qPCR kalkulator učinkovitosti: Analizirajte standardne krivulje i amplifikaciju
Izračunajte učinkovitost PCR-a iz Ct vrijednosti i faktora razrjeđenja. Analizirajte standardne krivulje, odredite učinkovitost amplifikacije i validirajte svoje kvantitativne PCR eksperimente.
Kalkulator učinkovitosti qPCR-a
Ulazni parametri
Ct vrijednosti
Vrijednost mora biti pozitivna
Vrijednost mora biti pozitivna
Vrijednost mora biti pozitivna
Vrijednost mora biti pozitivna
Vrijednost mora biti pozitivna
Rezultati
Standardna krivulja
Unesite valjane podatke za generiranje grafikona
Informacije
Učinkovitost qPCR-a je mjera koliko dobro PCR reakcija funkcionira. Učinkovitost od 100% znači da se količina PCR proizvoda udvostručuje s svakim ciklusom tijekom eksponencijalne faze.
Učinkovitost se izračunava iz nagiba standardne krivulje, koja se dobiva grafičkim prikazom Ct vrijednosti u odnosu na logaritamsku vrijednost početne koncentracije uzorka (serija razrjeđenja).
Učinkovitost (E) se izračunava pomoću formule:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentacija
qPCR Efikasnost Kalkulator: Optimizujte Vaše Kvalitativne PCR Eksperimente
Uvod u qPCR Efikasnost
Kvantitativna Polimerazna Lančana Reakcija (qPCR) efikasnost je kritični parametar koji direktno utiče na tačnost i pouzdanost vaših qPCR eksperimenata. qPCR efikasnost kalkulator pomaže istraživačima da odrede koliko efikasno njihovi PCR procesi amplifikuju ciljne DNA sekvence sa svakim termalnim ciklusom. Idealne qPCR reakcije bi trebale imati efikasnost između 90-110%, što ukazuje na to da se količina PCR proizvoda otprilike udvostručuje sa svakim ciklusom tokom eksponencijalne faze.
Loša amplifikacijska efikasnost može dovesti do netačne kvantifikacije, nepouzdanih rezultata i pogrešnih eksperimentalnih zaključaka. Izračunavanjem i praćenjem vaše qPCR efikasnosti, možete optimizovati uslove reakcije, validirati dizajne prajmera i osigurati kvalitet vaših kvantitativnih PCR podataka.
Ovaj kalkulator koristi metodu standardne krive, koja prikazuje vrednosti ciklusa (Ct) naspram logaritma koncentracije uzorka (predstavljene serijskim razblaženjima), kako bi odredila efikasnost vašeg qPCR testa. Rezultantna nagib ove standardne krive se zatim koristi za izračunavanje amplifikacijske efikasnosti koristeći jednostavnu matematičku formulu.
qPCR Efikasnost Formula i Izračunavanje
Efikasnost qPCR reakcije se izračunava iz nagiba standardne krive koristeći sledeću formulu:
Gde:
- E je efikasnost (izražena kao decimalni broj)
- Nagib je nagib standardne krive (prikazujući Ct vrednosti naspram log razblaženja)
Za idealnu PCR reakciju sa 100% efikasnošću (savršeno udvostručavanje amplicona sa svakim ciklusom), nagib bi bio -3.32. To je zato što:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (ili 100%)}
Procenat efikasnosti se izračunava množenjem decimalne efikasnosti sa 100:
\text{Efikasnost (%)} = E \times 100\%
Razumevanje Standardne Krive
Standardna kriva se kreira tako što se Ct vrednosti (y-os) prikazuju naspram logaritma početne koncentracije uzorka ili faktora razblaženja (x-os). Odnos između ovih varijabli bi trebao biti linearan, a kvalitet ovog linearnog odnosa se procenjuje korišćenjem koeficijenta determinacije (R²).
Za pouzdane izračune qPCR efikasnosti:
- R² vrednost bi trebala biti ≥ 0.98
- Nagib bi trebao tipično biti između -3.1 i -3.6
- Trebalo bi koristiti najmanje 3-5 tačaka razblaženja za kreiranje standardne krive
Korak-po-korak Proces Izračunavanja
-
Priprema podataka: Kalkulator uzima vaše Ct vrednosti za svaku tačku razblaženja i faktor razblaženja kao ulaze.
