qPCR efektivitātes kalkulators: analizējiet standarta līknes un amplifikāciju
Aprēķiniet PCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidīšanas faktoriem. Analizējiet standarta līknes, nosakiet amplifikācijas efektivitāti un validējiet savus kvantitatīvos PCR eksperimentus.
qPCR efektivitātes kalkulators
Ievades parametri
Ct vērtības
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Rezultāti
Standarta līkne
Ievadiet derīgus datus, lai ģenerētu diagrammu
Informācija
qPCR efektivitāte ir mērījums tam, cik labi PCR reakcija darbojas. Efektivitāte 100% nozīmē, ka PCR produkta daudzums dubultojas katrā ciklā eksponenciālajā fāzē.
Efektivitāte tiek aprēķināta no standarta līknes slīpuma, kas iegūta, zīmējot Ct vērtības pret sākotnējās šablona koncentrācijas logaritmu (atšķaidījumu sērija).
Efektivitāte (E) tiek aprēķināta, izmantojot formulu:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentācija
qPCR Efektivitātes Kalkulators: Optimizējiet savus kvantitatīvā PCR eksperimentus
Ievads qPCR Efektivitātē
Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (qPCR) efektivitāte ir kritisks parametrs, kas tieši ietekmē jūsu qPCR eksperimentu precizitāti un uzticamību. qPCR efektivitātes kalkulators palīdz pētniekiem noteikt, cik efektīvi viņu PCR reakcijas amplificē mērķa DNS secības katrā termiskajā ciklā. Ideālām qPCR reakcijām jābūt efektivitātei no 90-110%, kas norāda, ka PCR produkta daudzums aptuveni dubultojas katrā ciklā eksponenciālajā fāzē.
Slikta amplifikācijas efektivitāte var novest pie neprecīzas kvantifikācijas, neuzticamiem rezultātiem un kļūdainiem eksperimentāliem secinājumiem. Aprēķinot un uzraugot savu qPCR efektivitāti, jūs varat optimizēt reakcijas apstākļus, validēt primāru dizainus un nodrošināt kvantitatīvā PCR datu kvalitāti.
Šis kalkulators izmanto standarta līknes metodi, kas attēlo cikla sliekšņa (Ct) vērtības pret parauga koncentrācijas logaritmu (ko pārstāv sērijveida atšķaidījumi), lai noteiktu jūsu qPCR analīzes efektivitāti. Iegūtā slīpuma vērtība no šīs standarta līknes tiek izmantota, lai aprēķinātu amplifikācijas efektivitāti, izmantojot vienkāršu matemātisku formulu.
qPCR Efektivitātes Formula un Aprēķins
qPCR reakcijas efektivitāte tiek aprēķināta no standarta līknes slīpuma, izmantojot sekojošo formulu:
Kur:
- E ir efektivitāte (izteikta kā decimāldaļa)
- Slīpums ir standarta līknes slīpums (attēlojot Ct vērtības pret log atšķaidījumu)
Ideālai PCR reakcijai ar 100% efektivitāti (perfekta amplifikācija ampliconiem katrā ciklā) slīpumam jābūt -3.32. Tas ir tāpēc:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (vai 100%)}
Efektivitātes procentuālais rādītājs tiek aprēķināts, reizinot decimāla efektivitāti ar 100:
\text{Efektivitāte (%)} = E \times 100\%
Standarta Līknes Izpratne
Standarta līkne tiek izveidota, attēlojot Ct vērtības (y-ass) pret sākotnējās parauga koncentrācijas vai atšķaidījuma faktora logaritmu (x-ass). Attiecībai starp šiem mainīgajiem jābūt lineārai, un šīs lineārās attiecības kvalitāti novērtē, izmantojot noteikšanas koeficientu (R²).
