Pengira Kecanggihan qPCR: Menganalisis Lengkung Standard & Penguatan
Kira kecanggihan PCR daripada nilai Ct dan faktor pencairan. Menganalisis lengkung standard, menentukan kecanggihan penguatan, dan mengesahkan eksperimen PCR kuantitatif anda.
Pengira Kecekapan qPCR
Parameter Input
Nilai Ct
Nilai mesti positif
Nilai mesti positif
Nilai mesti positif
Nilai mesti positif
Nilai mesti positif
Keputusan
Kurva Piawai
Masukkan data yang sah untuk menghasilkan carta
Maklumat
Kecekapan qPCR adalah ukuran sejauh mana reaksi PCR berfungsi. Kecekapan 100% bermaksud bahawa jumlah produk PCR berganda dengan setiap kitaran semasa fasa eksponensial.
Kecekapan dikira dari cerun kurva piawai, yang diperoleh dengan memplot nilai Ct terhadap logaritma kepekatan templat awal (siri pencairan).
Kecekapan (E) dikira menggunakan formula:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentasi
Pengira Efisiensi qPCR: Mengoptimalkan Eksperimen PCR Kuantitatif Anda
Pengenalan Efisiensi qPCR
Efisiensi Polymerase Chain Reaction (PCR) kuantitatif (qPCR) adalah parameter penting yang secara langsung mempengaruhi akurasi dan keandalan eksperimen qPCR Anda. Kalkulator efisiensi qPCR membantu peneliti menentukan seberapa efisien reaksi PCR mereka mengamplifikasi urutan DNA target dengan setiap siklus termal. Reaksi qPCR yang ideal seharusnya memiliki efisiensi antara 90-110%, menunjukkan bahwa jumlah produk PCR kira-kira berlipat ganda dengan setiap siklus selama fase eksponensial.
Efisiensi amplifikasi yang buruk dapat menyebabkan kuantifikasi yang tidak akurat, hasil yang tidak dapat diandalkan, dan kesimpulan eksperimen yang cacat. Dengan menghitung dan memantau efisiensi qPCR Anda, Anda dapat mengoptimalkan kondisi reaksi, memvalidasi desain primer, dan memastikan kualitas data PCR kuantitatif Anda.
Kalkulator ini menggunakan metode kurva standar, yang memplot nilai ambang siklus (Ct) terhadap logaritma konsentrasi template (dilusi serial), untuk menentukan efisiensi assay qPCR Anda. Kemudian, kemiringan kurva standar ini digunakan untuk menghitung efisiensi amplifikasi menggunakan rumus matematis yang sederhana.
Rumus dan Perhitungan Efisiensi qPCR
Efisiensi reaksi qPCR dihitung dari kemiringan kurva standar menggunakan rumus berikut:
Di mana:
- E adalah efisiensi (diekspresikan sebagai desimal)
- Kemiringan adalah kemiringan kurva standar (memplot nilai Ct terhadap log dilusi)
Untuk reaksi PCR ideal dengan efisiensi 100% (penggandaan sempurna amplicon dengan setiap siklus), kemiringan akan menjadi -3.32. Ini karena:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (atau 100%)}
Persentase efisiensi dihitung dengan mengalikan efisiensi desimal dengan 100:
\text{Efisiensi (%)} = E \times 100\%
Memahami Kurva Standar
Kurva standar dibuat dengan memplot nilai Ct (sumbu y) terhadap logaritma konsentrasi awal template atau faktor dilusi (sumbu x). Hubungan antara variabel-variabel ini harus linier, dan kualitas hubungan linier ini dinilai menggunakan koefisien determinasi (R²).
Untuk perhitungan efisiensi qPCR yang dapat diandalkan:
- Nilai R² harus ≥ 0.98
- Kemiringan biasanya harus antara -3.1 dan -3.6
- Setidaknya 3-5 titik dilusi harus digunakan untuk membuat kurva standar
Proses Perhitungan Langkah-demi-Langkah
-
Persiapan data: Kalkulator mengambil nilai Ct Anda untuk setiap titik dilusi dan faktor dilusi sebagai input.
-
Transformasi log: Seri dilusi ditransformasikan ke dalam skala logaritmik (log basis 10).
-
Regresi linier: Kalkulator melakukan analisis regresi linier pada data yang ditransformasikan log untuk menentukan kemiringan, intersep y, dan nilai R².