-
Log transformacija: Serija razblaženja se transformiše u logaritamsku skalu (log osnova 10).
-
Linearna regresija: Kalkulator vrši analizu linearne regresije na log-transformisanim podacima kako bi odredio nagib, y-presjek i R² vrednost.
-
Izračunavanje efikasnosti: Koristeći vrednost nagiba, efikasnost se izračunava koristeći formulu E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Tumačenje rezultata: Kalkulator prikazuje efikasnost kao procenat, zajedno sa nagibom i R² vrednošću kako bi vam pomogao da procenite pouzdanost vašeg qPCR testa.
Kako Koristiti qPCR Efikasnost Kalkulator
Pratite ove korake da izračunate vašu qPCR efikasnost:
-
Postavite broj razblaženja: Izaberite koliko tačaka razblaženja imate u vašoj standardnoj krivoj (preporučuje se između 3-7 tačaka).
-
Unesite faktor razblaženja: Unesite faktor razblaženja koji se koristio između uzoraka (npr. 10 za 10x razblaženje, 5 za 5x razblaženje).
-
Unesite Ct vrednosti: Unesite Ct vrednosti za svaku tačku razblaženja. Tipično, prvo razblaženje (Razblaženje 1) sadrži najvišu koncentraciju uzorka, što rezultira najnižom Ct vrednošću.
-
Pogledajte rezultate: Kalkulator će automatski izračunati i prikazati:
- PCR efikasnost (%)
- Nagib standardne krive
- Y-presjek
- R² vrednost (koeficijent determinacije)
- Vizuelnu reprezentaciju standardne krive
-
Tumačite rezultate: Procijenite da li vaša qPCR efikasnost spada u prihvatljiv opseg (90-110%) i da li R² vrednost ukazuje na pouzdanu standardnu krivu (≥ 0.98).
-
Kopirajte rezultate: Koristite dugme "Kopiraj rezultate" da kopirate sve izračunate vrednosti za vaše evidencije ili publikacije.
Primer Izračunavanja
Hajde da prođemo kroz primer:
- Faktor razblaženja: 10 (10x serijsko razblaženje)
- Broj razblaženja: 5
- Ct vrednosti:
- Razblaženje 1 (najviša koncentracija): 15.0
- Razblaženje 2: 18.5
- Razblaženje 3: 22.0
- Razblaženje 4: 25.5
- Razblaženje 5 (najniža koncentracija): 29.0
Kada se prikaže na standardnoj krivoj:
- X-os predstavlja log(dilucija): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-os predstavlja Ct vrednosti: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulator će izvršiti linearnu regresiju i odrediti:
- Nagib: -3.5
- Y-presjek: 15.0
- R²: 1.0 (savršena linearna povezanost u ovom primeru)
Koristeći formulu efikasnosti:
Ovo ukazuje na dobru qPCR efikasnost od 93%, što spada u prihvatljiv opseg od 90-110%.
Upotreba qPCR Efikasnost Kalkulacija
1. Validacija i Optimizacija Prajmera
Pre nego što koristite novi par prajmera za kvantitativne eksperimente, od suštinskog je značaja da validirate njegovu performansu. Izračunavanje qPCR efikasnosti pomaže:
- Proceni specifičnosti i performansi prajmera
- Optimizaciji koncentracija prajmera
- Određivanju optimalne temperature aneliranja
- Validaciji parova prajmera kroz različite koncentracije uzorka
2. Razvoj i Validacija Testova
Kada se razvijaju novi qPCR testovi, izračunavanje efikasnosti je ključno za:
- Osiguranje pouzdane kvantifikacije kroz dinamički opseg
- Validaciju donje granice detekcije
- Potvrđivanje reproduktivnosti testa
- Upoređivanje različitih detekcionih hemija (SYBR Green vs. TaqMan sonde)
3. Istraživanja Genetske Ekspresije
U eksperimentima relativne kvantifikacije, poznavanje PCR efikasnosti je od suštinskog značaja za:
- Primenu odgovarajućih kvantifikacionih modela (ΔΔCt vs. modeli ispravljeni za efikasnost)
- Normalizaciju ciljnih gena naspram referentnih gena sa različitim efikasnostima
- Osiguranje tačnih proračuna promena u količini
- Validaciju rezultata kroz različite eksperimentalne uslove
4. Dijagnostičke i Kliničke Aplikacije
U kliničkim i dijagnostičkim okruženjima, qPCR efikasnost je važna za:
- Validaciju dijagnostičkih testova pre kliničke primene
- Osiguranje dosledne performanse kroz različite tipove uzoraka
