qPCR efektyvumo skaičiuoklė: analizuokite standartinius kreives ir amplifikaciją
Apskaičiuokite PCR efektyvumą iš Ct verčių ir atskiedimo faktorių. Analizuokite standartinius kreives, nustatykite amplifikacijos efektyvumą ir patvirtinkite savo kiekybinius PCR eksperimentus.
qPCR efektyvumo skaičiuoklė
Įvesties parametrai
Ct vertės
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Rezultatai
Standartinė kreivė
Įveskite galiojančius duomenis, kad sugeneruotumėte diagramą
Informacija
qPCR efektyvumas yra PCR reakcijos veikimo rodiklis. 100% efektyvumas reiškia, kad PCR produkto kiekis dvigubėja su kiekvienu ciklu eksponentinėje fazėje.
Efektyvumas apskaičiuojamas iš standartinės kreivės nuolydžio, kuris gautas pavaizduojant Ct vertes prieš pradinio šablono koncentracijos logaritmą (skiedimo serija).
Efektyvumas (E) apskaičiuojamas naudojant formulę:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentacija
qPCR Efektyvumo Skaičiuoklė: Optimizuokite savo kiekybinius PCR eksperimentus
Įvadas į qPCR efektyvumą
Kiekybinė polimerazės grandininė reakcija (qPCR) efektyvumas yra kritinis parametras, kuris tiesiogiai veikia jūsų qPCR eksperimentų tikslumą ir patikimumą. qPCR efektyvumo skaičiuoklė padeda tyrėjams nustatyti, kaip efektyviai jų PCR reakcijos amplifikuoja tikslias DNR sekas kiekviename terminiame cikle. Idealiuose qPCR reakcijose efektyvumas turėtų būti tarp 90-110%, nurodant, kad PCR produkto kiekis maždaug padvigubėja su kiekvienu ciklu eksponentinėje fazėje.
Prasta amplifikacijos efektyvumas gali sukelti netikslią kiekybę, nepatikimus rezultatus ir klaidingas eksperimentines išvadas. Apskaičiuodami ir stebėdami savo qPCR efektyvumą, galite optimizuoti reakcijos sąlygas, patvirtinti primerių dizainą ir užtikrinti savo kiekybinio PCR duomenų kokybę.
Ši skaičiuoklė naudoja standartinio kreivės metodą, kuris braižo ciklo slenkstį (Ct) vertes prieš logaritmą šablono koncentracijos (atstovaujamos serijinėmis skiedimo), kad nustatytų jūsų qPCR analizės efektyvumą. Gautas šios standartinės kreivės nuolydis vėliau naudojamas efektyvumui apskaičiuoti naudojant paprastą matematinę formulę.
qPCR efektyvumo formulė ir skaičiavimas
qPCR reakcijos efektyvumas apskaičiuojamas iš standartinės kreivės nuolydžio naudojant šią formulę:
Kur:
- E yra efektyvumas (išreikštas dešimtainiu)
- Nuolydis yra standartinės kreivės nuolydis (braižant Ct vertes prieš log skiedimą)
Idealiai PCR reakcijai su 100% efektyvumu (puikus amplikonų padvigubėjimas su kiekvienu ciklu) nuolydis būtų -3.32. Tai yra todėl, kad:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (arba 100%)}
Efektyvumo procentas apskaičiuojamas padauginus dešimtainį efektyvumą iš 100:
\text{Efektyvumas (%)} = E \times 100\%
Standartinės kreivės supratimas
Standartinė kreivė sukurta braižant Ct vertes (y ašis) prieš logaritmą pradinės šablono koncentracijos arba skiedimo faktoriaus (x ašis). Šių kintamųjų santykis turėtų būti linijinis, o šios linijinės santykio kokybė vertinama naudojant determinacijos koeficientą (R²).
