Калькулятор Лигации ДНК

Введение

Лигация ДНК — это критически важная молекулярно-биологическая техника, используемая для соединения фрагментов ДНК с помощью ковалентных связей. Калькулятор Лигации ДНК — это незаменимый инструмент для исследователей, помогающий определить оптимальные количества вектора и вставки ДНК, необходимых для успешных реакций лигации. Рассчитывая правильные мольные соотношения между вектором (плазмидой) и фрагментами вставки ДНК, этот калькулятор обеспечивает эффективные молекулярные клонирования, минимизируя потери реагентов и неудачные реакции.

Реакции лигации являются основополагающими для генетической инженерии, синтетической биологии и молекулярных клонирования. Они позволяют ученым создавать рекомбинантные молекулы ДНК, вставляя гены интереса в плазмидные векторы для последующей трансформации в хозяинские организмы. Успех этих реакций во многом зависит от использования соответствующих количеств компонентов ДНК, что именно и помогает определить этот калькулятор.

Будь то конструирование векторов экспрессии, создание библиотек генов или выполнение рутинного субклонирования, этот калькулятор лигации ДНК поможет вам оптимизировать ваши экспериментальные условия и увеличить вероятность успеха. Введя несколько ключевых параметров о ваших образцах ДНК, вы можете быстро получить точные объемы, необходимые для вашей конкретной реакции лигации.

Формула/Расчет

Калькулятор лигации ДНК использует основную формулу молекулярной биологии, которая учитывает различные размеры и концентрации соединяемых фрагментов ДНК. Основной расчет определяет, сколько вставки ДНК необходимо относительно векторной ДНК на основе их соответствующих длин и желаемого мольного соотношения.

Расчет количества вставки

Количество необходимой вставки ДНК (в нанограммах) рассчитывается по следующей формуле:

$\text{нг вставки} = \text{нг вектора} \times \frac{\text{кб размер вставки}}{\text{кб размер вектора}} \times \text{мольное соотношение}$

Где:

• нг вектора = количество используемой векторной ДНК в реакции (обычно 50-100 нг)
• кб размер вставки = длина фрагмента вставки ДНК в килобазах (кб)
• кб размер вектора = длина векторной ДНК в килобазах (кб)
• мольное соотношение = желаемое соотношение молекул вставки к молекулам вектора (обычно 3:1 до 5:1)

Расчеты объемов

После определения необходимого количества вставки ДНК рассчитываются необходимые объемы для реакции:

$\text{Объем вектора (μL)} = \frac{\text{нг вектора}}{\text{концентрация вектора (нг/μL)}}$

$\text{Объем вставки (μL)} = \frac{\text{нг вставки}}{\text{концентрация вставки (нг/μL)}}$

$\text{Объем буфера/воды (μL)} = \text{Общий объем реакции (μL)} - \text{Объем вектора (μL)} - \text{Объем вставки (μL)}$

Пример расчета

Давайте рассмотрим практический пример:

• Концентрация вектора: 50 нг/μL
• Длина вектора: 3000 п.н. (3 кб)
• Концентрация вставки: 25 нг/μL
• Длина вставки: 1000 п.н. (1 кб)
• Желательное мольное соотношение (вставка:вектор): 3:1
• Общий объем реакции: 20 μL
• Количество вектора для использования: 50 нг

Шаг 1: Рассчитайте необходимое количество вставки $\text{нг вставки} = 50 \text{ нг} \times \frac{1 \text{ кб}}{3 \text{ кб}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ нг}$

Шаг 2: Рассчитайте объемы $\text{Объем вектора} = \frac{50 \text{ нг}}{50 \text{ нг/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Объем вставки} = \frac{50 \text{ нг}}{25 \text{ нг/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Объем буфера/воды} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Этот расчет гарантирует, что в реакции будет три молекулы вставки на каждую молекулу вектора, оптимизируя шансы на успешную лигацию.

Пошаговое руководство по использованию калькулятора

Наш калькулятор лигации ДНК разработан так, чтобы быть интуитивно понятным и простым в использовании. Следуйте этим шагам, чтобы рассчитать оптимальные объемы для вашей реакции лигации:

1. Введите информацию о векторе:

   • Введите концентрацию вашего вектора в нг/μL
   • Укажите длину вектора в парах оснований (п.н.)
   • Укажите количество ДНК вектора, которое вы хотите использовать в реакции (нг)

2. Введите информацию о вставке:

   • Введите концентрацию вашей вставки в нг/μL
   • Укажите длину вставки в парах оснований (п.н.)