- Ispunjavanje regulatornih zahteva za validaciju testova
- Praćenje kontrole kvaliteta u rutinskom testiranju
5. Testiranje Okoline i Hrane
Za aplikacije u bezbednosti hrane i životne sredine, kalkulacije efikasnosti pomažu:
- Validaciji metoda detekcije patogena ili GMO-a
- Osiguranju dosledne performanse kroz složene matrice uzoraka
- Utvrđivanju granica detekcije u izazovnim uzorcima
- Usklađivanju sa standardima i regulativama testiranja
Alternativa Metodi Standardne Krive
Iako je metoda standardne krive najčešći pristup za izračunavanje qPCR efikasnosti, postoje alternativne metode:
1. Analiza Efikasnosti Jednog Amplicona
Ova metoda izračunava efikasnost iz fluorescencijskih podataka jedne amplifikacione krive, bez potrebe za serijom razblaženja. Softver poput LinRegPCR analizira eksponencijalnu fazu pojedinačnih reakcija kako bi odredio efikasnost.
Prednosti:
- Nema potrebe za serijom razblaženja
- Može izračunati efikasnost za svaku pojedinačnu reakciju
- Korisno kada je materijal uzorka ograničen
Nedostaci:
- Može biti manje tačno od metode standardne krive
- Zahteva specijalizovani softver za analizu
- Više je osetljivo na probleme sa pozadinskom fluorescencijom
2. Apsolutna Kvantifikacija sa Digitalnim PCR
Digitalni PCR (dPCR) pruža apsolutnu kvantifikaciju bez potrebe za standardnom krivom ili izračunavanjem efikasnosti.
Prednosti:
- Nema potrebe za izračunavanjem efikasnosti
- Veća preciznost za niskobudžetne ciljeve
- Manje pogođen inhibitorima
Nedostaci:
- Zahteva specijalizovanu opremu
- Viši trošak po uzorku
- Ograničen dinamički opseg u poređenju sa qPCR
3. Metode Uporedne Kvantifikacije
Neki softver za analizu qPCR nudi metode uporedne kvantifikacije koje procenjuju efikasnost bez potpune standardne krive.
Prednosti:
- Zahteva manje uzoraka od kompletne standardne krive
- Može se izvesti zajedno sa eksperimentalnim uzorcima
- Korisno za rutinsku analizu
Nedostaci:
- Može biti manje tačno od kompletne standardne krive
- Ograničena validacija linearnog dinamičkog opsega
- Možda ne detektuje probleme sa inhibicijom
Istorija qPCR i Efikasnost Kalkulacija
Razvoj qPCR i kalkulacija efikasnosti značajno je evoluirao tokom poslednjih nekoliko decenija:
Rano Razvoj (1980-e-1990-e)
Polimerazna Lančana Reakcija (PCR) je izumio Kary Mullis 1983. godine, revolucionirajući molekularnu biologiju. Međutim, tradicionalni PCR je bio samo kvalitativan ili polu-kvantitativan. Prvi sistem za real-time PCR razvijen je početkom 1990-ih od strane Russella Higuchija i njegovih kolega, koji su demonstrirali da praćenje PCR proizvoda dok se akumuliraju (korišćenjem fluorescencije etidijum bromida) može pružiti kvantitativne informacije.
Uspostavljanje qPCR Standarda (1990-e-2000-e)
Kako je qPCR tehnologija napredovala, istraživači su prepoznali važnost standardizacije i validacije. Koncept efikasnosti PCR-a postao je centralan za pouzdanu kvantifikaciju:
- Godine 1998, Pfaffl je uveo modele kvantifikacije ispravljene za efikasnost
- Metoda standardne krive za izračunavanje efikasnosti postala je široko prihvaćena
- Komercijalni qPCR sistemi sa poboljšanim detekcionim hemijama su se pojavili
Moderni Razvoj (2000-e-Danas)
Polje je nastavilo da se razvija sa:
- Objavljivanjem MIQE smernica (Minimalne Informacije za Objavljivanje Eksperimenata Kvalitativne Real-Time PCR) 2009. godine, naglašavajući važnost izveštavanja o PCR efikasnosti
- Razvojem naprednog softvera za analizu efikasnosti
- Integracijom kalkulacija efikasnosti u qPCR instrumente i softver
- Pojavom digitalnog PCR-a kao komplementarne tehnologije
Danas se izračunavanje i izveštavanje o qPCR efikasnosti smatraju suštinskim za objavljivanje pouzdanih qPCR podataka, a alati poput ovog kalkulatora pomažu istraživačima da se pridržavaju najboljih praksi u ovoj oblasti.