Patikimiems qPCR efektyvumo skaičiavimams:
- R² vertė turėtų būti ≥ 0.98
- Nuolydis turėtų būti paprastai tarp -3.1 ir -3.6
- Turėtų būti naudojami bent 3-5 skiedimo taškai, kad būtų sukurta standartinė kreivė
Žingsnis po žingsnio skaičiavimo procesas
-
Duomenų paruošimas: Skaičiuoklė priima jūsų Ct vertes kiekvienam skiedimo taškui ir skiedimo faktoriui kaip įvestis.
-
Logaritminis transformavimas: Skiedimo serija transformuojama į logaritminę skalę (logaritmas dešimtine).
-
Linijinė regresija: Skaičiuoklė atlieka linijinės regresijos analizę logaritmų transformuotiems duomenims, kad nustatytų nuolydį, y-interceptą ir R² vertę.
-
Efektyvumo skaičiavimas: Naudojant nuolydžio vertę, efektyvumas apskaičiuojamas naudojant formulę E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Rezultatų interpretacija: Skaičiuoklė automatiškai rodo efektyvumą procentais, kartu su nuolydžiu ir R² verte, kad padėtų jums įvertinti savo qPCR analizės patikimumą.
Kaip naudoti qPCR efektyvumo skaičiuoklę
Sekite šiuos žingsnius, kad apskaičiuotumėte savo qPCR efektyvumą:
-
Nustatykite skiedimų skaičių: Pasirinkite, kiek skiedimo taškų turite savo standartinėje kreivėje (rekomenduojama nuo 3 iki 7 taškų).
-
Įveskite skiedimo faktorių: Įveskite skiedimo faktorių, naudojamą tarp nuoseklių mėginių (pvz., 10, jei tai 10 kartų skiedimo serija, 5, jei tai 5 kartų skiedimo serija).
-
Įveskite Ct vertes: Įveskite Ct vertes kiekvienam skiedimo taškui. Paprastai pirmasis skiedimas (Skiedimas 1) turi didžiausią šablono koncentraciją, todėl gaunama mažiausia Ct vertė.
-
Peržiūrėkite rezultatus: Skaičiuoklė automatiškai apskaičiuos ir parodys:
- PCR efektyvumą (%)
- Standartinės kreivės nuolydį
- Y-interceptą
- R² vertę (determinuotumo koeficientą)
- Vizualinį standartinės kreivės vaizdą
-
Interpretacija: Įvertinkite, ar jūsų qPCR efektyvumas patenka į priimtiną diapazoną (90-110%) ir ar R² vertė rodo patikimą standartinę kreivę (≥ 0.98).
-
Kopijuoti rezultatus: Naudokite mygtuką „Kopijuoti rezultatus“, kad nukopijuotumėte visus apskaičiuotus duomenis savo įrašams ar publikacijoms.
Pavyzdžio skaičiavimas
Pažvelkime į pavyzdį:
- Skiedimo faktorius: 10 (10 kartų serijinis skiedimas)
- Skiedimų skaičius: 5
- Ct vertės:
- Skiedimas 1 (didžiausia koncentracija): 15.0
- Skiedimas 2: 18.5
- Skiedimas 3: 22.0
- Skiedimas 4: 25.5
- Skiedimas 5 (mažiausia koncentracija): 29.0
Kai braižoma standartinėje kreivėje:
- X ašis atspindi log(skiedimą): 0, 1, 2, 3, 4
- Y ašis atspindi Ct vertes: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Skaičiuoklė atliks linijinę regresiją ir nustatys:
- Nuolydis: -3.5
- Y-interceptas: 15.0
- R²: 1.0 (puikus linijinis santykis šiame pavyzdyje)
Naudojant efektyvumo formulę:
Tai rodo gerą qPCR efektyvumą, esantį 93%, kuris patenka į priimtiną 90-110% diapazoną.
