוב נפח הבופר/מים ב-μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' דוגמת שימוש בתא:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    חישוב נפחים עבור תגובת ליגציה של DNA.
5    
6    פרמטרים:
7    vector_concentration (float): ריכוז DNA וקטור ב-ng/μL
8    vector_length (float): אורך DNA וקטור בבסיסים
9    insert_concentration (float): ריכוז DNA הוספה ב-ng/μL
10    insert_length (float): אורך DNA הוספה בבסיסים
11    molar_ratio (float): יחס המולרים הרצוי של הוספה:וקטור
12    total_volume (float): נפח התגובה הכולל ב-μL
13    vector_amount (float): כמות DNA וקטור לשימוש ב-ng (ברירת מחדל: 50)
14    
15    מחזיר:
16    dict: מילון המכיל נפחים וכמויות מחושבות
17    """
18    # חישוב נפח הוקטור
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # חישוב כמות ההוספה הנדרשת
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # חישוב נפח ההוספה
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # חישוב נפח הבופר/מים
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# דוגמת שימוש
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"וקטור: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"הוספה: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"בופר: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"סך הכל: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // המרת אורכים ל-kb עבור חישוב
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // חישוב כמות ההוספה הנדרשת
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // חישוב נפחים
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// דוגמת שימוש
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`וקטור: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`הוספה: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`בופר: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`סך הכל: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // המרת אורכים ל-kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // חישוב כמות ההוספה הנדרשת
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // חישוב נפחים
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // עיגול ל-2 מקומות אחרי הנקודה
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("וקטור: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("הוספה: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("בופר: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("סך הכל: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // המרת אורכים ל-kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // חישוב כמות ההוספה הנדרשת
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // חישוב נפחים
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // עיגול ל-2 מקומות אחרי הנקודה
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "וקטור: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "הוספה: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "בופר: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "סך הכל: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

שאלות נפוצות (FAQ)

מהו יחס המולרים האופטימלי עבור ליגציה של DNA?

היחס המולרי האופטימלי של הוספה לוקטור בדרך כלל נע בין 3:1 ל-5:1 עבור יישומים סטנדרטיים של קלונינג. עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם לתרחיש הליגציה הספציפי:

• עבור ליגציות בקצוות תואמים: 3:1 עד 5:1
• עבור ליגציות בקצוות שטוחים: 1:1 עד 3:1
• עבור הוספות גדולות (>10 kb): 1:1 עד 2:1
• עבור הוספות קטנות (<500 bp): 5:1 עד 10:1
• עבור הרכבה של מספר מקטעים: 3:1 עבור כל הוספה לוקטור

למה התגובה שלי בליגציה נכשלת למרות השימוש בנפחים המחושבים?

מספר גורמים יכולים להשפיע על יעילות הליגציה מעבר ליחס המולרי:

1. איכות DNA: ודא ששני הוקטור וההוספה יש להם קצוות נקיים ללא נזק
2. דה-פוספורילציה: בדוק אם הוקטור שלך דה-פוספורילט, מה שמונע ליגציה עצמית
3. פעילות אנזים: ודא שהליגאז שלך פעיל ומשתמש בטמפרטורה הנכונה
4. זמן אינקובציה: חלק מהליגציות נהנות מאינקובציה ארוכה יותר (לילה ב-16°C)
5. תנאי בופר: ודא שהבופר הנכון עם ATP בשימוש
6. מזהמים: טיהור DNA כדי להסיר מעכבים כמו EDTA או מלח גבוה

כמה DNA וקטור עלי להשתמש בתגובה ליגציה?

בדרך כלל, מומלץ להשתמש ב-50-100 ng של DNA וקטור עבור תגובות ליגציה סטנדרטיות. שימוש ביותר מדי וקטור עלול להוביל לרקע גבוה יותר של וקטור לא חתוך או ליגציה עצמית, בעוד ששימוש בפחות מדי עלול להפחית את היעילות של ההעברה. עבור ליגציות מאתגרות, ייתכן שתצטרך לייעל את הכמות הזו.

האם עלי להתאים חישובים עבור ליגציות בקצוות שטוחים לעומת תואמים?

כן. ליגציות בקצוות שטוחים בדרך כלל פחות יעילות מאשר ליגציות בקצוות תואמים. עבור ליגציות בקצוות שטוחים, השתמש:

• ביחסי הוספה:וקטור גבוהים יותר (3:1 עד 5:1 או אפילו גבוהים יותר)
• ביותר ליגאז DNA T4 (בדרך כלל 2-3 פעמים יותר)
• בזמני אינקובציה ארוכים יותר
• שקול להוסיף PEG כדי לשפר את יעילות הליגציה

איך אני מחשב ליגציה עבור מספר הוספות?