Lai nodrošinātu uzticamu qPCR efektivitātes aprēķinu:
- R² vērtībai jābūt ≥ 0.98
- Slīpumam parasti jābūt starp -3.1 un -3.6
- Jāizmanto vismaz 3-5 atšķaidījuma punktu, lai izveidotu standarta līkni
Soli pa Solim Aprēķina Process
-
Datu sagatavošana: Kalkulators ņem jūsu Ct vērtības katram atšķaidījuma punktam un atšķaidījuma faktoru kā ievadi.
-
Logaritmiskā transformācija: Atšķaidījuma sērija tiek transformēta logaritmiskā skalā (logaritms ar bāzi 10).
-
Lineārā regresija: Kalkulators veic lineārās regresijas analīzi uz log-transformatīviem datiem, lai noteiktu slīpumu, y-intercept un R² vērtību.
-
Efektivitātes aprēķins: Izmantojot slīpuma vērtību, efektivitāte tiek aprēķināta, izmantojot formulu E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Rezultātu interpretācija: Kalkulators automātiski parāda efektivitāti procentos, kopā ar slīpumu un R² vērtību, lai palīdzētu jums novērtēt jūsu qPCR analīzes uzticamību.
Kā Lietot qPCR Efektivitātes Kalkulatoru
Izpildiet šos soļus, lai aprēķinātu savu qPCR efektivitāti:
-
Iestatiet atšķaidījumu skaitu: Izvēlieties, cik daudz atšķaidījuma punktu jums ir savā standarta līknes (ieteicams no 3-7 punktiem).
-
Ievadiet atšķaidījuma faktoru: Ievadiet atšķaidījuma faktoru, ko izmantojat starp secīgiem paraugiem (piemēram, 10 desmitkārtīgai atšķaidīšanai, 5 pieciniekam).
-
Ievadiet Ct vērtības: Ievadiet Ct vērtības katram atšķaidījuma punktam. Parasti pirmajā atšķaidījumā (Atšķaidījums 1) ir visaugstākais parauga koncentrācija, kas noved pie zemākās Ct vērtības.
-
Skatīt rezultātus: Kalkulators automātiski aprēķinās un parādīs:
- PCR efektivitāti (%)
- Standarta līknes slīpumu
- Y-intercept
- R² vērtību (noteikšanas koeficients)
- Vizualizāciju par standarta līkni
-
Interpretēt rezultātus: Novērtējiet, vai jūsu qPCR efektivitāte ir pieņemamajā diapazonā (90-110%) un vai R² vērtība norāda uz uzticamu standarta līkni (≥ 0.98).
-
Kopēt rezultātus: Izmantojiet pogu "Kopēt rezultātus", lai kopētu visus aprēķinātos vērtības saviem ierakstiem vai publikācijām.
Piemēra Aprēķins
Pastaigāsim cauri piemēram:
- Atšķaidījuma faktors: 10 (desmitkārtīga sērijveida atšķaidīšana)
- Atšķaidījumu skaits: 5
- Ct vērtības:
- Atšķaidījums 1 (augstākā koncentrācija): 15.0
- Atšķaidījums 2: 18.5
- Atšķaidījums 3: 22.0
- Atšķaidījums 4: 25.5
- Atšķaidījums 5 (zemākā koncentrācija): 29.0
Kad tas tiek attēlots uz standarta līknes:
- X-ass attēlo log(atšķaidījums): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-ass attēlo Ct vērtības: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulators veiks lineāro regresiju un noteiks:
- Slīpums: -3.5
- Y-intercept: 15.0
- R²: 1.0 (ideāla lineārā attiecība šajā piemērā)
Izmantojot efektivitātes formulu:
Tas norāda uz labu qPCR efektivitāti 93%, kas ietilpst pieņemamajā diapazonā no 90-110%.
