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ஆவணம்

DNA Ligation Calculator

Introduction

DNA लिगेशन एक महत्वपूर्ण आणविक जीवविज्ञान तकनीक है जो DNA टुकड़ों को सहसंयोजक बंधनों के साथ जोड़ने के लिए उपयोग की जाती है। DNA लिगेशन कैलकुलेटर शोधकर्ताओं के लिए एक आवश्यक उपकरण है, जो सफल लिगेशन प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक वेक्टर और इंसर्ट DNA की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने में मदद करता है। वेक्टर (प्लास्मिड) और इंसर्ट DNA टुकड़ों के बीच सही मोलर अनुपात की गणना करके, यह कैलकुलेटर कुशल आणविक क्लोनिंग प्रयोगों को सुनिश्चित करता है जबकि बर्बाद होने वाले अभिकर्ताओं और असफल प्रतिक्रियाओं को कम करता है।

लिगेशन प्रतिक्रियाएँ आनुवंशिक इंजीनियरिंग, सिंथेटिक जीवविज्ञान, और आणविक क्लोनिंग प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं। ये वैज्ञानिकों को प्लास्मिड वेक्टर में रुचि के जीन डालने की अनुमति देती हैं ताकि उन्हें मेज़बान जीवों में बाद में स्थानांतरित किया जा सके। इन प्रतिक्रियाओं की सफलता का बहुत अधिक निर्भर करता है कि DNA घटकों की उपयुक्त मात्रा का उपयोग किया गया है, जो कि इस कैलकुलेटर द्वारा निर्धारित किया जाता है।

चाहे आप अभिव्यक्ति वेक्टर का निर्माण कर रहे हों, जीन पुस्तकालय बना रहे हों, या नियमित सबक्लोनिंग कर रहे हों, यह DNA लिगेशन कैलकुलेटर आपके प्रयोगात्मक परिस्थितियों को अनुकूलित करने और आपकी सफलता की दर बढ़ाने में मदद करेगा। अपने DNA नमूनों के बारे में कुछ प्रमुख पैरामीटर दर्ज करके, आप अपने विशेष लिगेशन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सटीक मात्रा जल्दी प्राप्त कर सकते हैं।

Formula/Calculation

DNA लिगेशन कैलकुलेटर एक मौलिक आणविक जीवविज्ञान सूत्र का उपयोग करता है जो जोड़े जा रहे DNA टुकड़ों के विभिन्न आकारों और सांद्रता को ध्यान में रखता है। प्राथमिक गणना यह निर्धारित करती है कि वेक्टर DNA के सापेक्ष कितनी इंसर्ट DNA की आवश्यकता है जो उनके संबंधित लंबाई और इच्छित मोलर अनुपात के आधार पर है।

Insert Amount Calculation

आवश्यक इंसर्ट DNA की मात्रा (नैनोग्राम में) निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गणना की जाती है:

ng of insert=ng of vector×kb size of insertkb size of vector×molar ratio\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}

जहाँ:

  • ng of vector = प्रतिक्रिया में उपयोग की जाने वाली वेक्टर DNA की मात्रा (आमतौर पर 50-100 ng)
  • kb size of insert = इंसर्ट DNA टुकड़े की लंबाई किलोबेस (kb) में
  • kb size of vector = वेक्टर DNA की लंबाई किलोबेस (kb) में
  • molar ratio = इंसर्ट अणुओं और वेक्टर अणुओं का इच्छित अनुपात (आमतौर पर 3:1 से 5:1)

Volume Calculations

एक बार जब आवश्यक इंसर्ट DNA की मात्रा निर्धारित हो जाती है, तो प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा की गणना की जाती है:

Vector volume (μL)=ng of vectorvector concentration (ng/μL)\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}

Insert volume (μL)=ng of insertinsert concentration (ng/μL)\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}

Buffer/water volume (μL)=Total reaction volume (μL)−Vector volume (μL)−Insert volume (μL)\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}

Example Calculation

आइए एक व्यावहारिक उदाहरण पर विचार करें:

  • वेक्टर सांद्रता: 50 ng/μL
  • वेक्टर लंबाई: 3000 bp (3 kb)
  • इंसर्ट सांद्रता: 25 ng/μL
  • इंसर्ट लंबाई: 1000 bp (1 kb)
  • इच्छित मोलर अनुपात (इंसर्ट:वेक्टर): 3:1
  • कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 20 μL
  • उपयोग करने के लिए वेक्टर की मात्रा: 50 ng

चरण 1: आवश्यक इंसर्ट मात्रा की गणना करें ng of insert=50 ng×1 kb3 kb×3=50×0.33×3=50 ng\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}

चरण 2: मात्रा की गणना करें Vector volume=50 ng50 ng/μL=1 μL\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}

Insert volume=50 ng25 ng/μL=2 μL\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}

Buffer/water volume=20 μL−1 μL−2 μL=17 μL\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}

यह गणना सुनिश्चित करती है कि प्रतिक्रिया में प्रत्येक वेक्टर अणु के लिए तीन इंसर्ट अणु हैं, जो सफल लिगेशन की संभावनाओं को अनुकूलित करता है।

Step-by-Step Guide to Using the Calculator

हमारा DNA लिगेशन कैलकुलेटर सहज और सरल उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है। अपने लिगेशन प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम मात्रा की गणना करने के लिए इन चरणों का पालन करें:

  1. वेक्टर जानकारी दर्ज करें:

    • अपने वेक्टर की सांद्रता ng/μL में दर्ज करें
    • वेक्टर की लंबाई को बेस पेयर (bp) में दर्ज करें
    • प्रतिक्रिया में उपयोग करने के लिए वेक्टर DNA की मात्रा (ng) निर्दिष्ट करें

  2. इंसर्ट जानकारी दर्ज करें:

    • अपने इंसर्ट की सांद्रता ng/μL में दर्ज करें
    • इंसर्ट की लंबाई को बेस पेयर (bp) में दर्ज करें

  3. प्रतिक्रिया पैरामीटर सेट करें:

    • इच्छित मोलर अनुपात (इंसर्ट:वेक्टर) निर्दिष्ट करें - आमतौर पर 3:1 से 5:1
    • कुल प्रतिक्रिया मात्रा μL में दर्ज करें (आमतौर पर 10-20 μL)

  4. परिणाम देखें:

    • कैलकुलेटर स्वचालित रूप से प्रदर्शित करेगा:
      • आवश्यक वेक्टर मात्रा (μL)
      • आवश्यक इंसर्ट मात्रा (μL)
      • जोड़ने के लिए आवश्यक बफर/पानी की मात्रा (μL)
      • कुल प्रतिक्रिया मात्रा (μL)
      • प्रतिक्रिया में वेक्टर और इंसर्ट DNA की मात्रा (ng)

  5. परिणाम कॉपी करें (वैकल्पिक):

    • अपने प्रयोगशाला नोटबुक या प्रोटोकॉल के लिए सभी गणनाओं को अपने क्लिपबोर्ड पर कॉपी करने के लिए "कॉपी परिणाम" बटन का उपयोग करें

कैलकुलेटर सभी इनपुट सकारात्मक संख्याएँ हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए मान्यता जांच करता है कि कुल मात्रा आवश्यक DNA मात्रा के लिए पर्याप्त है। यदि कोई त्रुटियाँ पाई जाती हैं, तो सहायक त्रुटि संदेश आपको इनपुट को सुधारने के लिए मार्गदर्शन करेंगे।

Use Cases

DNA लिगेशन कैलकुलेटर कई आणविक जीवविज्ञान अनुप्रयोगों में मूल्यवान है:

Molecular Cloning

सबसे सामान्य उपयोग मामला मानक आणविक क्लोनिंग है, जहाँ शोधकर्ता जीन या DNA टुकड़ों को प्लास्मिड वेक्टर में डालते हैं। कैलकुलेटर सुनिश्चित करता है कि:

  • विभिन्न अभिव्यक्ति वेक्टरों के बीच जीन का सबक्लोनिंग
  • कई जीन टुकड़ों को जोड़कर फ्यूजन प्रोटीन बनाना
  • रिपोर्टर जीन परीक्षणों का निर्माण
  • प्लास्मिड पुस्तकालयों का निर्माण