Primeri Koda za Izračunavanje qPCR Efikasnosti
Excel
1' Excel formula for calculating qPCR efficiency from slope
2' Place in cell B2 if slope is in cell A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formula to convert efficiency to percentage
6' Place in cell C2 if efficiency decimal is in cell B2
7=B2*100
8
9' Function to calculate efficiency from Ct values and dilution factor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Calculate linear regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Calculate slope
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Calculate efficiency
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R function to calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Create log dilution values
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Perform linear regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extract slope and R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Calculate efficiency
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Return results
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Example usage
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efficiency: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Slope: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-squared: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor.
8
9 Parameters:
10 ct_values (list): List of Ct values
11 dilution_factor (float): Dilution factor between consecutive samples
12
13 Returns:
14 dict: Dictionary containing efficiency, slope, r_squared, and intercept
15 """
16 # Create log dilution values
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Perform linear regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Calculate efficiency
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot the standard curve with regression line.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generate points for regression line
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Dilution')
48 plt.ylabel('Ct Value')
49 plt.title('qPCR Standard Curve')
50
51 # Add equation and R² to plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efficiency = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Example usage
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efficiency: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Slope: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-squared: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot the standard curve
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array of Ct values
4 * @param {number} dilutionFactor - Dilution factor between consecutive samples
5 * @returns {Object} Object containing efficiency, slope, rSquared, and intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Create log dilution values
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Calculate means for linear regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Calculate slope and intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Calculate R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Calculate efficiency
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Example usage
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efficiency: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Slope: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-squared: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Često Postavljana Pitanja (FAQ)
Šta je dobra qPCR efikasnost procenat?
Dobra qPCR efikasnost obično se kreće između 90% i 110% (0.9-1.1). Efikasnost od 100% predstavlja savršeno udvostručavanje PCR proizvoda sa svakim ciklusom. Efikasnosti van ovog opsega mogu ukazivati na probleme sa dizajnom prajmera, uslovima reakcije ili prisustvom inhibitora.
Zašto je moja qPCR efikasnost veća od 100%?
Efikasnosti veće od 100% mogu se javiti zbog:
- Grešaka u pipetiranju u seriji razblaženja
- Prisutnosti PCR inhibitora koji utiču na više koncentracije više nego na niže
- Ne-specifične amplifikacije ili prajmer-dimera koji doprinose signalu
- Problema sa korekcijom pozadine u analizi qPCR-a
Šta niska R² vrednost ukazuje u mojoj standardnoj krivoj?
Niska R² vrednost (ispod 0.98) sugeriše lošu linearost u vašoj standardnoj krivoj, što može biti uzrokovano:
- Greškama u pipetiranju tokom pripreme serije razblaženja
- Nekonzistentnom amplifikacijom kroz opseg koncentracija
- Dostizanjem granica detekcije na vrlo niskim ili visokim koncentracijama
- Inhibicijom PCR-a koja utiče na neke tačke razblaženja više od drugih
- Lošim performansama prajmera ili ne-specifičnom amplifikacijom
Koliko tačaka razblaženja trebam koristiti za izračunavanje qPCR efikasnosti?
Za pouzdane izračune efikasnosti, preporučuje se korišćenje najmanje 3 tačke razblaženja, ali 5-6 tačaka je preporučeno za tačnije rezultate. Ove tačke bi trebale pokrivati ceo dinamički opseg očekivanih koncentracija uzoraka u vašim eksperimentalnim uzorcima.
Kako efikasnost qPCR utiče na proračune relativne kvantifikacije?