qPCR Efektivitātes Aprēķinu Lietojumi
1. Primāru Validācija un Optimizācija
Pirms jauna primāru pāra izmantošanas kvantitatīvos eksperimentus ir būtiski validēt tā veiktspēju. qPCR efektivitātes aprēķins palīdz:
- Novērtēt primāru specifiku un veiktspēju
- Optimizēt primāru koncentrācijas
- Noteikt optimālo anelēšanas temperatūru
- Validēt primāru pārus dažādās parauga koncentrācijās
2. Analīzes Izstrāde un Validācija
Jaunu qPCR analīžu izstrādē efektivitātes aprēķini ir būtiski:
- Nodrošināt uzticamu kvantifikāciju visā dinamiskajā diapazonā
- Validēt noteikšanas apakšējo robežu
- Apstiprināt analīzes reproducibilitāti
- Salīdzināt dažādas noteikšanas ķīmijas (SYBR Green pret TaqMan zondiem)
3. Gēnu Ekspresijas Pētījumi
Relatīvās kvantifikācijas eksperimentu gadījumā, zinot PCR efektivitāti, ir būtiski:
- Izmantot atbilstošus kvantifikācijas modeļus (ΔΔCt pret efektivitāti koriģētiem modeļiem)
- Normalizēt mērķa gēnus pret atsauces gēniem ar atšķirīgām efektivitātēm
- Nodrošināt precīzus salīdzinošos aprēķinus
- Validēt rezultātus dažādās eksperimentālajās apstākļos
4. Diagnostikas un Klīniskās Lietojumprogrammas
Klīniskajās un diagnostikas vidēs qPCR efektivitāte ir svarīga:
- Validējot diagnostikas analīzes pirms klīniskās ieviešanas
- Nodrošinot konsekventu veiktspēju dažādos paraugu tipos
- Izpildot regulatīvās prasības analīzes validācijai
- Uzraugot kvalitātes kontroli ikdienas testēšanā
5. Vides un Pārtikas Testēšana
Vides un pārtikas drošības lietojumos efektivitātes aprēķini palīdz:
- Validējot noteikšanas metodes patogēniem vai GMO
- Nodrošinot konsekventu veiktspēju sarežģītās paraugu matricas
- Nosakot noteikšanas robežas izaicinošos paraugos
- Ievērojot testēšanas standartus un regulas
Alternatīvas Standarta Līknes Metodei
Lai gan standarta līknes metode ir visizplatītākā pieeja qPCR efektivitātes aprēķināšanai, ir pieejamas alternatīvas metodes:
1. Viena Amplicona Efektivitātes Analīze
Šī metode aprēķina efektivitāti no fluorescences datiem par vienu amplifikācijas līkni, neprasot atšķaidījumu sēriju. Programmatūra, piemēram, LinRegPCR, analizē individuālo reakciju eksponenciālo fāzi, lai noteiktu efektivitāti.
Priekšrocības:
- Nav nepieciešama atšķaidījumu sērija
- Var aprēķināt efektivitāti katrai individuālajai reakcijai
- Noderīga, ja parauga materiāls ir ierobežots
Trūkumi:
- Var būt mazāk precīza nekā standarta līknes metode
- Prasa specializētu programmatūru analīzei
- Jutīgāka pret fona fluorescences problēmām
2. Absolūtā Kvantifikācija ar Digitālo PCR
Digitālā PCR (dPCR) nodrošina absolūtu kvantifikāciju, neprasot standarta līkni vai efektivitātes aprēķinus.
Priekšrocības:
- Nav nepieciešami efektivitātes aprēķini
- Augstāka precizitāte zemas koncentrācijas mērķiem
- Mazāk ietekmēti no inhibitoriem
Trūkumi:
- Prasa specializētu aprīkojumu
- Augstāka cena par paraugu
- Ierobežots dinamiskais diapazons salīdzinājumā ar qPCR
3. Salīdzinošās Kvantifikācijas Metodes
Dažas qPCR analīzes programmatūras piedāvā salīdzinošas kvantifikācijas metodes, kas novērtē efektivitāti bez pilnīgas standarta līknes.
