DNA 연결 계산기

소개

DNA 연결은 DNA 조각을 공유 결합으로 결합하는 중요한 분자 생물학 기술입니다. DNA 연결 계산기는 연구자에게 필수적인 도구로, 성공적인 연결 반응에 필요한 벡터와 삽입 DNA의 최적 양을 결정하는 데 도움을 줍니다. 이 계산기는 벡터(플라스미드)와 삽입 DNA 조각 간의 올바른 몰 비율을 계산하여 효율적인 분자 클로닝 실험을 보장하고 낭비되는 시약과 실패한 반응을 최소화합니다.

연결 반응은 유전자 공학, 합성 생물학 및 분자 클로닝 절차의 기초입니다. 이들은 과학자들이 플라스미드 벡터에 관심 있는 유전자를 삽입하여 이후 숙주 유기체에 변형할 수 있도록 하는 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있게 해줍니다. 이러한 반응의 성공은 DNA 구성 요소의 적절한 양을 사용하는 데 크게 의존하며, 이는 이 계산기가 정확히 결정하는 것입니다.

표현 벡터를 구성하든, 유전자 라이브러리를 생성하든, 일상적인 서브클로닝을 수행하든, 이 DNA 연결 계산기는 실험 조건을 최적화하고 성공률을 높이는 데 도움을 줄 것입니다. DNA 샘플에 대한 몇 가지 주요 매개변수를 입력하면 특정 연결 반응에 필요한 정확한 부피를 신속하게 얻을 수 있습니다.

공식/계산

DNA 연결 계산기는 결합되는 DNA 조각의 크기와 농도를 고려한 기본 분자 생물학 공식을 사용합니다. 주요 계산은 벡터 DNA에 대한 삽입 DNA의 필요량을 결정하며, 이는 각각의 길이와 원하는 몰 비율을 기반으로 합니다.

삽입량 계산

필요한 삽입 DNA의 양(나노그램 단위)은 다음 공식을 사용하여 계산됩니다:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

어디서:

• ng of vector = 반응에 사용된 벡터 DNA의 양 (일반적으로 50-100 ng)
• kb size of insert = 삽입 DNA 조각의 길이(킬로베이스 단위)
• kb size of vector = 벡터 DNA의 길이(킬로베이스 단위)
• molar ratio = 삽입 분자와 벡터 분자의 원하는 비율(일반적으로 3:1에서 5:1)

부피 계산

필요한 삽입 DNA의 양이 결정되면 반응에 필요한 부피가 계산됩니다:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

예제 계산

실용적인 예제를 통해 살펴보겠습니다:

• 벡터 농도: 50 ng/μL
• 벡터 길이: 3000 bp (3 kb)
• 삽입 농도: 25 ng/μL
• 삽입 길이: 1000 bp (1 kb)
• 원하는 몰 비율(삽입:벡터): 3:1
• 총 반응 부피: 20 μL
• 사용할 벡터 양: 50 ng

1단계: 필요한 삽입 양 계산 $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

2단계: 부피 계산 $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

이 계산은 반응에서 벡터 분자당 세 개의 삽입 분자가 있도록 하여 성공적인 연결 가능성을 최적화합니다.

계산기 사용을 위한 단계별 가이드

우리의 DNA 연결 계산기는 직관적이고 간단하게 설계되었습니다. 다음 단계를 따라 연결 반응에 대한 최적의 부피를 계산하십시오:

1. 벡터 정보 입력:

   • 벡터 농도를 ng/μL로 입력합니다.
   • 벡터 길이를 염기쌍(bp)으로 입력합니다.
   • 반응에 사용할 벡터 DNA의 양을 ng로 지정합니다.

2. 삽입 정보 입력:

   • 삽입 농도를 ng/μL로 입력합니다.
   • 삽입 길이를 염기쌍(bp)으로 입력합니다.

3. 반응 매개변수 설정:

   • 원하는 몰 비율(삽입:벡터)을 지정합니다 - 일반적으로 3:1에서 5:1 사이입니다.
   • 총 반응 부피를 μL로 입력합니다 (일반적으로 10-20 μL).

4. 결과 보기:

   • 계산기는 자동으로 다음을 표시합니다:
     • 필요한 벡터 부피 (μL)
     • 필요한 삽입 부피 (μL)
     • 추가할 완충액/물 부피 (μL)
     • 총 반응 부피 (μL)
     • 반응에서의 벡터 및 삽입 DNA의 양 (ng)

5. 결과 복사 (선택 사항):

   • "결과 복사" 버튼을 사용하여 모든 계산을 클립보드에 복사하여 실험 노트북이나 프로토콜에 사용할 수 있습니다.

