BCA-absorptiosampletilavuuden laskuri laboratorioprotokollille
Laske tarkat näytteen tilavuudet BCA-testin absorptiolukemien ja halutun proteiinimassan perusteella. Olennaista johdonmukaiselle proteiinilastille western blot -menetelmissä ja muissa laboratoriokäytännöissä.
BCA-absorptiotaulukon näytteen tilavuuden laskin
Tämä työkalu laskee tarvittavan näytteen tilavuuden BCA-absorptiotaulukoiden ja näytteen massan perusteella. Syötä kunkin näytteen absorptioväriarvo ja näytteen massa lasketaksesi vastaava näytteen tilavuus.
standardCurveTitle
Näytteen syötteet
Näyte 1
Laskentakaava
Näytteen tilavuus lasketaan seuraavalla kaavalla:
usageTipsTitle
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Dokumentaatio
BCA Absorbanssinäytevolyymilaskuri
Johdanto
BCA Absorbanssinäytevolyymilaskuri on erityinen työkalu, joka on suunniteltu auttamaan tutkijoita ja laboratorioteknikkoja määrittämään tarkasti sopiva näytevolyymi kokeita varten BCA (bicinchoninic acid) -testitulosten perusteella. Tämä laskuri ottaa BCA-testin absorbanssilukemat ja halutun näytemassan huomioon laskettaessa tarkkaa volyymiä, joka tarvitaan johdonmukaiseen proteiinin kuormitukseen sovelluksissa, kuten western blotting, entsymaattiset testit ja muut proteiinianalyysitekniikat.
BCA-testi on yksi laajimmin käytetyistä menetelmistä proteiinien kvantifioimiseksi biokemian ja molekyylibiologian laboratorioissa. Mittaamalla proteiininäytteidesi absorbanssia ja vertaamalla niitä standardikäyrään voit määrittää proteiinipitoisuuden suurella tarkkuudella. Laskurimme yksinkertaistaa tätä prosessia muuntamalla automaattisesti absorbanssilukemat tarkiksi näytevolyymeiksi, joita tarvitaan kokeissasi.
BCA-testin ja näytevolyylin laskemisen ymmärtäminen
Mikä on BCA-testi?
Bicinchoninic Acid (BCA) -testi on biokemiallinen testi, jolla määritetään proteiinin kokonaispitoisuus liuoksessa. Tämän testin periaate perustuu Cu²⁺-proteiiniyhdistelmän muodostumiseen emäksisissä olosuhteissa, jota seuraa Cu²⁺-ionien pelkistyminen Cu¹⁺-ioneiksi. Pelkistyminen on suhteessa läsnä olevaan proteiiniin. BCA muodostaa purppuranvärisen kompleksin Cu¹⁺-ionien kanssa emäksisissä ympäristöissä, mikä tarjoaa perustan proteiinien pelkistymisen seurannan.
Purppuranvärisen kompleksin intensiivisyys kasvaa suhteessa proteiinipitoisuuteen, jota voidaan mitata spektrofotometrillä noin 562 nm:n aallonpituudella. Absorbanssilukemat verrataan sitten standardikäyrään, jotta voidaan määrittää tuntemattomien näytteiden proteiinipitoisuus.
Kaava näytevolyylin laskemiseen
Peruskaava näytevolyymin laskemiseksi BCA-absorbanssituloksista on:
Missä:
- Näytevolyymi on tarvittava näytteen määrä (mikrolitroina, μL)
- Näytemassa on haluttu proteiinin määrä (mikrogrammoina, μg)
- Proteiinipitoisuus saadaan BCA-absorbanssilukemasta (μg/μL)
Proteiinipitoisuus lasketaan absorbanssilukemasta standardikäyrän kaavan avulla:
Tyypillisessä BCA-testissä kaltevuus on yleensä noin 2.0, ja leikkaus on usein lähellä nollaa, vaikka nämä arvot voivat vaihdella erityisten testausolosuhteiden ja standardikäyrän mukaan.