qPCR efektyvumo skaičiavimų naudojimo atvejai
1. Primerių validacija ir optimizavimas
Prieš naudojant naują primerių porą kiekybiniams eksperimentams, būtina patvirtinti jos veikimą. qPCR efektyvumo skaičiavimas padeda:
- Įvertinti primerių specifiškumą ir veikimą
- Optimizuoti primerių koncentracijas
- Nustatyti optimalų annealing temperatūrą
- Patvirtinti primerių poras skirtingose šablono koncentracijose
2. Analizės kūrimas ir validacija
Kuriant naujas qPCR analizės, efektyvumo skaičiavimai yra esminiai:
- Užtikrinant patikimą kiekybę per dinaminį diapazoną
- Patvirtinant aptikimo ribą
- Patvirtinant analizės reprodukciją
- Lyginant skirtingas aptikimo chemijas (SYBR Green prieš TaqMan zondus)
3. Genų ekspresijos tyrimai
Santykinio kiekybinių eksperimentų metu, žinant PCR efektyvumą, yra esminis:
- Taikant tinkamus kiekybinių modelių (ΔΔCt prieš efektyvumą koreguotus modelius)
- Normalizuojant tikslinius genus prieš referencinius genus su skirtingu efektyvumu
- Užtikrinant tikslius fold-change skaičiavimus
- Patvirtinant rezultatus skirtingomis eksperimentinėmis sąlygomis
4. Diagnostikos ir klinikinės taikymo sritys
Klinikinėse ir diagnostinėse aplinkose qPCR efektyvumas yra svarbus:
- Patvirtinant diagnostikos analizės prieš klinikinį įgyvendinimą
- Užtikrinant nuoseklų veikimą skirtingose mėginių rūšyse
- Atitinkant reguliavimo reikalavimus analizei
- Stebint kokybės kontrolę rutininėje testavime
5. Aplinkos ir maisto testavimas
Aplinkos ir maisto saugos taikymuose efektyvumo skaičiavimai padeda:
- Patvirtinti aptikimo metodus patogenams ar GMO
- Užtikrinti nuoseklų veikimą sudėtingose mėginių matricos
- Nustatyti aptikimo ribas sudėtinguose mėginiuose
- Atitikti testavimo standartus ir reglamentus
Alternatyvos standartinio kreivės metodui
Nors standartinio kreivės metodas yra dažniausiai naudojamas qPCR efektyvumo skaičiavimui, yra alternatyvūs metodai:
1. Vieno amplikono efektyvumo analizė
Šis metodas apskaičiuoja efektyvumą iš fluorescencijos duomenų vieno amplifikacijos kreivės, nereikalaujant skiedimo serijos. Programinė įranga, tokia kaip LinRegPCR, analizuoja individualių reakcijų eksponentinę fazę, kad nustatytų efektyvumą.
Privalumai:
- Nereikia skiedimo serijos
- Gali apskaičiuoti efektyvumą kiekvienai individualiai reakcijai
- Naudinga, kai mėginių medžiaga yra ribota
Trūkumai:
- Gali būti mažiau tikslus nei standartinio kreivės metodas
- Reikalauja specializuotos programinės įrangos analizei
- Labiau jautrus fono fluorescencijos problemoms
2. Absoliuti kiekybė su skaitmenine PCR
Skaitmeninė PCR (dPCR) suteikia absoliučią kiekybę, nereikalaujant standartinės kreivės ar efektyvumo skaičiavimų.
Privalumai:
- Nereikia efektyvumo skaičiavimų
- Didelis tikslumas mažai gausai taikiniams
- Mažiau paveikta inhibitorių
Trūkumai:
- Reikalauja specializuotos įrangos
- Didesnės sąnaudos vienam mėginiui
- Ribotas dinaminis diapazonas, palyginti su qPCR
3. Palyginamoji kiekybinių metodai
Kai kuri programinė įranga qPCR analizei siūlo palyginamojo kiekybinių metodus, kurie įvertina efektyvumą be pilnos standartinės kreivės.