계산기는 모든 입력이 양수인지 확인하고 총 부피가 필요한 DNA 부피에 충분한지 확인하는 유효성 검사 체크를 수행합니다. 오류가 감지되면 유용한 오류 메시지가 입력을 수정하도록 안내합니다.

사용 사례

DNA 연결 계산기는 수많은 분자 생물학 응용 분야에서 유용합니다:

분자 클로닝

가장 일반적인 사용 사례는 표준 분자 클로닝으로, 연구자들이 유전자나 DNA 조각을 플라스미드 벡터에 삽입합니다. 계산기는 다음을 위한 최적의 조건을 보장합니다:

• 서로 다른 발현 벡터 간의 유전자 서브클로닝
• 여러 유전자 조각을 결합하여 융합 단백질 생성
• 리포터 유전자 분석 구축
• 플라스미드 라이브러리 구축

합성 생물학

여러 DNA 조각이 조립되는 합성 생물학에서:

• 깁슨 어셈블리 반응은 정확한 삽입:벡터 비율의 혜택을 봅니다.
• 골든 게이트 조립 시스템은 특정 DNA 농도를 요구합니다.
• 표준화된 유전 부품의 바이오브릭 조립
• 합성 유전자 회로 구축

진단 키트 개발

분자 진단 도구를 개발할 때:

• 질병 특정 유전 마커의 클로닝
• 양성 대조 플라스미드의 구축
• qPCR을 위한 교정 기준 개발

단백질 발현 시스템

단백질 생산을 연구하는 연구자들을 위해:

• 고복제 발현 벡터를 위한 삽입:벡터 비율 최적화
• 유도 발현 시스템 구축
• 단백질 정제를 위한 분비 벡터 생성

CRISPR-Cas9 응용

유전체 편집 응용에서:

• CRISPR 벡터에 가이드 RNA 클로닝
• 동종 지향 수리를 위한 기증 템플릿 생성
• 스크리닝을 위한 가이드 RNA 라이브러리 구축

도전적인 연결

계산기는 특히 도전적인 연결 시나리오에서 유용합니다:

• 큰 삽입 클로닝 (>5 kb)
• 매우 작은 조각 삽입 (<100 bp)
• 효율이 낮은 블런트 엔드 연결
• 다중 조각 조립 반응

대안

우리의 DNA 연결 계산기는 전통적인 연결 반응을 위한 정확한 계산을 제공하지만, DNA 조각을 결합하는 여러 대체 방법이 존재합니다:

1. 깁슨 어셈블리: 겹치는 DNA 조각을 결합하기 위해 단일 튜브 반응에서 외부효소, 중합효소 및 리가제를 사용합니다. 전통적인 연결 계산이 필요하지 않지만 농도 비율은 여전히 중요합니다.

2. 골든 게이트 조립: 방향성과 흉터 없는 여러 조각의 조립을 위해 Type IIS 제한 효소를 사용합니다. 모든 조각의 동량이 필요합니다.

3. SLIC (서열 및 리가제 독립 클로닝): 단일 가닥 오버행을 생성하여 서로 결합하는 외부효소를 사용합니다. 일반적으로 조각의 동량 비율을 사용합니다.

4. 인퓨전 클로닝: 15 bp 겹침이 있는 조각의 결합을 허용하는 상업적 시스템입니다. 조각 크기에 따라 특정 비율을 사용합니다.

5. 게이트웨이 클로닝: 리가제 대신 특정 부위 재조합을 사용합니다. 특정 입력 및 목적 벡터가 필요합니다.

6. 경험적 테스트: 일부 실험실은 서로 다른 삽입:벡터 비율(1:1, 3:1, 5:1, 10:1)로 여러 연결 반응을 설정하고 어떤 것이 특정 구성에 가장 잘 작동하는지 결정하는 것을 선호합니다.

7. 소프트웨어 계산기: Vector NTI 및 SnapGene과 같은 상업용 소프트웨어 패키지는 추가 기능이 포함된 연결 계산기를 포함합니다.

역사

DNA 연결 계산의 발전은 분자 클로닝 기술의 진화와 평행을 이루며, 이는 분자 생물학과 생명공학에 혁신을 가져왔습니다.

초기 개발 (1970년대)

DNA 연결의 개념은 1970년대 초에 Paul Berg, Herbert Boyer 및 Stanley Cohen의 선구적인 작업과 함께 등장했으며, 이들은 최초의 재조합 DNA 분자를 개발했습니다. 이 시기에 연결 반응은 주로 경험적이었으며, 연구자들은 최적 조건을 결정하기 위해 시행착오를 사용했습니다.