Synthetic Biology

सिंथेटिक जीवविज्ञान में, जहाँ अक्सर कई DNA टुकड़ों को इकट्ठा किया जाता है:

  • गिब्सन असेंबली प्रतिक्रियाएँ सटीक इंसर्ट:वेक्टर अनुपातों से लाभ उठाती हैं
  • गोल्डन गेट असेंबली सिस्टम विशिष्ट DNA सांद्रताओं की आवश्यकता होती है
  • मानकीकृत आनुवंशिक भागों की बायोब्रिक असेंबली
  • सिंथेटिक आनुवंशिक सर्किट का निर्माण

Diagnostic Kit Development

मॉलिक्यूलर डायग्नोस्टिक उपकरण विकसित करने के दौरान:

  • रोग-विशिष्ट आनुवंशिक मार्करों का क्लोनिंग
  • सकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड का निर्माण
  • qPCR के लिए कैलिब्रेशन मानकों का विकास

Protein Expression Systems

प्रोटीन उत्पादन पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए:

  • उच्च-कॉपी अभिव्यक्ति वेक्टरों के लिए इंसर्ट:वेक्टर अनुपात का अनुकूलन
  • प्रेरक अभिव्यक्ति सिस्टम का निर्माण
  • प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए स्राव वेक्टर बनाना

CRISPR-Cas9 Applications

जीनोम संपादन अनुप्रयोगों में:

  • CRISPR वेक्टरों में गाइड RNA का क्लोनिंग
  • होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के लिए दाता टेम्पलेट बनाना
  • स्क्रीनिंग के लिए गाइड RNA के पुस्तकालयों का निर्माण

Challenging Ligations

कैलकुलेटर विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण लिगेशन परिदृश्यों के लिए मूल्यवान है:

  • बड़े इंसर्ट क्लोनिंग (>5 kb)
  • बहुत छोटे टुकड़ों का इंसर्शन (<100 bp)
  • ब्लंट-एंड लिगेशन जो कम कुशलता रखते हैं
  • मल्टी-फ्रैगमेंट असेंबली प्रतिक्रियाएँ

Alternatives

हालांकि हमारा DNA लिगेशन कैलकुलेटर पारंपरिक लिगेशन प्रतिक्रियाओं के लिए सटीक गणनाएँ प्रदान करता है, लेकिन DNA टुकड़ों को जोड़ने के लिए कई वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं:

  1. Gibson Assembly: ओवरलैपिंग DNA टुकड़ों को जोड़ने के लिए एकल-ट्यूब प्रतिक्रिया में एक्सोन्यूक्लियेज, पॉलीमरेज़ और लिगेज़ का उपयोग करता है। पारंपरिक लिगेशन गणना की आवश्यकता नहीं है, लेकिन सांद्रता अनुपात अभी भी महत्वपूर्ण हैं।

  2. Golden Gate Assembly: दिशा-निर्देशित, बिना दाग के कई टुकड़ों के असेंबली के लिए टाइप IIS प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है। सभी टुकड़ों की समान मात्रा की आवश्यकता होती है।

  3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): एकस्ट्रा-न्यूक्लियोज़ को एकल-स्ट्रैंड ओवरहैंग बनाने के लिए उपयोग करता है जो एक साथ जुड़ते हैं। आमतौर पर टुकड़ों की समान मात्रा का उपयोग किया जाता है।

  4. In-Fusion Cloning: एक व्यावसायिक प्रणाली जो 15 bp ओवरलैप के साथ टुकड़ों को जोड़ने की अनुमति देती है। टुकड़ों के आकार के आधार पर एक विशिष्ट अनुपात का उपयोग करती है।

  5. Gateway Cloning: लिगेशन के बजाय साइट-विशिष्ट पुनः संयोजन का उपयोग करता है। विशिष्ट प्रवेश और गंतव्य वेक्टर की आवश्यकता होती है।