3. Установите параметры реакции:

   • Укажите желаемое мольное соотношение (вставка:вектор) - обычно от 3:1 до 5:1
   • Введите общий объем реакции в μL (обычно 10-20 μL)

4. Просмотрите результаты:

   • Калькулятор автоматически отобразит:
     • Необходимый объем вектора (μL)
     • Необходимый объем вставки (μL)
     • Объем буфера/воды для добавления (μL)
     • Общий объем реакции (μL)
     • Количество ДНК вектора и вставки в реакции (нг)

5. Скопируйте результаты (по желанию):

   • Используйте кнопку "Скопировать результаты", чтобы скопировать все расчеты в буфер обмена для вашего лабораторного журнала или протоколов

Калькулятор выполняет проверки на допустимость, чтобы гарантировать, что все вводимые данные являются положительными числами и что общий объем достаточен для требуемых объемов ДНК. Если будут обнаружены ошибки, полезные сообщения об ошибках помогут вам исправить вводимые данные.

Сценарии использования

Калькулятор лигации ДНК является ценным инструментом в различных областях молекулярной биологии:

Молекулярное клонирование

Наиболее распространенный сценарий использования — это стандартное молекулярное клонирование, где исследователи вставляют гены или фрагменты ДНК в плазмидные векторы. Калькулятор обеспечивает оптимальные условия для:

• Субклонирования генов между различными векторами экспрессии
• Создания белковых фузий путем соединения нескольких фрагментов генов
• Конструирования тестов с репортерными генами
• Построения библиотек плазмид

Синтетическая биология

В синтетической биологии, где часто собираются несколько фрагментов ДНК:

• Реакции Гибсона выигрывают от точных соотношений вставка:вектор
• Системы сборки Золотых Ворот требуют определенных концентраций ДНК
• Сборка BioBrick стандартных генетических частей
• Конструкция синтетических генетических схем

Разработка диагностических наборов

При разработке молекулярных диагностических инструментов:

• Клонирование специфических генетических маркеров заболеваний
• Конструирование положительных контрольных плазмид
• Разработка калибровочных стандартов для qPCR

Системы экспрессии белков

Для исследователей, работающих над производством белков:

• Оптимизация соотношений вставка:вектор для векторов высокой копии
• Конструирование индуцируемых систем экспрессии
• Создание векторов секреции для очистки белков

Приложения CRISPR-Cas9

В приложениях редактирования генома:

• Клонирование направляющих РНК в векторы CRISPR
• Создание шаблонов доноров для направленного ремонта по гомологии
• Построение библиотек направляющих РНК для скрининга

Сложные лигации

Калькулятор особенно ценен для сложных сценариев лигации:

• Клонирование крупных вставок (>5 кб)
• Вставки очень маленьких фрагментов (<100 п.н.)
• Лигации с тупыми концами, которые имеют низкую эффективность
• Реакции сборки с несколькими фрагментами

Альтернативы

Хотя наш калькулятор лигации ДНК предоставляет точные расчеты для традиционных реакций лигации, существуют несколько альтернативных подходов для соединения фрагментов ДНК:

1. Сборка Гибсона: Использует экзонуклеазу, полимеразу и лигазу в одной реакции в одной пробирке для соединения перекрывающихся фрагментов ДНК. Традиционные расчеты лигации не требуются, но соотношения концентраций все еще важны.

2. Сборка Золотых Ворот: Использует ферменты рестрикции типа IIS для направленного, безшрамного соединения нескольких фрагментов. Требует эквимолярных количеств всех фрагментов.

3. SLIC (Клонирование независимое от лигации): Использует экзонуклеазу для создания одноцепочечных выступов, которые соединяются вместе. Обычно использует эквимолярные соотношения фрагментов.

4. In-Fusion Cloning: Коммерческая система, позволяющая соединять фрагменты с 15 п.н. перекрытия. Использует специфическое соотношение на основе размеров фрагментов.

5. Клонирование Gateway: Использует специфическую рекомбинацию, а не лигацию. Требует специфических векторов входа и назначения.

6. Эмпирическое тестирование: Некоторые лаборатории предпочитают настраивать несколько реакций лигации с различными соотношениями вставка:вектор (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) и определять, что работает лучше всего для их конкретных конструкций.

7. Программные калькуляторы: Коммерческие программные пакеты, такие как Vector NTI и SnapGene, включают калькуляторы лигации с дополнительными функциями, такими как анализ рестрикционных сайтов.

История

Разработка расчетов лигации ДНК параллельна эволюции техник молекулярного клонирования, которые революционизировали молекулярную биологию и биотехнологию.

Ранние разработки (1970-е)

Концепция лигации ДНК для молекулярного клонирования появилась в начале 1970-х годов с pioneering работ Поля Берга, Герберта Бойера и Стэнли Коэна, которые разработали первые рекомбинантные молекулы ДНК. В этот период реакции лигации были в основном эмпирическими, и исследователи использовали метод проб и ошибок для определения оптимальных условий.