제한 효소와 DNA 리가제의 발견은 DNA 분자를 자르고 다시 연결하는 데 필요한 필수 도구를 제공했습니다. T4 DNA 리가제는 T4 박테리오파지에 감염된 E. coli에서 분리되어 블런트 및 응집 끝을 모두 연결할 수 있는 능력 덕분에 DNA 조각을 결합하기 위한 표준 효소가 되었습니다.

정제 기간 (1980년대-1990년대)

분자 클로닝이 보다 일상화됨에 따라 연구자들은 연결 반응에 대한 보다 체계적인 접근 방식을 개발하기 시작했습니다. 벡터와 삽입 DNA 간의 몰 비율의 중요성이 분명해지면서 오늘날에도 여전히 사용되는 기본 공식이 개발되었습니다.

이 기간 동안 연구자들은 일반적으로 3:1에서 5:1의 몰 비율로 과도한 삽입 DNA가 표준 클로닝 응용 프로그램의 연결 효율성을 일반적으로 향상시킨다는 것을 확립했습니다. 이 지식은 처음에는 실험실 프로토콜을 통해 공유되었고 점차 분자 생물학 매뉴얼과 교과서에 포함되었습니다.

현대 시대 (2000년대-현재)

2000년대에 계산 도구와 온라인 계산기의 출현은 연구자들이 정확한 연결 계산을 보다 쉽게 접근할 수 있도록 만들었습니다. 분자 생물학 기술이 더욱 정교해짐에 따라 정확한 계산의 필요성이 더욱 중요해졌으며, 특히 여러 조각이나 큰 삽입이 포함된 도전적인 클로닝 프로젝트에서 더욱 그러했습니다.

오늘날 DNA 연결 계산은 분자 클로닝 작업 흐름의 필수적인 부분이며, 이와 같은 전용 계산기가 연구자들이 실험을 최적화하는 데 도움을 줍니다. 기본 공식은 대부분 변경되지 않았지만, 연결 효율성에 영향을 미치는 요인에 대한 이해는 향상되었습니다.

깁슨 어셈블리 및 골든 게이트 클로닝과 같은 대체 클로닝 방법의 출현은 새로운 계산 요구를 도입했지만, DNA 조각 간의 몰 비율이라는 기본 개념은 이러한 기술 전반에 걸쳐 여전히 중요합니다.

코드 예제

다양한 프로그래밍 언어로 구현된 DNA 연결 계산기의 예는 다음과 같습니다:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculate required insert amount in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculate vector volume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculate insert volume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculate buffer/water volume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Usage example in a cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calculate volumes for a DNA ligation reaction.
5    
6    Parameters:
7    vector_concentration (float): Concentration of vector DNA in ng/μL
8    vector_length (float): Length of vector DNA in base pairs
9    insert_concentration (float): Concentration of insert DNA in ng/μL
10    insert_length (float): Length of insert DNA in base pairs
11    molar_ratio (float): Desired molar ratio of insert:vector
12    total_volume (float): Total reaction volume in μL
13    vector_amount (float): Amount of vector DNA to use in ng (default: 50)
14    
15    Returns:
16    dict: Dictionary containing calculated volumes and amounts
17    """
18    # Calculate vector volume
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calculate required insert amount
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calculate insert volume
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calculate buffer/water volume
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Example usage
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convert lengths to kb for calculation
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calculate required insert amount
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calculate volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Example usage
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convert lengths to kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calculate required insert amount
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calculate volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Round to 2 decimal places
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convert lengths to kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calculate required insert amount
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calculate volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Round to 2 decimal places
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

자주 묻는 질문 (FAQ)

DNA 연결을 위한 최적의 몰 비율은 무엇인가요?

삽입과 벡터의 최적 몰 비율은 일반적으로 3:1에서 5:1 사이입니다. 그러나 이는 특정 연결 시나리오에 따라 달라질 수 있습니다:

• 블런트 엔드 연결: 3:1에서 5:1
• 스티키 엔드 연결: 1:1에서 3:1
• 큰 삽입 (>10 kb): 1:1에서 2:1
• 작은 삽입 (<500 bp): 5:1에서 10:1
• 다중 조각 조립: 각 삽입에 대해 3:1

계산된 부피를 사용해도 연결 반응이 실패하는 이유는 무엇인가요?

연결 효율성에 영향을 미치는 여러 요인이 있습니다:

1. DNA 품질: 벡터와 삽입 모두 손상 없이 깨끗한 끝을 가지고 있는지 확인하십시오.
2. 탈인산화: 벡터가 탈인산화되었는지 확인하십시오. 이는 자기 연결을 방지합니다.
3. 효소 활성: 리가제가 활성 상태인지 확인하고 올바른 온도에서 사용하십시오.
4. 인큐베이션 시간: 일부 연결은 더 긴 인큐베이션(16°C에서 하룻밤)이 유리합니다.
5. 완충 조건: ATP가 포함된 올바른 완충액을 사용하십시오.
6. 오염물질: DNA를 정제하여 EDTA 또는 고염과 같은 억제제를 제거하십시오.