Priekšrocības:
- Prasa mazāk paraugu nekā pilna standarta līkne
- Var veikt kopā ar eksperimentālajiem paraugiem
- Noderīga rutīnas analīzei
Trūkumi:
- Var būt mazāk precīza nekā pilna standarta līkne
- Ierobežota lineārā dinamiskā diapazona validācija
- Var neatzīt inhibīcijas problēmas
qPCR un Efektivitātes Aprēķinu Vēsture
qPCR un efektivitātes aprēķinu attīstība ir ievērojami attīstījusies pēdējo divu desmitgažu laikā:
Agrīnā Attīstība (1980. gadi - 1990. gadi)
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika izgudrota Kary Mullis 1983. gadā, revolucionizējot molekulāro bioloģiju. Tomēr tradicionālā PCR bija tikai kvalitatīva vai puskvantitatīva. Pirmais reāllaika PCR sistēma tika izstrādāta 1990. gados, kad Russell Higuchi un kolēģi parādīja, ka PCR produktu uzkrāšanās uzraudzība (izmantojot etidija bromīda fluorescenci) var sniegt kvantitatīvu informāciju.
qPCR Standartu Izveide (1990. gadi - 2000. gadi)
Līdz ar qPCR tehnoloģijas attīstību pētnieki atzina standartizācijas un validācijas nozīmi. PCR efektivitātes koncepts kļuva centrāls uzticamas kvantifikācijas nodrošināšanai:
-
- gadā Pfaffl ieviesa efektivitāti koriģējošus kvantifikācijas modeļus
- Standarta līknes metode efektivitātes aprēķināšanai kļuva plaši pieņemta
- Komerciālie qPCR sistēmas ar uzlabotām noteikšanas ķīmijām parādījās
Mūsdienu Attīstība (2000. gadi - Pašreiz)
Joma ir turpinājusi attīstīties ar:
- MIQE vadlīniju (Minimālā informācija kvantitatīvo reāllaika PCR eksperimentu publicēšanai) publicēšanu 2009. gadā, uzsverot PCR efektivitātes ziņošanas nozīmi
- Uzlabotas analīzes programmatūras izstrādi efektivitātes aprēķiniem
- Efektivitātes aprēķinu integrāciju qPCR instrumentu un programmatūras vidē
- Digitālās PCR parādīšanos kā papildinošu tehnoloģiju
Mūsdienās qPCR efektivitātes aprēķināšana un ziņošana tiek uzskatīta par būtisku, publicējot uzticamus qPCR datus, un šādi kalkulatori palīdz pētniekiem ievērot labākās prakses jomā.
Koda Piemēri qPCR Efektivitātes Aprēķināšanai
Excel
1' Excel formula qPCR efektivitātes aprēķināšanai no slīpuma
2' Novietojiet šūnā B2, ja slīpums ir šūnā A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formula, lai pārvērstu efektivitāti procentos
6' Novietojiet šūnā C2, ja efektivitātes decimāldaļa ir šūnā B2
7=B2*100
8
9' Funkcija efektivitātes aprēķināšanai no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Veic lineāro regresiju
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Aprēķina slīpumu
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Aprēķina efektivitāti
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R funkcija qPCR efektivitātes aprēķināšanai no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Izveido log atšķaidījuma vērtības
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Veic lineāro regresiju
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Iegūst slīpumu un R-kvadrātu
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Aprēķina efektivitāti
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Atgriež rezultātus
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Piemēra izmantošana
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektivitāte: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Slīpums: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrāts: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Aprēķina qPCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora.