Kuinka käyttää BCA Absorbanssinäytevolyymilaskuria
Laskurimme yksinkertaistaa prosessia, jolla määritetään näytevolyymit BCA-testituloksista. Seuraa näitä vaiheita saadaksesi tarkkoja laskelmia:
-
Syötä näytetiedot:
- Anna näytteellesi nimi (valinnainen, mutta hyödyllinen useiden näytteiden seuraamiseksi)
- Syötä BCA-absorbanssilukema spektrofotometriltäsi
- Syötä haluamasi näytemassa (haluttu proteiinin määrä μg:na)
-
Valitse standardikäyrän tyyppi:
- Standardi (oletus): Käyttää tyypillisiä BCA-standardikäyrän parametreja
- Parannettu: Parannettua herkkyysprotokollaa varten
- Mikro: Mikrolevyprotokollaa varten
- Mukautettu: Mahdollistaa omien kaltevuus- ja leikkausarvojen syöttämisen
-
Näe tulokset:
- Laskuri näyttää heti tarvittavan näytevolyymin mikrolitroina
- Tulokset esitetään myös yhteenvetotaulukkona helppoa viittaamista varten
- Useiden näytteiden osalta voit lisätä lisää merkintöjä ja verrata tuloksia
-
Kopioi tai vie tulokset:
- Käytä kopiopainiketta siirtääksesi tulokset laboratoriopäiväkirjaasi tai muihin sovelluksiin
- Kaikki laskelmat voidaan tallentaa tulevaa käyttöä varten
Esimerkki vaihe vaiheelta
Käydään läpi käytännön esimerkki:
- Olet suorittanut BCA-testin ja saanut absorbanssilukeman 0.75 proteiininäytteellesi.
- Haluat kuormittaa 20 μg proteiinia western blot -menetelmääsi varten.
- Käyttäen standardikäyrää (kaltevuus = 2.0, leikkaus = 0):
- Proteiinipitoisuus = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
- Tarvittava näytevolyymi = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL
Tämä tarkoittaa, että sinun tulisi kuormittaa 13.33 μL näytettä saadaksesi 20 μg proteiinia.
Tulosten ymmärtäminen
Laskuri tarjoaa useita tärkeitä tietoja:
-
Proteiinipitoisuus: Tämä lasketaan absorbanssilukemastasi valitun standardikäyrän avulla. Se edustaa proteiinin määrää per yksikkötilavuus näytteessäsi (μg/μL).
-
Näytevolyymi: Tämä on sen näytteen määrä, joka sisältää halutun proteiinimäärän. Tämä arvo on se, mitä käytät valmistellessasi kokeitasi.
-
Varoitukset ja suositukset: Laskuri voi antaa varoituksia:
- Erittäin korkeista absorbanssilukemista (>3.0), jotka voivat olla testin lineaarisen alueen ulkopuolella
- Erittäin matalista absorbanssilukemista (<0.1), jotka voivat olla havaitsemisrajan lähellä
- Lasketuista volyymeista, jotka ovat käytännössä liian suuria (>1000 μL) tai pieniä (<1 μL)
Sovellukset ja käyttötapaukset
Western Blot -näytteen valmistelu
Yksi yleisimmistä sovelluksista tälle laskurille on näytteiden valmistelu western blottingia varten. Johdonmukainen proteiinin kuormitus on ratkaisevan tärkeää luotettavien western blot -tulosten saamiseksi, ja tämä laskuri varmistaa, että kuormitat saman määrän proteiinia jokaiselle näytteelle, vaikka niiden pitoisuudet vaihtelevat.
Esimerkkityönkulku:
- Suorita BCA-testi kaikille proteiininäytteillesi
- Päätä johdonmukainen proteiinimäärä, joka kuormitetaan (yleensä 10-50 μg)
- Käytä laskuria määrittääksesi tarvittavat volyymit jokaiselle näytteelle
- Lisää sopivat määrät näytepuskuria ja pelkistysainetta
- Kuormita lasketut volyymit geeliisi
Entsymaattiset testit
Entsymaattisissa testeissä on usein tarpeen käyttää tiettyä määrää proteiinia standardoimaan reaktiot olosuhteet eri näytteiden tai kokeiden välillä.
Esimerkkityönkulku:
- Määritä proteiinipitoisuus BCA-testillä
- Laske tarvittava volyymi halutun proteiinimäärän saamiseksi
- Lisää tämä määrä reaktiomikstuurasi
- Jatka entsymaattista testiäsi
Immunoprecipitaatiokokeet
Immunoprecipitaatiokokeissa on tärkeää aloittaa johdonmukaisella proteiinimäärällä, jotta voit verrata tuloksia eri olosuhteiden välillä.
Esimerkkityönkulku:
- Mittaa solujen tai kudosten lysaatin proteiinipitoisuus BCA-testillä
- Laske volyymit, jotka tarvitaan yhtä suurten proteiinimäärien saamiseksi (yleensä 500-1000 μg)
- Säädä kaikki näytteet samaan tilavuuteen lysisbufferilla
- Jatka vasta-aineinkubointia ja saantia
Proteiinipuhdistus
Proteiinipuhdistuksen aikana on usein tarpeen seurata proteiinipitoisuutta ja laskea saantoja eri vaiheissa.