연결 반응에 사용할 벡터 DNA의 양은 얼마인가요?

일반적으로 50-100 ng의 벡터 DNA가 표준 연결 반응에 권장됩니다. 너무 많은 벡터를 사용하면 잘라지지 않거나 자기 연결된 벡터의 배경이 높아질 수 있으며, 너무 적으면 형질 전환 효율이 감소할 수 있습니다. 도전적인 연결의 경우 이 양을 최적화해야 할 수도 있습니다.

블런트 엔드와 스티키 엔드 연결에 대한 계산을 조정해야 하나요?

예, 블런트 엔드 연결은 스티키 엔드(응집 끝) 연결보다 일반적으로 효율성이 낮습니다. 블런트 엔드 연결의 경우:

• 더 높은 몰 비율(3:1에서 5:1 또는 그 이상)을 사용하십시오.
• T4 DNA 리가제를 더 많이 사용하십시오(일반적으로 2-3배).
• 더 긴 인큐베이션 시간을 고려하십시오.
• 연결 효율성을 높이기 위해 PEG를 추가하는 것을 고려하십시오.

여러 삽입에 대한 연결을 어떻게 계산하나요?

다중 조각 조립의 경우:

1. 각 삽입 양을 개별적으로 동일한 공식을 사용하여 계산합니다.
2. 동일한 총 몰 비율을 유지합니다(예: 두 개의 삽입의 경우 1.5:1.5:1 삽입1:삽입2:벡터 사용).
3. 모든 DNA 조각을 수용할 수 있도록 총 반응 부피를 조정합니다.
4. 여러 조각이 포함된 경우 순차적 연결 또는 깁슨 어셈블리와 같은 방법을 고려하십시오.

이 계산기를 깁슨 어셈블리나 골든 게이트 어셈블리에 사용할 수 있나요?

이 계산기는 전통적인 제한 효소 및 리가제 기반 클로닝을 위해 특별히 설계되었습니다. 깁슨 어셈블리의 경우 모든 조각의 동량이 일반적으로 권장되지만, DNA 양을 길이에 따라 계산하는 기본적인 계산은 유사합니다. 골든 게이트 어셈블리의 경우 모든 구성 요소의 동량도 일반적으로 사용됩니다.

벡터 탈인산화를 계산에 어떻게 반영하나요?

벡터의 탈인산화(5' 인산 그룹 제거)는 자기 연결을 방지하지만 양 계산에는 영향을 미치지 않습니다. 그러나 탈인산화된 벡터의 경우:

1. 신선한 삽입 DNA를 사용하여 온전한 5' 인산을 유지하십시오.
2. 약간 높은 삽입:벡터 비율(4:1에서 6:1)을 사용하는 것을 고려하십시오.
3. 더 긴 연결 시간을 확보하십시오(상온에서 최소 1시간 또는 16°C에서 하룻밤).

최소 총 반응 부피는 얼마여야 하나요?

실용적인 최소 반응 부피는 일반적으로 10 μL이며, 이는 적절한 혼합을 허용하고 증발 문제를 방지합니다. 계산된 DNA 부피가 원하는 반응 부피를 초과하는 경우 몇 가지 옵션이 있습니다:

1. DNA 샘플의 농도를 높이십시오.
2. 사용되는 벡터의 양을 줄이십시오(예: 50 ng 대신 25 ng).
3. 총 반응 부피를 늘리십시오.
4. DNA 샘플을 농축하는 것을 고려하십시오.

연결 반응을 얼마나 오래 인큐베이션해야 하나요?

최적의 인큐베이션 시간은 연결 유형에 따라 다릅니다:

• 스티키 엔드 연결: 상온(22-25°C)에서 1시간 또는 16°C에서 4-16시간
• 블런트 엔드 연결: 상온에서 2-4시간 또는 16°C에서 하룻밤(12-16시간)
• 빠른 연결(고농도 리가제를 사용하는 경우): 상온에서 5-15분

남은 연결 반응을 형질 전환에 재사용할 수 있나요?

예, 연결 혼합물은 일반적으로 -20°C에서 저장하고 형질 전환에 재사용할 수 있습니다. 그러나 각 동결-해동 주기는 효율성을 감소시킬 수 있습니다. 최상의 결과를 위해:

1. 동결 전에 연결 혼합물을 분할하십시오.
2. 저장 전에 리가제를 열 불활성화하십시오(65°C에서 10분).
3. 최적의 결과를 위해 1-2개월 이내에 사용하십시오.

참고 문헌

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8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/