  6. Empirical Testing: कुछ प्रयोगशालाएँ विभिन्न इंसर्ट:वेक्टर अनुपात (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) के साथ कई लिगेशन प्रतिक्रियाएँ स्थापित करने को प्राथमिकता देती हैं और यह निर्धारित करती हैं कि उनके विशिष्ट निर्माण के लिए कौन सा सबसे अच्छा काम करता है।

  7. Software Calculators: व्यावसायिक सॉफ़्टवेयर पैकेज जैसे Vector NTI और SnapGene में अतिरिक्त सुविधाओं के साथ लिगेशन कैलकुलेटर शामिल हैं जैसे कि प्रतिबंध साइट विश्लेषण।

History

DNA लिगेशन गणनाओं का विकास आणविक क्लोनिंग तकनीकों के विकास के समानांतर है, जिसने आणविक जीवविज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में क्रांति ला दी है।

Early Developments (1970s)

DNA लिगेशन की अवधारणा आणविक क्लोनिंग के लिए 1970 के दशक में पॉल बर्ग, हर्बर्ट बॉयर और स्टेनली कोहेन के पहले काम के साथ उभरी, जिन्होंने पहले पुनः संयोजित DNA अणुओं का विकास किया। इस अवधि के दौरान, लिगेशन प्रतिक्रियाएँ मुख्य रूप से अनुभवात्मक थीं, जिसमें शोधकर्ता इष्टतम परिस्थितियों का निर्धारण करने के लिए परीक्षण और त्रुटि का उपयोग करते थे।

प्रतिबंध एंजाइमों और DNA लिगेज़ की खोज ने DNA अणुओं को काटने और फिर से जोड़ने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान किए। T4 DNA लिगेज़, जो T4 बैक्टीरियोफेज से संक्रमित E. coli से अलग किया गया था, ब्लंट और कोहेसिव दोनों सिरों को जोड़ने की अपनी क्षमता के कारण DNA टुकड़ों को जोड़ने के लिए मानक एंजाइम बन गया।

Refinement Period (1980s-1990s)

जैसे-जैसे आणविक क्लोनिंग अधिक नियमित होती गई, शोधकर्ताओं ने लिगेशन प्रतिक्रियाओं के लिए अधिक प्रणालीगत दृष्टिकोण विकसित करना शुरू किया। वेक्टर और इंसर्ट DNA के बीच मोलर अनुपात का महत्व स्पष्ट हो गया, जिससे आज भी उपयोग में आने वाले मूल सूत्र का विकास हुआ।

इस अवधि के दौरान, शोधकर्ताओं ने स्थापित किया कि अतिरिक्त इंसर्ट DNA (आमतौर पर 3:1 से 5:1 मोलर अनुपात) आमतौर पर मानक क्लोनिंग अनुप्रयोगों के लिए लिगेशन दक्षता में सुधार करता है। यह ज्ञान प्रारंभ में प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के माध्यम से साझा किया गया और धीरे-धीरे आणविक जीवविज्ञान पुस्तकों और पाठ्यपुस्तकों में शामिल हो गया।

Modern Era (2000s-Present)

2000 के दशक में कंप्यूटेशनल उपकरणों और ऑनलाइन कैलकुलेटरों का आगमन सटीक लिगेशन गणनाओं को शोधकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ बना दिया। जैसे-जैसे आणविक जीवविज्ञान तकनीकें अधिक परिष्कृत होती गईं, सटीक गणनाओं की आवश्यकता अधिक महत्वपूर्ण हो गई, विशेष रूप से कई टुकड़ों या बड़े इंसर्ट वाले चुनौतीपूर्ण क्लोनिंग प्रोजेक्ट्स के लिए।

आज, DNA लिगेशन गणनाएँ आणविक क्लोनिंग कार्यप्रवाह का एक अभिन्न हिस्सा हैं, जिसमें इस कैलकुलेटर जैसे समर्पित कैलकुलेटर शोधकर्ताओं को उनके प्रयोगों का अनुकूलन करने में मदद करते हैं। मूल सूत्र बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित रहा है, हालांकि लिगेशन दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों की हमारी समझ में सुधार हुआ है।

