Calculadora de Atividade Enzimática - Cinética de Michaelis-Menten

Calculadora de atividade enzimática

Uma calculadora de atividade enzimática determina a velocidade com que uma enzima converte o substrato em produto, expressa como atividade específica em unidades por miligrama (U/mg). Ela usa a equação de Michaelis-Menten, o modelo padrão da cinética enzimática, junto com a quantidade de proteína enzimática na amostra.

Enzimas são proteínas que aceleram reações químicas nas células sem serem consumidas. Os cientistas medem o grau de atividade de uma enzima para comparar diferentes lotes, verificar se uma etapa de purificação funcionou ou testar como um medicamento afeta a velocidade da enzima. O número referente apenas à concentração da enzima não indica se ela está desempenhando sua função. A atividade específica indica.

O que a calculadora calcula

A ferramenta recebe cinco entradas: concentração da enzima, concentração do substrato, a constante de Michaelis (Km), a velocidade máxima (Vmax) e o tempo de reação. O tempo de reação é registrado como referência, mas não entra na fórmula, porque Vmax já é uma taxa: uma quantidade de substrato convertida por minuto. O tempo já está embutido nela. Dividir pelo tempo outra vez contaria o tempo duas vezes.

A calculadora retorna:

• Atividade específica, em U/mg, exibida com quatro casas decimais: a velocidade de reação dividida pela quantidade de proteína enzimática presente
• Um gráfico da velocidade de reação em função da concentração do substrato, de zero até três vezes a concentração de substrato informada, com o valor informado marcado como um ponto

Como calcular a atividade enzimática

A equação de Michaelis-Menten

Leonor Michaelis e Maud Menten publicaram este modelo em 1913. Ele descreve como a velocidade de reação de uma enzima depende da concentração do substrato:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = velocidade da reação, a taxa em uma determinada concentração de substrato
• $V_{max}$ = velocidade máxima, a taxa quando a enzima está completamente saturada com substrato
• $[S]$ = concentração de substrato
• $K_m$ = a constante de Michaelis: a concentração de substrato na qual a velocidade é metade de Vmax

Fórmula da atividade específica

A atividade específica divide essa velocidade pela quantidade de proteína enzimática presente, resultando em unidades por miligrama (U/mg):

$\text{Atividade específica} = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

$[E]$ é a concentração da enzima em mg/mL. Uma unidade de enzima (U) é a quantidade de enzima que converte 1 micromol (µmol) de substrato por minuto. Essa unidade é muito usada em bioquímica e medicina desde 1964. Como Vmax é informada em µmol/min, ela já carrega esse "por minuto". Nenhum termo de tempo separado aparece na fórmula.

Este cálculo pressupõe que a velocidade medida seja uma taxa inicial, obtida no começo da reação, antes que o substrato se esgote ou que o produto passe a inibir a enzima. Os próprios Michaelis e Menten usaram medições de velocidade inicial para evitar o efeito dos produtos da reação.

Exemplos de cálculo

Exemplo 1. Concentração da enzima 1 mg/mL, concentração do substrato 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Velocidade = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/min Atividade específica = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg (a calculadora mostra 33,3333)

Estes são os valores padrão da calculadora.

Exemplo 2. Mesmas condições, mas com a concentração da enzima duplicada para 2 mg/mL.

Velocidade = 33,33 µmol/min (inalterada, pois a velocidade não depende de [E] nesta equação) Atividade específica = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Duplicar a quantidade de enzima reduz pela metade a atividade específica, pois a mesma velocidade total agora é dividida entre o dobro de proteína.

Exemplo 3. Substrato elevado a 100 mM, bem acima de Km, com concentração da enzima 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Velocidade = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/min Atividade específica = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Em concentrações elevadas de substrato, a enzima fica quase saturada, portanto a velocidade permanece próxima de Vmax.

Exemplo 4. Substrato reduzido a 1 mM, abaixo de Km, com concentração da enzima 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Velocidade = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/min Atividade específica = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Abaixo de Km, pequenas quantidades de substrato limitam a reação, portanto tanto a velocidade quanto a atividade específica ficam muito abaixo de Vmax.

Explicação dos principais parâmetros

A concentração de enzima [E] é a massa de proteína enzimática por volume, expressa em mg/mL. Um valor mais alto distribui a mesma velocidade de reação por uma quantidade maior de proteína, reduzindo a atividade específica. É a atividade específica, não a concentração bruta, que mostra se uma preparação enzimática está funcionando bem.