עבור הרכבה של מספר מקטעים:

1. חישב כל כמות הוספה בנפרד באמצעות אותה נוסחה
2. שמור על אותו יחס מולרי כולל (למשל, עבור שתי הוספות, השתמש ביחס של 1.5:1.5:1 הוספה1:הוספה2:וקטור)
3. התאם את נפח התגובה הכולל כדי להכיל את כל מקטעי ה-DNA
4. שקול ליגציה סדרתית או שימוש בשיטות הרכבה כמו הרכבת גיבסון עבור מספר מקטעים

האם אני יכול להשתמש במחשבון הזה עבור הרכבת גיבסון או הרכבת שער זהב?

מחשבון זה מיועד במיוחד עבור קלונינג מבוסס אנזימי רסטריקציה וליגאז. עבור הרכבת גיבסון, בדרך כלל מומלץ להשתמש בכמויות שוות של כל המקטעים (יחס 1:1), אם כי החישוב הבסיסי של כמות DNA בהתבסס על אורך דומה. עבור הרכבת שער זהב, גם כאן בדרך כלל משתמשים ביחסים שווים של כל הרכיבים.

איך אני מתחשב בדה-פוספורילציה של הוקטור בחישובים שלי?

דה-פוספורילציה של הוקטור (הסרת קבוצות הפוספט ב-5') מונעת ליגציה עצמית אך אינה משנה את חישובי הכמויות. עם זאת, עבור וקטורים דה-פוספורילטיים:

1. השתמש ב-DNA הוספה חדש עם פוספטים שלמים ב-5'
2. שקול להשתמש ביחסים גבוהים יותר של הוספה:וקטור (4:1 עד 6:1)
3. ודא זמני ליגציה ארוכים יותר (לפחות שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-16°C)

מהו נפח התגובה הכולל המינימלי שעלי להשתמש בו?

נפח התגובה המינימלי המעשי הוא בדרך כלל 10 μL, המאפשר ערבוב מספק ומונע בעיות אידוי. אם הנפחים המחושבים שלך עולים על נפח התגובה הרצוי, יש לך מספר אפשרויות:

1. השתמש בדגימות DNA מרוכזות יותר
2. הקטן את כמות הוקטור בשימוש (למשל, 25 ng במקום 50 ng)
3. הגדל את נפח התגובה הכולל
4. שקול לרכז את דגימות ה-DNA שלך

כמה זמן עלי לאקונן את תגובת הליגציה שלי?

זמני האינקובציה האופטימליים משתנים בהתאם לסוג הליגציה:

• ליגציות בקצוות תואמים: שעה אחת בטמפרטורת החדר (22-25°C) או 4-16 שעות ב-16°C
• ליגציות בקצוות שטוחים: 2-4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה (12-16 שעות) ב-16°C
• ליגציות מהירות (בשימוש בליגאז בריכוז גבוה): 5-15 דקות בטמפרטורת החדר

האם אני יכול להשתמש בתגובה ליגציה שנותרה עבור העברה?

כן, תערובות הליגציה יכולות בדרך כלל להישמר ב-20- וניתן להשתמש בהן שוב עבור העברה. עם זאת, כל מחזור הקפאה-פיתול עשוי להפחית את היעילות. עבור התוצאות הטובות ביותר:

1. חלק את תערובת הליגציה לפני ההקפאה
2. חום לאקטיבציה של הליגאז (65°C למשך 10 דקות) לפני האחסון
3. השתמש בתוך 1-2 חודשים עבור תוצאות אופטימליות

מקורות

1. סמברוק ג', ראסל דב. (2001). קלונינג מולקולרי: מדריך למעבדה (מהדורה 3). הוצאת מעבדת קיץ.

2. גרין מ"ר, סמברוק ג'. (2012). קלונינג מולקולרי: מדריך למעבדה (מהדורה 4). הוצאת מעבדת קיץ.

3. אנגלר ק', קנדציה ר', מריליון ס'. (2008). שיטה של צעד אחד, צעד אחד, לחישוב מדויק עם יכולת גבוהה. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. גיבסון דג', יאנג ל', צ'ואנג רי, ונטר ג'י, האצ'יסון סי איי, סמית הו. (2009). הרכבה אנזימטית של מולקולות DNA עד מספר מאות קילובסיסים. שיטות טבע, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. אסלנידיס ק', די ג'ונג פ'י. (1990). קלונינג בלתי תלוי בליגציה של מוצרים של PCR (LIC-PCR). מחקר חומצות גרעין, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. צימרמן סב, פייפר ב' ה. (1983). צפיפות מקרומולקולרית מאפשרת ליגציה בקצוות שטוחים על ידי ליגאזי DNA מ-liver של חולדות או E. coli. פרסומים של האקדמיה הלאומית למדעים, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - הפניה לביולוגיה מולקולרית. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - פרוטוקול ליגציה של DNA. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. תרמו פישר מדע - הפניה טכנית לקלונינג. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. פרומגה - מדריך טכני לקלונינג. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/