Privalumai:
- Reikia mažiau mėginių nei visiškai standartinei kreivei
- Gali būti atliekama kartu su eksperimentiniais mėginiais
- Naudinga rutininėje analizėje
Trūkumai:
- Gali būti mažiau tikslūs nei visiškai standartinė kreivė
- Ribota linijinio dinaminio diapazono validacija
- Gali nesugebėti aptikti inhibicijos problemų
qPCR ir efektyvumo skaičiavimų istorija
qPCR ir efektyvumo skaičiavimų plėtra per pastaruosius kelis dešimtmečius žymiai pasikeitė:
Ankstyva plėtra (1980-1990)
Polimerazės grandininė reakcija (PCR) buvo išrasta Kary Mullis 1983 m., revoliucionavusi molekulinę biologiją. Tačiau tradicinė PCR buvo tik kokybinė arba pusiau kiekybinė. Pirmasis realaus laiko PCR sistema buvo sukurta 1990-aisiais Russell Higuchi ir jo kolegų, kurie parodė, kad stebint PCR produktus, kai jie kaupiasi (naudojant etidžio bromido fluorescenciją), galima gauti kiekybinę informaciją.
qPCR standartų nustatymas (1990-2000)
Kai qPCR technologija tobulėjo, tyrėjai pripažino standartizacijos ir validacijos svarbą. PCR efektyvumo koncepcija tapo centrine patikimos kiekybės užtikrinimo dalimi:
- 1998 m. Pfaffl pristatė efektyvumo koreguotus kiekybinius modelius
- Standartinio kreivės metodo efektyvumui apskaičiuoti plačiai priimtas
- Atsirado komercinės qPCR sistemos su patobulintomis aptikimo chemijomis
Šiuolaikiniai plėtojimai (2000-dabar)
Sritis ir toliau vystėsi su:
- MIQE gaires (Minimalios informacijos publikavimui apie kiekybinius realaus laiko PCR eksperimentus) 2009 m., pabrėžiančiomis PCR efektyvumo ataskaitos svarbą
- Išplėstinių analizės programinės įrangos plėtra efektyvumo skaičiavimams
- Efektyvumo skaičiavimų integravimas į qPCR instrumentus ir programinę įrangą
- Skaitmeninės PCR atsiradimas kaip papildoma technologija
Šiandien qPCR efektyvumo skaičiavimas ir ataskaitos laikomas esminiu, norint paskelbti patikimus qPCR duomenis, o tokios priemonės kaip ši skaičiuoklė padeda tyrėjams laikytis geriausių praktikos standartų šioje srityje.
Kodo pavyzdžiai qPCR efektyvumo skaičiavimui
Excel
1' Excel formulė qPCR efektyvumui apskaičiuoti iš nuolydžio
2' Įdėkite į langelį B2, jei nuolydis yra langelyje A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formulė efektyvumui procentais konvertuoti
6' Įdėkite į langelį C2, jei efektyvumo dešimtainis yra langelyje B2
7=B2*100
8
9' Funkcija efektyvumui apskaičiuoti iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Apskaičiuoti linijinę regresiją
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Apskaičiuoti nuolydį
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Apskaičiuoti efektyvumą
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R funkcija qPCR efektyvumui apskaičiuoti iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Sukurti log skiedimo vertes
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Atlikti linijinę regresiją
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Išgauti nuolydį ir R-kvadrato vertę
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Apskaičiuoti efektyvumą
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Grąžinti rezultatus
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Pavyzdžio naudojimas
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektyvumas: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Nuolydis: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadratas: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Apskaičiuoti qPCR efektyvumą iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus.