-
Perhitungan efisiensi: Menggunakan nilai kemiringan, efisiensi dihitung menggunakan rumus E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Interpretasi hasil: Kalkulator akan menampilkan efisiensi sebagai persentase, bersama dengan kemiringan dan nilai R² untuk membantu Anda menilai keandalan assay qPCR Anda.
Cara Menggunakan Kalkulator Efisiensi qPCR
Ikuti langkah-langkah ini untuk menghitung efisiensi qPCR Anda:
-
Tentukan jumlah dilusi: Pilih berapa banyak titik dilusi yang Anda miliki dalam kurva standar (antara 3-7 titik yang disarankan).
-
Masukkan faktor dilusi: Input faktor dilusi yang digunakan antara sampel berturut-turut (misalnya, 10 untuk seri dilusi 10 kali lipat, 5 untuk seri dilusi 5 kali lipat).
-
Masukkan nilai Ct: Masukkan nilai Ct untuk setiap titik dilusi. Biasanya, dilusi pertama (Dilusi 1) mengandung konsentrasi template tertinggi, menghasilkan nilai Ct terendah.
-
Lihat hasil: Kalkulator akan secara otomatis menghitung dan menampilkan:
- Efisiensi PCR (%)
- Kemiringan kurva standar
- Intersep y
- Nilai R² (koefisien determinasi)
- Representasi visual dari kurva standar
-
Interpretasi hasil: Nilai efisiensi qPCR Anda harus jatuh dalam rentang yang dapat diterima (90-110%) dan apakah nilai R² menunjukkan kurva standar yang dapat diandalkan (≥ 0.98).
-
Salin hasil: Gunakan tombol "Salin Hasil" untuk menyalin semua nilai yang dihitung untuk catatan atau publikasi Anda.
Contoh Perhitungan
Mari kita lihat contoh:
- Faktor dilusi: 10 (dilusi serial 10 kali lipat)
- Jumlah dilusi: 5
- Nilai Ct:
- Dilusi 1 (konsentrasi tertinggi): 15.0
- Dilusi 2: 18.5
- Dilusi 3: 22.0
- Dilusi 4: 25.5
- Dilusi 5 (konsentrasi terendah): 29.0
Ketika dipetakan pada kurva standar:
- Sumbu x mewakili log(dilusi): 0, 1, 2, 3, 4
- Sumbu y mewakili nilai Ct: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulator akan melakukan regresi linier dan menentukan:
- Kemiringan: -3.5
- Intersep y: 15.0
- R²: 1.0 (hubungan linier sempurna dalam contoh ini)
Menggunakan rumus efisiensi:
Ini menunjukkan efisiensi qPCR yang baik sebesar 93%, yang jatuh dalam rentang yang dapat diterima antara 90-110%.
Kasus Penggunaan untuk Perhitungan Efisiensi qPCR
1. Validasi dan Optimasi Primer
Sebelum menggunakan pasangan primer baru untuk eksperimen kuantitatif, penting untuk memvalidasi kinerjanya. Menghitung efisiensi qPCR membantu:
- Menilai spesifisitas dan kinerja primer
- Mengoptimalkan konsentrasi primer
- Menentukan suhu annealing yang optimal
- Memvalidasi pasangan primer di berbagai konsentrasi template
2. Pengembangan dan Validasi Assay
Saat mengembangkan assay qPCR baru, perhitungan efisiensi sangat penting untuk:
- Memastikan kuantifikasi yang dapat diandalkan di seluruh rentang dinamis
- Memvalidasi batas deteksi yang lebih rendah
- Mengonfirmasi reproduktifitas assay
- Membandingkan berbagai kimia deteksi (SYBR Green vs. probe TaqMan)
3. Studi Ekspresi Gen
Dalam eksperimen kuantifikasi relatif, mengetahui efisiensi PCR sangat penting untuk:
- Menerapkan model kuantifikasi yang sesuai (ΔΔCt vs. model yang dikoreksi efisiensi)
- Menormalkan gen target terhadap gen referensi dengan efisiensi yang berbeda
- Memastikan perhitungan perubahan lipatan yang akurat
- Memvalidasi hasil di berbagai kondisi eksperimen
4. Aplikasi Diagnostik dan Klinis
Dalam pengaturan klinis dan diagnostik, efisiensi qPCR penting untuk:
- Memvalidasi assay diagnostik sebelum implementasi klinis
- Memastikan kinerja yang konsisten di seluruh jenis sampel yang berbeda
- Memenuhi persyaratan regulasi untuk validasi assay
- Memantau kontrol kualitas dalam pengujian rutin
5. Pengujian Lingkungan dan Makanan
Untuk aplikasi keselamatan lingkungan dan makanan, perhitungan efisiensi membantu:
- Memvalidasi metode deteksi untuk patogen atau GMO
- Memastikan kinerja yang konsisten di seluruh matriks sampel yang kompleks
- Menentukan batas deteksi dalam sampel yang menantang
- Mematuhi standar dan regulasi pengujian
Alternatif untuk Metode Kurva Standar
Meskipun metode kurva standar adalah pendekatan yang paling umum untuk menghitung efisiensi qPCR, ada metode alternatif:
1. Analisis Efisiensi Amplicon Tunggal
Metode ini menghitung efisiensi dari data fluoresensi satu kurva amplifikasi, tanpa memerlukan seri dilusi. Perangkat lunak seperti LinRegPCR menganalisis fase eksponensial dari reaksi individu untuk menentukan efisiensi.