A concentração de substrato [S] é a quantidade de substrato disponível para a enzima, geralmente expressa em mM. Em valores baixos de [S], pequenos aumentos elevam bastante a velocidade. Perto da saturação, o substrato adicional quase não ajuda.

A constante de Michaelis (Km) é a concentração de substrato na qual a velocidade é igual à metade de Vmax. Um Km baixo significa que a enzima atinge metade da velocidade com uma baixa concentração de substrato, sinal de forte ligação entre enzima e substrato.

A velocidade máxima (Vmax) é a taxa quando o substrato deixa de ser limitante. Ela depende da quantidade de enzima presente e da rapidez com que cada molécula de enzima consegue converter o substrato (seu número de renovação, kcat).

O tempo de reação é a duração do ensaio. É útil para planejar um experimento, porque uma reação deixada por tempo demais pode esgotar o substrato e deixar de se comportar de forma linear. Ele não faz parte da própria fórmula da atividade específica.

Leitura da curva de velocidade

O gráfico mostra a velocidade em função da concentração do substrato usando a equação de Michaelis-Menten, de zero até três vezes a concentração de substrato informada.

• Abaixo de Km: a velocidade aumenta aproximadamente na mesma proporção que o substrato. Pequenos erros na concentração do substrato causam grandes erros no resultado.
• Perto de Km: a curva se dobra. A velocidade corresponde à metade de Vmax.
• Acima de Km: a curva se achata. O substrato adicional acrescenta pouca velocidade, pois a enzima está quase saturada.

Por que a atividade específica é importante

A atividade específica é uma medida padrão da pureza e da qualidade de uma enzima. Durante a purificação, os cientistas a acompanham a cada etapa. Um extrato bruto de células tem baixa atividade específica, que aumenta à medida que a enzima é purificada. Um aumento da atividade específica ao longo de um processo de purificação mostra que a proteína inativa está sendo removida enquanto a enzima de interesse é mantida.

A mesma medição auxilia na descoberta de medicamentos, em que os pesquisadores testam como compostos candidatos reduzem a atividade de uma enzima, e no diagnóstico clínico, em que os médicos medem enzimas como ALT e AST no sangue para verificar a presença de lesão hepática.

Perguntas frequentes

Como calcular a atividade enzimática a partir de Km e Vmax? Primeiro, encontre a velocidade de reação com a equação de Michaelis-Menten, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Depois, divida pela concentração da enzima para obter a atividade específica em U/mg: Atividade = v / [E].

O que é uma unidade (U) de atividade enzimática? Uma unidade é a quantidade de enzima que converte 1 µmol de substrato por minuto nas condições especificadas, conforme definido pela IUBMB.

Por que a fórmula não inclui o tempo de reação? Vmax já é expresso como uma quantidade por minuto; portanto, é uma taxa, não uma quantidade total. Dividir pelo tempo novamente faria essa contagem duas vezes e tornaria o resultado dependente da duração do ensaio, o que não deve ocorrer para uma propriedade da própria enzima.

Por que a atividade específica diminui quando a concentração de enzima aumenta? A velocidade na equação de Michaelis-Menten não depende da concentração de enzima. A atividade específica divide essa velocidade fixa por [E], portanto um valor maior de [E] produz um resultado menor. Comparar a atividade específica, e não a velocidade bruta, é a forma justa de comparar preparações enzimáticas com concentrações diferentes.

O que significa um Km baixo? Um Km baixo significa que a enzima atinge metade de sua velocidade máxima em uma concentração baixa de substrato, indicando que a enzima e o substrato se ligam firmemente.

A atividade específica pode ser negativa? Não. A calculadora retorna 0 quando a concentração da enzima é zero ou menor, ou quando a concentração do substrato, Km ou Vmax é negativa. Um valor negativo indicaria um erro de entrada, e não uma medição enzimática real.

Referências

1. Johnson, K. A., & Goody, R. S. (2011). The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry 50(39). Texto completo no PubMed Central — a publicação de 1913 e seu uso de medições de velocidade inicial.
2. IUBMB. Symbolism and Terminology in Enzyme Kinetics, sections 4–6. Reações enzimáticas envolvendo um único substrato — a constante de Michaelis é a concentração de substrato na qual v = 0,5 V.
3. BIPM. Resolution 12 of the 21st CGPM (1999). Nome especial para a unidade derivada do SI mol por segundo, o katal — a unidade enzimática U equivale a 1 µmol/min e é usada desde 1964.