8
9 Parametrai:
10 ct_values (list): Ct vertių sąrašas
11 dilution_factor (float): Skiedimo faktorius tarp nuoseklių mėginių
12
13 Grąžina:
14 dict: Žodynas, kuriame yra efektyvumas, nuolydis, r_squared ir intercept
15 """
16 # Sukurti log skiedimo vertes
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Atlikti linijinę regresiją
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Apskaičiuoti efektyvumą
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Braižyti standartinę kreivę su regresijos linija.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generuoti taškus regresijos linijai
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Skiedimas')
48 plt.ylabel('Ct Vertė')
49 plt.title('qPCR Standartinė Kreivė')
50
51 # Pridėti lygtį ir R² į diagramą
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektyvumas = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Pavyzdžio naudojimas
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektyvumas: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Nuolydis: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadratas: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Braižyti standartinę kreivę
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Apskaičiuoti qPCR efektyvumą iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct vertių masyvas
4 * @param {number} dilutionFactor - Skiedimo faktorius tarp nuoseklių mėginių
5 * @returns {Object} Objektas, kuriame yra efektyvumas, nuolydis, rSquared ir intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Sukurti log skiedimo vertes
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Apskaičiuoti vidurkius linijinei regresijai
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Apskaičiuoti nuolydį ir interceptą
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Apskaičiuoti R-kvadrato vertę
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Apskaičiuoti efektyvumą
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Pavyzdžio naudojimas
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektyvumas: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Nuolydis: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadratas: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Dažnai užduodami klausimai (DUK)
Koks yra geras qPCR efektyvumo procentas?
Geras qPCR efektyvumas paprastai yra tarp 90% ir 110% (0.9-1.1). 100% efektyvumas reiškia puikų amplifikacijos padvigubėjimą su kiekvienu ciklu. Efektyvumas už šio diapazono gali rodyti problemas su primerių dizainu, reakcijos sąlygomis arba inhibitoriais.
Kodėl mano qPCR efektyvumas didesnis nei 100%?
Efektyvumas, didesnis nei 100%, gali pasireikšti dėl:
- Pipetavimo klaidų skiedimo serijoje
- PCR inhibitoriai, kurie labiau veikia didesnes koncentracijas nei mažesnes
- Nespecifinė amplifikacija arba primerių dimers, prisidedančių prie signalo
- Problemos su bazinės linijos korekcija qPCR analizėje
Ką rodo maža R² vertė mano standartinėje kreivėje?
Maža R² vertė (žemiau 0.98) rodo prastą linijiškumą jūsų standartinėje kreivėje, kuri gali būti sukelta:
- Pipetavimo klaidų ruošiant skiedimo seriją
- Inkoherentiška amplifikacija per koncentracijos diapazoną
- Pasiekus aptikimo ribas labai žemose arba aukštose koncentracijose
- PCR inhibicija, paveikusi kai kuriuos skiedimo taškus labiau nei kitus
- Prasto primerių veikimo arba nespecifinės amplifikacijos
Kiek skiedimo taškų turėčiau naudoti qPCR efektyvumo skaičiavimui?
Patikimiems efektyvumo skaičiavimams reikia bent 3 skiedimo taškų, tačiau rekomenduojama 5-6 taškai, kad būtų gauti tikslesni rezultatai. Šie taškai turėtų apimti visą dinaminį diapazoną, tikėtiną jūsų eksperimentiniuose mėginiuose.
Kaip qPCR efektyvumas veikia santykinių kiekybinių skaičiavimų?
Santykiniuose kiekybiniuose eksperimentuose naudojant ΔΔCt metodą, laikoma, kad tikslinių ir referencinių genų efektyvumas yra vienodas (idealiai 100%). Kai efektyvumas reikšmingai skiriasi:
- Standartinis ΔΔCt metodas gali sukelti didelius kiekybinius klaidų
- Reikia naudoti efektyvumo koreguotus kiekybinius modelius (pvz., Pfaffl metodą)
- Klaidos dydis didėja su didesniais Ct skirtumais tarp mėginių
Ar galiu naudoti tą patį efektyvumo vertę visiems savo qPCR eksperimentams?
Ne, efektyvumas turėtų būti nustatomas kiekvienai primerių porai ir turėtų būti pakartotinai patvirtinamas:
- Kai naudojate naujas primerių partijas
- Keičiant reakcijos sąlygas arba master mix
- Dirbant su skirtingomis mėginių rūšimis arba ekstrakcijos metodais
- Periodiškai kaip kokybės kontrolės dalis
Kaip PCR inhibitoriai veikia efektyvumo skaičiavimus?