Keuntungan:
- Tidak perlu seri dilusi
- Dapat menghitung efisiensi untuk setiap reaksi individu
- Berguna ketika bahan sampel terbatas
Kerugian:
- Mungkin kurang akurat daripada metode kurva standar
- Memerlukan perangkat lunak khusus untuk analisis
- Lebih sensitif terhadap masalah fluoresensi latar belakang
2. Kuantifikasi Absolut dengan PCR Digital
PCR digital (dPCR) memberikan kuantifikasi absolut tanpa memerlukan kurva standar atau perhitungan efisiensi.
Keuntungan:
- Tidak perlu perhitungan efisiensi
- Presisi lebih tinggi untuk target dengan kelimpahan rendah
- Kurang terpengaruh oleh inhibitor
Kerugian:
- Memerlukan peralatan khusus
- Biaya lebih tinggi per sampel
- Rentang dinamis terbatas dibandingkan dengan qPCR
3. Metode Kuantifikasi Komparatif
Beberapa perangkat lunak analisis qPCR menawarkan metode kuantifikasi komparatif yang memperkirakan efisiensi tanpa kurva standar lengkap.
Keuntungan:
- Memerlukan lebih sedikit sampel daripada kurva standar lengkap
- Dapat dilakukan bersamaan dengan sampel eksperimental
- Berguna untuk analisis rutin
Kerugian:
- Mungkin kurang akurat daripada kurva standar lengkap
- Validasi rentang dinamis linier terbatas
- Mungkin tidak mendeteksi masalah inhibisi
Sejarah qPCR dan Perhitungan Efisiensi
Perkembangan qPCR dan perhitungan efisiensi telah berkembang secara signifikan selama beberapa dekade terakhir:
Pengembangan Awal (1980-an-1990-an)
Reaksi Chain Polymerase (PCR) ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, merevolusi biologi molekuler. Namun, PCR tradisional hanya bersifat kualitatif atau semi-kuantitatif. Sistem PCR waktu nyata pertama dikembangkan pada awal 1990-an oleh Russell Higuchi dan rekan-rekannya, yang menunjukkan bahwa memantau produk PCR saat mereka terakumulasi (menggunakan fluoresensi etidium bromida) dapat memberikan informasi kuantitatif.
Penetapan Standar qPCR (1990-an-2000-an)
Seiring dengan kemajuan teknologi qPCR, para peneliti menyadari pentingnya standardisasi dan validasi. Konsep efisiensi PCR menjadi pusat untuk kuantifikasi yang dapat diandalkan:
- Pada tahun 1998, Pfaffl memperkenalkan model kuantifikasi yang dikoreksi efisiensi
- Metode kurva standar untuk menghitung efisiensi menjadi luas diterima
- Sistem qPCR komersial dengan kimia deteksi yang ditingkatkan muncul
Perkembangan Modern (2000-an-Sekarang)
Bidang ini terus berkembang dengan:
- Publikasi pedoman MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) pada tahun 2009, yang menekankan pentingnya melaporkan efisiensi PCR
- Pengembangan perangkat lunak analisis canggih untuk perhitungan efisiensi
- Integrasi perhitungan efisiensi ke dalam instrumen dan perangkat lunak qPCR
- Munculnya PCR digital sebagai teknologi pelengkap
Saat ini, menghitung dan melaporkan efisiensi qPCR dianggap penting untuk menerbitkan data qPCR yang dapat diandalkan, dan alat seperti kalkulator ini membantu peneliti mematuhi praktik terbaik di bidang ini.