Открытие рестрикционных ферментов и ДНК-лигазы предоставило необходимые инструменты для разрезания и повторного соединения молекул ДНК. Т4 ДНК-лигаза, изолированная из инфицированных фагом Т4 E. coli, стала стандартным ферментом для соединения фрагментов ДНК благодаря своей способности лигировать как тупые, так и когезивные концы.

Период усовершенствования (1980-е-1990-е)

По мере того как молекулярное клонирование стало более рутинным, исследователи начали разрабатывать более систематические подходы к реакциям лигации. Важность мольных соотношений между вектором и вставкой ДНК стала очевидной, что привело к разработке основной формулы, которая используется до сих пор.

В этот период исследователи установили, что избыток вставочной ДНК (обычно 3:1 до 5:1 мольного соотношения вставки к вектору) в целом улучшает эффективность лигации для стандартных приложений клонирования. Эти знания сначала были распространены через лабораторные протоколы и постепенно попали в молекулярно-биологические руководства и учебники.

Современная эпоха (2000-е - настоящее время)

Появление вычислительных инструментов и онлайн-калькуляторов в 2000-х годах сделало точные расчеты лигации более доступными для исследователей. По мере того как молекулярно-биологические техники становились более сложными, необходимость в точных расчетах становилась все более критической, особенно для сложных проектов клонирования, включающих несколько фрагментов или крупные вставки.

Сегодня расчеты лигации ДНК являются неотъемлемой частью рабочих процессов молекулярного клонирования, а специализированные калькуляторы, такие как этот, помогают исследователям оптимизировать свои эксперименты. Основная формула осталась практически неизменной, хотя наше понимание факторов, влияющих на эффективность лигации, улучшилось.

Появление альтернативных методов клонирования, таких как сборка Гибсона и сборка Золотых Ворот, ввело новые потребности в расчетах, но основная концепция мольных соотношений между фрагментами ДНК остается важной для всех этих техник.

Примеры кода

Вот реализации калькулятора лигации ДНК на различных языках программирования:

1' Функция VBA Excel для калькулятора лигации ДНК
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Рассчитать необходимое количество вставки в нг
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Рассчитать объем вектора в μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Рассчитать объем вставки в μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Рассчитать объем буфера/воды в μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Пример использования в ячейке:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Рассчитать объемы для реакции лигации ДНК.
5    
6    Параметры:
7    vector_concentration (float): Концентрация векторной ДНК в нг/μL
8    vector_length (float): Длина векторной ДНК в парах оснований
9    insert_concentration (float): Концентрация вставочной ДНК в нг/μL
10    insert_length (float): Длина вставки ДНК в парах оснований
11    molar_ratio (float): Желательное мольное соотношение вставка:вектор
12    total_volume (float): Общий объем реакции в μL
13    vector_amount (float): Количество векторной ДНК для использования в нг (по умолчанию: 50)
14    
15    Возвращает:
16    dict: Словарь, содержащий рассчитанные объемы и количества
17    """
18    # Рассчитать объем вектора
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Рассчитать необходимое количество вставки
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Рассчитать объем вставки
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Рассчитать объем буфера/воды
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Пример использования
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Вектор: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} нг)")
51print(f"Вставка: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} нг)")
52print(f"Буфер: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Всего: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Преобразовать длины в кб для расчета
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Рассчитать необходимое количество вставки
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Рассчитать объемы
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Пример использования
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Вектор: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} нг)`);
27console.log(`Вставка: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} нг)`);
28console.log(`Буфер: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Всего: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Преобразовать длины в кб
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Рассчитать необходимое количество вставки
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Рассчитать объемы
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Округлить до 2 десятичных знаков
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Вектор: %.2f μL (%.2f нг)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Вставка: %.2f μL (%.2f нг)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Буфер: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Всего: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Преобразовать длины в кб
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Рассчитать необходимое количество вставки
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Рассчитать объемы
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Округлить до 2 десятичных знаков
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Вектор: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " нг)" << std::endl;
44    std::cout << "Вставка: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " нг)" << std::endl;
45    std::cout << "Буфер: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Всего: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Часто задаваемые вопросы (FAQ)

Какое оптимальное мольное соотношение для лигации ДНК?

Оптимальное мольное соотношение вставки к вектору обычно колеблется от 3:1 до 5:1 для стандартных приложений клонирования. Однако это может варьироваться в зависимости от конкретного сценария лигации:

• Для лигаций с когезивными концами: 1:1 до 3:1
• Для крупных вставок (>10 кб): 1:1 до 2:1
• Для маленьких вставок (<500 п.н.): 5:1 до 10:1
• Для сборки нескольких фрагментов: 3:1 для каждой вставки к вектору

Почему моя реакция лигации не удалась, несмотря на использование рассчитанных объемов?