PCR inhibitoriai gali:
- Sumažinti bendrą efektyvumą
- Labiau paveikti didesnes koncentracijas
- Sukelti nelinariškumą standartinėje kreivėje
- Sukelti tikslių kiekybinių vertinimų požiūriu
- Sukelti nesuderinamumą tarp replikatų
Koks skirtumas tarp qPCR efektyvumo ir PCR efektyvumo?
Šie terminai dažnai vartojami sinonimiškai, tačiau:
- qPCR efektyvumas konkrečiai nurodo efektyvumą, matuojamą realaus laiko kiekybinėje PCR
- PCR efektyvumas gali nurodyti bendrą koncepciją bet kurioje PCR reakcijoje
- qPCR efektyvumas yra kiekybiškai matuojamas naudojant standartines kreives arba kitus metodus
- Tradicinis PCR efektyvumas dažnai vertinamas kokybiškai naudojant gelinę elektroforezę
Kaip galiu pagerinti savo qPCR efektyvumą?
Norint pagerinti qPCR efektyvumą:
- Optimizuoti primerių dizainą (18-22 bp ilgis, 50-60% GC turinys, Tm apie 60°C)
- Išbandyti skirtingas annealing temperatūras
- Optimizuoti primerių koncentracijas
- Naudoti aukštos kokybės DNR/RNR šabloną
- Apsvarstyti PCR pagerintojų naudojimą sunkiai amplifikuojamiems šablonams
- Užtikrinti tinkamą mėginių paruošimą, kad pašalintumėte galimus inhibitorius
- Išbandyti skirtingus komercinius master mixes
Ar galiu palyginti mėginius su skirtingu efektyvumu?
Palyginti mėginius su reikšmingai skirtingu efektyvumu nerekomenduojama, nes:
- Tai gali sukelti dideles kiekybines klaidas
- Klaidos dydis didėja su didesniais Ct skirtumais
- Jei neišvengiama, reikia naudoti efektyvumo koreguotus kiekybinius modelius
- Rezultatai turėtų būti interpretuojami atsargiai ir papildomai patvirtinami
Nuorodos
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE gairės: minimalios informacijos publikavimui apie kiekybinius realaus laiko PCR eksperimentus. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Naujas matematinis modelis santykiniam kiekybiniam nustatymui realaus laiko RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kaip gerai yra PCR efektyvumo įvertinimas: rekomendacijos tiksliems ir patikimiems qPCR efektyvumo vertinimams. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Galutinis qPCR eksperimentas: publikacijos kokybiškų, reprodukuojamų duomenų gavimas pirmą kartą. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifikacijos efektyvumas: ryšys tarp bazinės linijos ir šališkumo kiekybinių PCR duomenų analizėje. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetinė PCR analizė: realaus laiko PCR amplifikacijos reakcijų stebėjimas. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Programų Gidas. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Vadovas. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Mūsų qPCR efektyvumo skaičiuoklė suteikia paprastą, tačiau galingą įrankį tyrėjams, kad patvirtintų ir optimizuotų savo kiekybinius PCR eksperimentus. Tiksliai apskaičiuodami efektyvumą iš standartinių kreivių, galite užtikrinti patikimą kiekybę, išspręsti problemas su problematiškomis analizėmis ir laikytis geriausių praktikos standartų qPCR eksperimentuose.
Išbandykite mūsų skaičiuoklę šiandien, kad pagerintumėte savo qPCR duomenų kokybę ir patikimumą!
Atsiliepimai
Spustelėkite atsiliepimo skanėlį, norėdami pradėti teikti atsiliepimus apie šį įrankį
Susiję įrankiai
Raskite daugiau įrankių, kurie gali būti naudingi jūsų darbo eiga.