Contoh Kode untuk Menghitung Efisiensi qPCR
Excel
1' Rumus Excel untuk menghitung efisiensi qPCR dari kemiringan
2' Tempatkan di sel B2 jika kemiringan ada di sel A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Rumus Excel untuk mengubah efisiensi menjadi persentase
6' Tempatkan di sel C2 jika efisiensi desimal ada di sel B2
7=B2*100
8
9' Fungsi untuk menghitung efisiensi dari nilai Ct dan faktor dilusi
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Hitung regresi linier
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Hitung kemiringan
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Hitung efisiensi
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# Fungsi R untuk menghitung efisiensi qPCR dari nilai Ct dan faktor dilusi
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Buat nilai log dilusi
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Lakukan regresi linier
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Ambil kemiringan dan R-kuadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Hitung efisiensi
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Kembalikan hasil
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Contoh penggunaan
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efisiensi: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Kemiringan: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kuadrat: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Hitung efisiensi qPCR dari nilai Ct dan faktor dilusi.
8
9 Parameter:
10 ct_values (list): Daftar nilai Ct
11 dilution_factor (float): Faktor dilusi antara sampel berturut-turut
12
13 Mengembalikan:
14 dict: Kamus yang berisi efisiensi, kemiringan, r_squared, dan intersep
15 """
16 # Buat nilai log dilusi
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Lakukan regresi linier
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Hitung efisiensi
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot kurva standar dengan garis regresi.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Hasilkan titik untuk garis regresi
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Dilusi')
48 plt.ylabel('Nilai Ct')
49 plt.title('Kurva Standar qPCR')
50
51 # Tambahkan persamaan dan R² ke plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efisiensi = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Contoh penggunaan
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efisiensi: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Kemiringan: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kuadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intersep: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot kurva standar
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Hitung efisiensi qPCR dari nilai Ct dan faktor dilusi
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array nilai Ct
4 * @param {number} dilutionFactor - Faktor dilusi antara sampel berturut-turut
5 * @returns {Object} Objek yang berisi efisiensi, kemiringan, rSquared, dan intersep
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Buat nilai log dilusi
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Hitung rata-rata untuk regresi linier
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Hitung kemiringan dan intersep
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Hitung R-kuadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Hitung efisiensi
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Contoh penggunaan
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efisiensi: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Kemiringan: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kuadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intersep: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)
Apa persentase efisiensi qPCR yang baik?
Efisiensi qPCR yang baik biasanya berada di antara 90% dan 110% (0.9-1.1). Efisiensi 100% menunjukkan penggandaan sempurna produk PCR dengan setiap siklus. Efisiensi di luar rentang ini dapat menunjukkan masalah dengan desain primer, kondisi reaksi, atau adanya inhibitor.
Mengapa efisiensi qPCR saya lebih dari 100%?
Efisiensi yang lebih dari 100% dapat terjadi karena:
- Kesalahan pipetting dalam seri dilusi
- Adanya inhibitor PCR yang mempengaruhi konsentrasi yang lebih tinggi lebih dari yang lebih rendah
- Amplifikasi non-spesifik atau primer-dimer yang berkontribusi pada sinyal
- Masalah dengan koreksi latar belakang dalam analisis qPCR
Apa arti nilai R² yang rendah dalam kurva standar saya?
Nilai R² yang rendah (di bawah 0.98) menunjukkan ketidaklinieran yang buruk dalam kurva standar Anda, yang mungkin disebabkan oleh:
- Kesalahan pipetting selama persiapan seri dilusi
- Amplifikasi yang tidak konsisten di seluruh rentang konsentrasi
- Mencapai batas deteksi pada konsentrasi yang sangat rendah atau tinggi
- Inhibisi PCR yang mempengaruhi beberapa titik dilusi lebih dari yang lain
- Kinerja primer yang buruk atau amplifikasi non-spesifik
Berapa banyak titik dilusi yang harus saya gunakan untuk menghitung efisiensi qPCR?
Untuk perhitungan efisiensi yang dapat diandalkan, minimum 3 titik dilusi diperlukan, tetapi 5-6 titik disarankan untuk hasil yang lebih akurat. Titik-titik ini harus mencakup seluruh rentang dinamis konsentrasi template yang diharapkan dalam sampel eksperimental Anda.
Bagaimana efisiensi qPCR mempengaruhi perhitungan kuantifikasi relatif?