गिब्सन असेंबली और गोल्डन गेट क्लोनिंग जैसी वैकल्पिक क्लोनिंग विधियों के उद्भव ने नए गणना आवश्यकताओं को पेश किया है, लेकिन DNA टुकड़ों के बीच मोलर अनुपात की मूलभूत अवधारणा इन तकनीकों में महत्वपूर्ण बनी हुई है।

Code Examples

यहाँ विभिन्न प्रोग्रामिंग भाषाओं में DNA लिगेशन कैलकुलेटर के कार्यान्वयन हैं:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculate required insert amount in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculate vector volume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculate insert volume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculate buffer/water volume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Usage example in a cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

Frequently Asked Questions (FAQ)

What is the optimal molar ratio for DNA ligation?

DNA लिगेशन के लिए इष्टतम मोलर अनुपात आमतौर पर मानक क्लोनिंग अनुप्रयोगों के लिए 3:1 से 5:1 के बीच होता है। हालाँकि, यह विशिष्ट लिगेशन परिदृश्य के आधार पर भिन्न हो सकता है:

  • ब्लंट-एंड लिगेशन के लिए: 3:1 से 5:1
  • स्टिकी-एंड लिगेशन के लिए: 1:1 से 3:1
  • बड़े इंसर्ट (>10 kb) के लिए: 1:1 से 2:1
  • छोटे इंसर्ट (<500 bp) के लिए: 5:1 से 10:1
  • मल्टी-फ्रैगमेंट असेंबली के लिए: प्रत्येक इंसर्ट से वेक्टर के लिए 3:1

Why is my ligation reaction failing despite using the calculated volumes?

लिगेशन दक्षता को प्रभावित करने वाले कई कारक हैं जो मोलर अनुपात से परे हैं:

  1. DNA गुणवत्ता: सुनिश्चित करें कि दोनों वेक्टर और इंसर्ट के अंत साफ हैं और कोई क्षति नहीं है
  2. डीफॉस्फोराइलेशन: जाँच करें कि क्या आपके वेक्टर को डीफॉस्फोराइलेट किया गया था, जो आत्म-लिगेशन को रोकता है
  3. एंजाइम गतिविधि: सत्यापित करें कि आपका लिगेज सक्रिय है और सही तापमान पर उपयोग किया गया है
  4. इनक्यूबेशन समय: कुछ लिगेशन लंबे इनक्यूबेशन (16°C पर रात भर) से लाभ उठाते हैं
  5. बफर की स्थिति: सुनिश्चित करें कि ATP के साथ सही बफर का उपयोग किया गया है
  6. संदूषक: DNA को शुद्ध करें ताकि EDTA या उच्च नमक जैसे अवरोधकों को हटा सकें

How much vector DNA should I use in a ligation reaction?

आम तौर पर, 50-100 ng वेक्टर DNA को मानक लिगेशन प्रतिक्रियाओं के लिए अनुशंसित किया जाता है। बहुत अधिक वेक्टर का उपयोग करने से बिना काटे या आत्म-लिगेटेड वेक्टर की उच्च पृष्ठभूमि हो सकती है, जबकि बहुत कम उपयोग करने से परिवर्तन दक्षता कम हो सकती है। चुनौतीपूर्ण लिगेशनों के लिए, आपको इस मात्रा को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

Should I adjust calculations for blunt-end versus sticky-end ligations?

हाँ। ब्लंट-एंड लिगेशन आमतौर पर स्टिकी-एंड (कोहेसिव-एंड) लिगेशन की तुलना में कम कुशल होते हैं। ब्लंट-एंड लिगेशन के लिए, उच्च मोलर अनुपात (3:1 से 5:1 या उससे भी अधिक) का उपयोग करें, अधिक T4 DNA लिगेज़ (आमतौर पर 2-3 गुना अधिक), और लंबे इनक्यूबेशन समय पर विचार करें। PEG जोड़ने पर विचार करें जिससे लिगेशन दक्षता बढ़ सके।

How do I calculate ligation for multiple inserts?