8
9 Parametri:
10 ct_values (list): Ct vērtību saraksts
11 dilution_factor (float): Atšķaidījuma faktors starp secīgiem paraugiem
12
13 Atgriež:
14 dict: Vārdu kopums, kas satur efektivitāti, slīpumu, r_kvadrātu un intercept
15 """
16 # Izveido log atšķaidījuma vērtības
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Veic lineāro regresiju
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Aprēķina efektivitāti
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Attēlo standarta līkni ar regresijas līniju.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Izveido punktus regresijas līnijai
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Atšķaidījums')
48 plt.ylabel('Ct Vērtība')
49 plt.title('qPCR Standarta Līkne')
50
51 # Pievieno vienādojumu un R² uz grafika
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektivitāte = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Piemēra izmantošana
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektivitāte: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Slīpums: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrāts: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Attēlot standarta līkni
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Aprēķina qPCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct vērtību masīvs
4 * @param {number} dilutionFactor - Atšķaidījuma faktors starp secīgiem paraugiem
5 * @returns {Object} Objekts, kas satur efektivitāti, slīpumu, rKvadrātu un intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Izveido log atšķaidījuma vērtības
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Aprēķina vidējos rādītājus lineārajai regresijai
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Aprēķina slīpumu un intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Aprēķina R-kvadrātu
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Aprēķina efektivitāti
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Piemēra izmantošana
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektivitāte: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Slīpums: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrāts: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Biežāk Uzdotie Jautājumi (BUJ)
Kas ir laba qPCR efektivitātes procentuālā vērtība?
Laba qPCR efektivitāte parasti ir no 90% līdz 110% (0.9-1.1). Efektivitāte 100% apzīmē perfektu amplifikāciju katrā ciklā. Efektivitātes vērtības ārpus šī diapazona var norādīt uz problēmām ar primāru dizainu, reakcijas apstākļiem vai inhibitoru klātbūtni.
Kāpēc mana qPCR efektivitāte ir lielāka par 100%?
Efektivitātes vērtības, kas ir lielākas par 100%, var rasties sakarā ar:
- Pipetēšanas kļūdām atšķaidījumu sērijā
- PCR inhibitoru klātbūtni, kas ietekmē augstākas koncentrācijas vairāk nekā zemākas
- Nespecifisku amplifikāciju vai primāru dimēru, kas veicina signālu
- Problēmām ar fona koriģēšanu qPCR analīzē
Ko norāda zema R² vērtība manā standarta līknē?
Zema R² vērtība (zem 0.98) norāda uz sliktu linearitāti jūsu standarta līknē, kas var būt izraisīta no:
- Pipetēšanas kļūdām, sagatavojot atšķaidījumu sēriju
- Nepareizas amplifikācijas visā koncentrācijas diapazonā
- Noteikšanas robežu sasniegšanas ļoti zemās vai augstās koncentrācijās
- PCR inhibīcijas, kas ietekmē dažus atšķaidījuma punktus vairāk nekā citus
- Sliktas primāru veiktspējas vai nespecifiskas amplifikācijas
Cik daudz atšķaidījuma punktu man vajadzētu izmantot qPCR efektivitātes aprēķināšanai?
Lai nodrošinātu uzticamus efektivitātes aprēķinus, ir nepieciešami vismaz 3 atšķaidījuma punkti, taču ieteicams izmantot 5-6 punktus precīzākiem rezultātiem. Šiem punktiem jāaptver viss gaidāmais parauga koncentrāciju diapazons jūsu eksperimentālajos paraugos.
Kā qPCR efektivitāte ietekmē relatīvās kvantifikācijas aprēķinus?
Relatīvās kvantifikācijas, izmantojot ΔΔCt metodi, tiek pieņemts, ka mērķa un atsauces gēnu efektivitātes ir vienādas (ideāli 100%). Ja efektivitātes būtiski atšķiras:
- Standarta ΔΔCt metode var radīt būtiskas kvantifikācijas kļūdas
- Jāizmanto efektivitāti koriģējoši kvantifikācijas modeļi (piemēram, Pfaffl metode)
- Kļūdu lielums palielinās ar lielākiem Ct atšķirībām starp paraugiem
Vai es varu izmantot to pašu efektivitātes vērtību visiem saviem qPCR eksperimenti?
Nē, efektivitāte jānosaka katram primāru pārim un jāvalidē atkārtoti:
- Izmantojot jaunus primāru partijas
- Mainot reakcijas apstākļus vai master mix
- Strādājot ar dažādiem paraugu veidiem vai ekstrakcijas metodēm
- Periodiski kā daļu no kvalitātes kontroles
Kā PCR inhibitori ietekmē efektivitātes aprēķinus?