Dalam kuantifikasi relatif menggunakan metode ΔΔCt, diasumsikan efisiensi yang sama antara gen target dan gen referensi (idealnya 100%). Ketika efisiensi berbeda secara signifikan:
- Metode ΔΔCt standar dapat menyebabkan kesalahan kuantifikasi yang substansial
- Model perhitungan yang dikoreksi efisiensi (seperti metode Pfaffl) harus digunakan
- Besarnya kesalahan meningkat dengan perbedaan Ct yang lebih besar antara sampel
Bisakah saya menggunakan nilai efisiensi yang sama untuk semua eksperimen qPCR saya?
Tidak, efisiensi harus ditentukan untuk setiap pasangan primer dan harus divalidasi ulang:
- Saat menggunakan lot primer baru
- Saat mengubah kondisi reaksi atau campuran master
- Saat bekerja dengan jenis sampel yang berbeda atau metode ekstraksi
- Secara berkala sebagai bagian dari kontrol kualitas
Bagaimana inhibitor PCR mempengaruhi perhitungan efisiensi?
Inhibitor PCR dapat:
- Mengurangi efisiensi keseluruhan
- Mempengaruhi sampel dengan konsentrasi lebih tinggi lebih parah
- Menciptakan ketidaklinieran dalam kurva standar
- Mengarah pada underestimation kelimpahan target
- Menyebabkan amplifikasi yang tidak konsisten di seluruh replikasi
Apa perbedaan antara efisiensi qPCR dan efisiensi PCR?
Istilah ini sering digunakan secara bergantian, tetapi:
- Efisiensi qPCR secara khusus merujuk pada efisiensi yang diukur dalam PCR kuantitatif waktu nyata
- Efisiensi PCR dapat merujuk pada konsep umum dalam reaksi PCR mana pun
- Efisiensi qPCR diukur secara kuantitatif menggunakan kurva standar atau metode lain
- Efisiensi PCR tradisional sering dinilai secara kualitatif melalui elektroforesis gel
Bagaimana saya bisa meningkatkan efisiensi qPCR saya?
Untuk meningkatkan efisiensi qPCR:
- Optimalkan desain primer (panjang 18-22 bp, konten GC 50-60%, Tm sekitar 60°C)
- Uji suhu annealing yang berbeda
- Optimalkan konsentrasi primer
- Gunakan template DNA/RNA berkualitas tinggi
- Pertimbangkan untuk menggunakan enhancer PCR untuk template yang sulit
- Pastikan persiapan sampel yang tepat untuk menghilangkan potensi inhibitor
- Uji berbagai campuran master komersial
Bisakah saya membandingkan sampel dengan efisiensi yang berbeda?
Membandingkan sampel dengan efisiensi yang berbeda secara signifikan tidak disarankan karena:
- Ini dapat menyebabkan kesalahan kuantifikasi yang substansial
- Besarnya kesalahan meningkat dengan perbedaan Ct yang lebih besar
- Jika tidak dapat dihindari, model perhitungan yang dikoreksi efisiensi harus digunakan
- Hasil harus diinterpretasikan dengan hati-hati dan validasi tambahan
Referensi
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. Pedoman MIQE: informasi minimum untuk publikasi eksperimen PCR waktu nyata kuantitatif. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Model matematis baru untuk kuantifikasi relatif dalam RT-PCR waktu nyata. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Seberapa baik perkiraan efisiensi PCR: Rekomendasi untuk penilaian efisiensi qPCR yang tepat dan kuat. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Eksperimen qPCR Terbaik: Menghasilkan Data yang Dapat Dipublikasikan dan Dapat Direproduksi Pertama Kali. Tren Bioteknol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Efisiensi amplifikasi: menghubungkan baseline dan bias dalam analisis data qPCR kuantitatif. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Analisis PCR kinetik: pemantauan waktu nyata reaksi amplifikasi DNA. Bioteknologi (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Laboratorium Bio-Rad. Panduan Aplikasi PCR Waktu Nyata. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Buku Panduan PCR Waktu Nyata. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Kalkulator Efisiensi qPCR kami menyediakan alat yang sederhana namun kuat bagi peneliti untuk memvalidasi dan mengoptimalkan eksperimen PCR kuantitatif mereka. Dengan menghitung efisiensi secara akurat dari kurva standar, Anda dapat memastikan kuantifikasi yang dapat diandalkan, memecahkan masalah assay yang bermasalah, dan mematuhi praktik terbaik dalam eksperimen qPCR.
Cobalah kalkulator kami hari ini untuk meningkatkan kualitas dan keandalan data qPCR Anda!
Maklum balas
Klik toast maklum balas untuk mula memberi maklum balas tentang alat ini
Alat Berkaitan
Temui lebih banyak alat yang mungkin berguna untuk aliran kerja anda