U relativnoj kvantifikaciji koristeći ΔΔCt metodu, pretpostavlja se da su efikasnosti između ciljnih i referentnih gena jednake (idealno 100%). Kada se efikasnosti značajno razlikuju:
- Standardna ΔΔCt metoda može dovesti do značajnih grešaka u kvantifikaciji
- Treba koristiti modele kvantifikacije ispravljene za efikasnost (poput Pfaffl metode)
- Magnituda greške raste sa većim Ct razlikama između uzoraka
Mogu li koristiti istu vrednost efikasnosti za sve moje qPCR eksperimente?
Ne, efikasnost bi trebala biti određena za svaki par prajmera i trebala bi se ponovo validirati:
- Kada koristite nove serije prajmera
- Kada menjate uslove reakcije ili master miks
- Kada radite sa različitim tipovima uzoraka ili metodama ekstrakcije
- Periodično kao deo kontrole kvaliteta
Kako PCR inhibitori utiču na izračunavanja efikasnosti?
PCR inhibitori mogu:
- Smanjiti ukupnu efikasnost
- Teže uticati na više koncentracije uzoraka
- Stvoriti nelinarnost u standardnoj krivoj
- Dovesti do podcenjivanja abundancije cilja
- Uzrokovati nekonzistentnu amplifikaciju kroz replikate
Koja je razlika između qPCR efikasnosti i PCR efikasnosti?
Pojmovi se često koriste naizmenično, ali:
- qPCR efikasnost se specifično odnosi na efikasnost merenu u real-time kvantitativnoj PCR
- PCR efikasnost može se odnositi na opšti koncept u bilo kojoj PCR reakciji
- qPCR efikasnost se kvantitativno meri koristeći standardne krive ili druge metode
- Tradicionalna PCR efikasnost se često procenjuje kvalitativno putem gela elektroforeze
Kako mogu poboljšati svoju qPCR efikasnost?
Da poboljšate qPCR efikasnost:
- Optimizujte dizajn prajmera (dužina 18-22 bp, 50-60% GC sadržaj, Tm oko 60°C)
- Testirajte različite temperature aneliranja
- Optimizujte koncentracije prajmera
- Koristite visokokvalitetni DNA/RNA uzorak
- Razmotrite korišćenje PCR pojačivača za teške uzorke
- Osigurajte pravilnu pripremu uzorka kako biste uklonili potencijalne inhibitore
- Testirajte različite komercijalne master miksove
Mogu li uporediti uzorke sa različitim efikasnostima?
Upoređivanje uzoraka sa značajno različitim efikasnostima se ne preporučuje jer:
- Može dovesti do značajnih grešaka u kvantifikaciji
- Magnituda greške raste sa većim Ct razlikama
- Ako je neizbežno, treba koristiti modele kvantifikacije ispravljene za efikasnost
- Rezultati bi trebali biti tumačeni sa oprezom i dodatnom validacijom
Reference
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE smernice: minimalne informacije za objavljivanje eksperimenata kvantitativne real-time PCR. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Novi matematički model za relativnu kvantifikaciju u real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Koliko je dobra procena PCR efikasnosti: Preporuke za precizne i robusne procene efikasnosti qPCR-a. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Ultimativni qPCR Eksperiment: Proizvodnja Kvalitetnih, Reproduktivnih Podataka Prvi Put. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Efikasnost amplifikacije: povezivanje pozadine i pristranosti u analizi podataka kvantitativnog PCR-a. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetička PCR analiza: real-time praćenje reakcija amplifikacije DNA. Biotehnologija (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Vodič za Aplikacije Real-Time PCR. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Vodič za Real-Time PCR. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Naš qPCR Efikasnost Kalkulator pruža jednostavan, ali moćan alat za istraživače da validiraju i optimizuju svoje kvantitativne PCR eksperimente. Tačno izračunavajući efikasnost iz standardnih kriva, možete osigurati pouzdanu kvantifikaciju, rešavati problematične testove i pridržavati se najboljih praksi u qPCR eksperimentaciji.
Isprobajte naš kalkulator danas kako biste poboljšali kvalitet i pouzdanost vaših qPCR podataka!
Povratne informacije
Kliknite na povratnu informaciju da biste počeli davati povratne informacije o ovom alatu
Povezani alati
Otkrijte više alata koji bi mogli biti korisni za vaš radni proces