Calculadora de Diluição Celular

Uma calculadora de diluição celular determina quanto de suspensão celular e quanto de diluente devem ser misturados para atingir uma concentração celular desejada em um volume final escolhido. Ela é usada em cultura celular, microbiologia e outros trabalhos laboratoriais nos quais uma amostra precisa atingir uma concentração exata antes do uso.

O que significa diluição celular

Diluir uma suspensão celular não altera a quantidade de células que ela contém. Isso apenas altera o volume em que as células ficam, reduzindo a concentração. Uma suspensão contada a 1.000.000 células por mililitro (células/mL) ainda contém o mesmo número total de células após a diluição. Esse número apenas fica distribuído em uma quantidade maior de líquido.

Os laboratórios diluem células antes de várias etapas de rotina: dividir uma cultura em crescimento em novos frascos, semear um número fixo de células em cada poço de uma placa, congelar células para armazenamento ou preparar uma amostra para um contador de células ou citômetro de fluxo.

Fórmula da diluição celular

O cálculo se baseia em uma regra. O número de células retiradas da suspensão estoque, multiplicado pela concentração dela, deve ser igual ao número de células no volume final, multiplicado pela concentração desejada:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — concentração inicial (estoque), em células/mL
V₁ — volume da suspensão estoque a ser usado, em mL
C₂ — concentração desejada, em células/mL
V₂ — volume final total necessário, em mL

Isolando V₁, obtém-se o volume da suspensão estoque a ser pipetado:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

O restante do volume final é o diluente, geralmente meio de cultura celular, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou outro tampão:

Volume do diluente = V₂ − V₁

A concentração desejada (C₂) nunca pode ser maior que a concentração estoque (C₁). A diluição apenas reduz a concentração. Para aumentá-la, é necessário centrifugar as células e ressuspendê-las em uma quantidade menor de líquido.

Como calcular uma diluição celular

Conte a suspensão estoque com um hemocitômetro ou contador automático de células para obter C₁.
Anote a concentração desejada, C₂, exigida pelo protocolo.
Determine o volume final total, V₂, necessário.
Calcule V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Calcule o volume do diluente como V₂ − V₁.
Pipete V₁ da suspensão estoque em um tubo e, em seguida, adicione o volume de diluente na forma de meio ou tampão.

Exemplo prático

Uma suspensão estoque é contada a 1.000.000 células/mL. Um protocolo exige 100.000 células/mL em um volume final de 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volume do diluente = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Retirar 1 mL da suspensão estoque e adicionar 9 mL de meio produz 10 mL de suspensão a 100.000 células/mL.

Um segundo exemplo

Um ensaio em uma placa de 96 poços requer 10.000 células por poço em 200 microlitros (μL) de meio por poço. Isso corresponde a uma concentração desejada de 50.000 células/mL, pois 10.000 células divididas por 0,2 mL equivalem a 50.000 células/mL. A suspensão estoque é contada a 2.000.000 células/mL, e são necessários 20 mL no total para cobrir a placa, com uma quantidade extra para compensar perdas na pipetagem.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volume do diluente = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Misturar 0,5 mL da suspensão estoque com 19,5 mL de meio produz 20 mL a 50.000 células/mL, uma diluição de 1 em 40.

Fontes de erro

A fórmula em si é exata. Os erros vêm dos números inseridos nela.

Erro de contagem. Uma contagem celular incorreta resulta diretamente em uma diluição incorreta. Contar os quatro quadrados dos cantos da grade do hemocitômetro e calcular a média reduz esse risco.
Células agrupadas. Um agrupamento de células parece uma única célula ao microscópio, mas na verdade contém várias, reduzindo a concentração aparente.
Faixa de volume da pipeta. Uma pipeta usada fora da faixa de volume especificada produz resultados imprecisos. Uma pipeta de 1000 μL ajustada para dispensar 5 μL não é confiável; deve-se usar uma pipeta menor.
Confusão entre unidades. Misturar células/mL com células/μL produz um erro mil vezes maior ou menor que o correto.
Células mortas. Uma contagem celular bruta inclui células mortas, a menos que tenha sido usado um corante de viabilidade, como o azul de tripano. Isso pode superestimar o número de células vivas realmente presentes.

Limitações desta calculadora

A calculadora recusa números para os quais não consegue fornecer uma resposta útil:

Todo valor deve ser maior que zero.
A concentração desejada não pode ser maior que a concentração inicial.
A concentração inicial deve ser de 1 trilhão de células/mL (1 × 10¹²) ou menos.
O volume da suspensão estoque calculado deve ser de pelo menos 0,001 mL, que corresponde a 1 microlitro. Volumes menores não podem ser pipetados com precisão, portanto a calculadora solicita outros números. Aumentar o volume total geralmente resolve o problema.

Os volumes são mostrados com duas casas decimais, ou com três quando o volume da suspensão estoque é menor que 0,01 mL, para que um volume pequeno nunca apareça como 0,00 mL.

Dúvidas frequentes

Qual é a fórmula da diluição celular?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, em que C₁ e C₂ são as concentrações inicial e desejada, e V₁ e V₂ são o volume retirado da suspensão estoque e o volume final total.

A concentração desejada pode ser maior que a concentração inicial?

Não. A diluição apenas reduz a concentração. Para atingir uma concentração maior, é necessário centrifugar as células e ressuspendê-las em um volume menor.

Que líquido deve ser usado para diluir células?

Usa-se meio de cultura completo quando as células precisam permanecer saudáveis por horas ou dias, como antes de serem semeadas em uma placa. PBS ou uma solução salina tamponada semelhante funciona para diluições curtas, de menos de aproximadamente 30 minutos, antes do processamento posterior das células. Usa-se meio sem soro quando as proteínas do soro interfeririam em um ensaio subsequente.

Essa fórmula funciona para bactérias ou leveduras?

Sim. C₁V₁ = C₂V₂ aplica-se a qualquer suspensão de partículas, incluindo bactérias medidas em unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL), leveduras e partículas virais medidas em unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL), desde que as mesmas unidades sejam usadas nos dois lados da equação.

As células mortas devem ser contadas na diluição?

Para semear uma cultura viva, somente as células viáveis devem ser contadas. Se uma suspensão tiver 80% de viabilidade, sua concentração viável será 0,8 vezes a contagem celular total, e essa concentração viável deverá ser usada como C₁.

Como preparar diluições muito grandes com precisão?

Diluições grandes, como 1 em 1000, geralmente são feitas como uma série de etapas menores chamadas diluições seriadas. Três diluições sucessivas de 1 em 10 atingem uma diluição geral de 1 em 1000, mantendo cada etapa de pipetagem dentro de uma faixa de volume precisa.

Calculadora de Diluição Celular - Ferramenta Precisa de Diluição Laboratorial