कई टुकड़ों के असेंबली के लिए:

  1. प्रत्येक इंसर्ट मात्रा को अलग-अलग गणना करें उसी सूत्र का उपयोग करके
  2. कुल मोलर अनुपात को समान रखें (जैसे, दो इंसर्ट के लिए, 1.5:1.5:1 इंसर्ट1:इंसर्ट2:वेक्टर का उपयोग करें)
  3. सभी DNA टुकड़ों के लिए कुल प्रतिक्रिया मात्रा को समायोजित करें
  4. कई टुकड़ों के लिए गिब्सन असेंबली जैसी विधियों का उपयोग करने पर विचार करें

Can I use this calculator for Gibson Assembly or Golden Gate Assembly?

यह कैलकुलेटर विशेष रूप से पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम और लिगेज़-आधारित क्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। गिब्सन असेंबली के लिए, सभी टुकड़ों की समान मात्रा आमतौर पर अनुशंसित होती है (1:1 अनुपात), हालाँकि DNA मात्रा की गणना का मूल सिद्धांत समान है। गोल्डन गेट असेंबली के लिए, सभी घटकों के समान मात्रा का उपयोग भी आमतौर पर किया जाता है।

How do I account for vector dephosphorylation in my calculations?

वेक्टर के डीफॉस्फोराइलेशन (5' फॉस्फेट समूहों को हटाना) आत्म-लिगेशन को रोकता है लेकिन मात्रा गणनाओं को नहीं बदलता है। हालाँकि, डीफॉस्फोराइलेटेड वेक्टर के लिए:

  1. सुनिश्चित करें कि ताजा इंसर्ट DNA के 5' फॉस्फेट intact हैं
  2. थोड़ा उच्च इंसर्ट:वेक्टर अनुपात (4:1 से 6:1) का उपयोग करने पर विचार करें
  3. लंबे लिगेशन समय (कम से कम 1 घंटे कमरे के तापमान पर या रात भर 16°C पर) का उपयोग करें

What's the minimum total reaction volume I should use?

न्यूनतम व्यावहारिक प्रतिक्रिया मात्रा आमतौर पर 10 μL होती है, जो उचित मिश्रण की अनुमति देती है और वाष्पीकरण की समस्याओं को रोकती है। यदि आपकी गणना की गई DNA मात्रा इच्छित प्रतिक्रिया मात्रा से अधिक हो जाती है, तो आपके पास कई विकल्प हैं:

  1. अधिक सांद्रता वाले DNA नमूनों का उपयोग करें
  2. उपयोग की जाने वाली वेक्टर की मात्रा को कम करें (जैसे, 50 ng के बजाय 25 ng)
  3. कुल प्रतिक्रिया मात्रा बढ़ाएँ
  4. अपने DNA नमूनों को संकुचित करने पर विचार करें

How long should I incubate my ligation reaction?

इष्टतम इनक्यूबेशन समय लिगेशन के प्रकार के आधार पर भिन्न होता है:

  • स्टिकी-एंड लिगेशन: 1 घंटा कमरे के तापमान पर (22-25°C) या 4-16 घंटे 16°C पर
  • ब्लंट-एंड लिगेशन: 2-4 घंटे कमरे के तापमान पर या रात भर (12-16 घंटे) 16°C पर
  • त्वरित लिगेशन (उच्च सांद्रता वाले लिगेज़ का उपयोग करते हुए): 5-15 मिनट कमरे के तापमान पर

Can I reuse leftover ligation reaction for transformation?

हाँ, लिगेशन मिश्रणों को आमतौर पर -20°C पर संग्रहीत किया जा सकता है और परिवर्तन के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। हालाँकि, प्रत्येक फ्रीज-थॉ के चक्र से दक्षता कम हो सकती है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए:

  1. फ्रीज़ करने से पहले लिगेशन मिश्रण को अलिक्वोट करें
  2. भंडारण से पहले लिगेज़ को गर्म करें (65°C पर 10 मिनट)
  3. सर्वोत्तम परिणामों के लिए 1-2 महीने के भीतर उपयोग करें

References

  1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

  2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

  3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

  4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

  5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

  6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

  7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

  8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

  9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

  10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/

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