Несколько факторов могут повлиять на эффективность лигации помимо мольного соотношения:

1. Качество ДНК: Убедитесь, что как вектор, так и вставка имеют чистые концы без повреждений
2. Дефосфорилирование: Проверьте, был ли ваш вектор дефосфорилирован, что предотвращает самолигацию
3. Активность фермента: Убедитесь, что ваш лигаза активен и использован при правильной температуре
4. Время инкубации: Некоторые лигации выигрывают от более длительной инкубации (на ночь при 16°C)
5. Условия буфера: Убедитесь, что используется правильный буфер с АТФ
6. Загрязнители: Очистите ДНК, чтобы удалить ингибиторы, такие как ЭДТА или высокая концентрация соли

Сколько ДНК вектора мне следует использовать в реакции лигации?

Обычно рекомендуется использовать 50-100 нг векторной ДНК для стандартных реакций лигации. Использование слишком большого количества вектора может привести к повышенному фону незаконченной или самолигационной векторной ДНК, в то время как слишком малое количество может снизить эффективность трансформации. Для сложных лигаций вам может потребоваться оптимизировать это количество.

Должен ли я корректировать расчеты для лигаций с тупыми концами по сравнению с когезивными?

Да. Лигации с тупыми концами обычно менее эффективны, чем лигации с когезивными концами. Для лигаций с тупыми концами используйте:

• Более высокие мольные соотношения (3:1 до 5:1 или даже выше)
• Больше Т4 ДНК-лигазы (обычно в 2-3 раза больше)
• Более длительное время инкубации
• Рассмотрите возможность добавления ПЭГ для повышения эффективности лигации

Как я могу рассчитать лигацию для нескольких вставок?

Для сборки нескольких фрагментов:

1. Рассчитайте каждое количество вставки отдельно, используя ту же формулу
2. Поддерживайте общее мольное соотношение (например, для двух вставок используйте 1.5:1.5:1 вставка1:вставка2:вектор)
3. Настройте общий объем реакции, чтобы учесть все фрагменты ДНК
4. Рассмотрите возможность последовательной лигации или использования методов сборки, таких как сборка Гибсона, для нескольких фрагментов

Могу ли я использовать этот калькулятор для сборки Гибсона или сборки Золотых Ворот?

Этот калькулятор специально разработан для традиционного клонирования с использованием рестрикционных ферментов и лигазы. Для сборки Гибсона обычно рекомендуются эквимолярные количества всех фрагментов (1:1), хотя базовый расчет количества ДНК на основе длины аналогичен. Для сборки Золотых Ворот также обычно используются эквимолярные соотношения всех компонентов.

Как мне учесть дефосфорилирование вектора в моих расчетах?

Дефосфорилирование вектора (удаление 5' фосфатных групп) предотвращает самолигацию, но не меняет расчеты количества. Однако для дефосфорилированных векторов:

1. Используйте свежую вставочную ДНК с неповрежденными 5' фосфатами
2. Рассмотрите возможность использования слегка более высоких соотношений вставка:вектор (4:1 до 6:1)
3. Убедитесь, что время лигации больше (по крайней мере 1 час при комнатной температуре или на ночь при 16°C)

Каков минимальный общий объем реакции, который я должен использовать?

Минимальный практический объем реакции обычно составляет 10 μL, что позволяет обеспечить адекватное смешивание и предотвращает проблемы с испарением. Если ваши рассчитанные объемы ДНК превышают желаемый объем реакции, у вас есть несколько вариантов:

1. Используйте более концентрированные образцы ДНК
2. Уменьшите количество используемого вектора (например, 25 нг вместо 50 нг)
3. Увеличьте общий объем реакции
4. Рассмотрите возможность концентрирования ваших образцов ДНК

Как долго мне следует инкубировать мою реакцию лигации?

Оптимальное время инкубации варьируется в зависимости от типа лигации:

• Лигации с когезивными концами: 1 час при комнатной температуре (22-25°C) или 4-16 часов при 16°C
• Лигации с тупыми концами: 2-4 часа при комнатной температуре или на ночь (12-16 часов) при 16°C
• Быстрые лигации (с использованием высококонцентрированной лигазы): 5-15 минут при комнатной температуре

Могу ли я повторно использовать оставшуюся реакцию лигации для трансформации?

Да, смеси лигации обычно можно хранить при -20°C и повторно использовать для трансформации. Однако каждая заморозка-оттаивание может снизить эффективность. Для достижения наилучших результатов:

1. Разделите смесь лигации перед замораживанием
2. Устраните активность лигазы (65°C в течение 10 минут) перед хранением
3. Используйте в течение 1-2 месяцев для оптимальных результатов

Ссылки

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/