PCR inhibitori var:
- Samazināt kopējo efektivitāti
- Ietekmēt augstāku koncentrāciju paraugus smagāk
- Radīt nelinearitāti standarta līknē
- Novest pie mērķa daudzuma nenovērtēšanas
- Izraisīt nesakritību amplifikācijā starp replikātiem
Kāda ir atšķirība starp qPCR efektivitāti un PCR efektivitāti?
Termini bieži tiek lietoti savstarpēji aizvietojami, taču:
- qPCR efektivitāte īpaši attiecas uz efektivitāti, kas mērīta reāllaika kvantitatīvajā PCR
- PCR efektivitāte var attiekties uz vispārējo jēdzienu jebkurā PCR reakcijā
- qPCR efektivitāte tiek kvantitatīvi mērīta, izmantojot standarta līknes vai citas metodes
- Tradicionālā PCR efektivitāte bieži tiek novērtēta kvalitatīvi, izmantojot gela elektroforēzi
Kā es varu uzlabot savu qPCR efektivitāti?
Lai uzlabotu qPCR efektivitāti:
- Optimizējiet primāru dizainu (18-22 bp garums, 50-60% GC saturs, Tm ap 60°C)
- Pārbaudiet dažādas anelēšanas temperatūras
- Optimizējiet primāru koncentrācijas
- Izmantojiet augstas kvalitātes DNS/RNA paraugu
- Apsveriet PCR uzlabotāju izmantošanu grūtiem paraugiem
- Nodrošiniet pareizu paraugu sagatavošanu, lai noņemtu potenciālos inhibitorus
- Pārbaudiet dažādus komerciālos master mix
Vai es varu salīdzināt paraugus ar atšķirīgām efektivitātēm?
Salīdzināt paraugus ar būtiski atšķirīgām efektivitātēm nav ieteicams, jo:
- Tas var radīt ievērojamas kvantifikācijas kļūdas
- Kļūdu lielums palielinās ar lielākām Ct atšķirībām
- Ja tas ir neizbēgami, jāizmanto efektivitāti koriģējoši kvantifikācijas modeļi
- Rezultātiem jābūt interpretētiem ar piesardzību un papildu validāciju
Atsauces
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE vadlīnijas: minimālā informācija kvantitatīvo reāllaika PCR eksperimentu publicēšanai. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Jauns matemātiskais modelis relatīvai kvantifikācijai reāllaika RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Cik laba ir PCR efektivitātes novērtējums: Ieteikumi precīzai un uzticamai qPCR efektivitātes novērtēšanai. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Ultimātā qPCR eksperimenta: Publicējamu kvalitatīvu, reproducējamu datu iegūšana pirmo reizi. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifikācijas efektivitāte: saistot bāzes līmeni un novirzi kvantitatīvo PCR datu analīzē. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetiskā PCR analīze: reāllaika PCR amplifikācijas reakciju uzraudzība. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Reāllaika PCR Lietojumu Ceļvedis. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Reāllaika PCR Rokasgrāmata. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Mūsu qPCR Efektivitātes Kalkulators nodrošina vienkāršu, bet jaudīgu rīku pētniekiem, lai validētu un optimizētu savus kvantitatīvā PCR eksperimentus. Precīzi aprēķinot efektivitāti no standarta līknēm, jūs varat nodrošināt uzticamu kvantifikāciju, novērst problēmas analīzēs un ievērot labākās prakses kvantitatīvā PCR eksperimentēšanā.
Izmēģiniet mūsu kalkulatoru šodien, lai uzlabotu savu qPCR datu kvalitāti un uzticamību!
Atsauksmes
Noklikšķiniet uz atsauksmju tosta, lai sāktu sniegt atsauksmes par šo rīku
Saistītie Rīki
Atklājiet vairāk rīku, kas varētu būt noderīgi jūsu darbplūsmai