Esimerkkityönkulku:
- Kerää fraktioita puhdistuksen aikana
- Suorita BCA-testi valituista fraktioista
- Laske proteiinipitoisuus ja kokonaisproteiinimäärä
- Määritä tarvittavat volyymit seuraavia sovelluksia varten
Edistyneet ominaisuudet ja huomioon otettavat seikat
Mukautetut standardikäyrät
Vaikka laskuri tarjoaa oletusparametreja standardi BCA-testeille, voit myös syöttää mukautettuja arvoja, jos olet luonut oman standardikäyräsi. Tämä on erityisen hyödyllistä, kun:
- Työskentelet ei-standardin proteiininäytteiden kanssa
- Käytät muokattuja BCA-protokollia
- Työskentelet aineiden läsnä ollessa, jotka voivat häiritä testiä
Käyttääksesi mukautettua standardikäyrää:
- Valitse "Mukautettu" standardikäyrävalinnoista
- Syötä kaltevuus- ja leikkausarvosi
- Laskuri käyttää näitä arvoja kaikissa seuraavissa laskelmissa
Useiden näytteiden käsittely
Laskuri mahdollistaa useiden näytteiden lisäämisen ja niiden volyymien laskemisen samanaikaisesti. Tämä on erityisen hyödyllistä, kun valmistellaan näytteitä kokeita varten, jotka vaativat johdonmukaista proteiinikuormitusta eri olosuhteissa.
Useiden näytteiden käsittelyn hyödyt:
- Säästä aikaa laskemalla kaikki volyymit kerralla
- Varmista johdonmukaisuus kaikissa näytteissäsi
- Vertaile helposti proteiinipitoisuuksia näytteiden välillä
- Tunnista poikkeamat tai mahdolliset mittausvirheet
Rajatapauksien käsittely
Erittäin korkeat absorbanssilukemat
Jos absorbanssilukemasi on yli 2.0, se voi olla BCA-testin lineaarisen alueen ulkopuolella. Tällaisissa tapauksissa:
- Laimenna näytettäsi ja toista BCA-testi
- Vaihtoehtoisesti käytä laskurin varoitusjärjestelmää, joka merkitsee mahdollisesti ongelmalliset lukemat
Erittäin matalat absorbanssilukemat
Absorbanssilukemille, jotka ovat alle 0.1, saatat olla havaitsemisrajan lähellä, mikä voi vaikuttaa tarkkuuteen. Harkitse:
- Näytteen tiivistämistä, jos mahdollista
- Käytä herkempiä proteiinikvantifiointimenetelmiä
- Säädä kokeellista suunnitelmaasi alhaisempien proteiinimäärien huomioon ottamiseksi
Käytännössä liian suuret lasketut volyymit
Jos laskuri ehdottaa volyymiä, joka on liian suuri sovelluksellesi:
- Harkitse proteiininäytteen tiivistämistä
- Säädä haluttua proteiinimäärää alaspäin, jos kokeesi sallii sen
- Käytä suurinta käytännöllistä volyymiä ja huomioi käytetty todellinen proteiinimäärä
Proteiinikvantifioinnin historia ja BCA-testi
Proteiinien tarkka kvantifiointi on ollut perustarve biokemiassa ja molekyylibiologiassa siitä lähtien, kun nämä alat syntyivät. Varhaiset menetelmät perustuivat typpipitoisuuden määrittämiseen, mikä oli aikaa vievää ja vaati erikoislaitteita.
Proteiinikvantifiointimenetelmien kehitys
-
Kjeldahl-menetelmä (1883): Yksi varhaisimmista menetelmistä proteiinikvantifioinnille, joka perustuu typpipitoisuuden mittaamiseen.
-
Biuret-testi (1900-luvun alku): Tämä menetelmä perustuu peptidisiteiden reaktioon kupari-ionien kanssa emäksisessä liuoksessa, mikä tuottaa violetin värin.
-
Lowry-testi (1951): Oliver Lowryn kehittämä menetelmä yhdisti biuret-reaktion Folin-Ciocalteu-reagenssiin, mikä lisäsi herkkyyttä.
-
Bradford-testi (1976): Marion Bradford kehitti tämän menetelmän käyttäen Coomassie Brilliant Blue G-250 -väria, joka sitoutuu proteiineihin ja siirtää absorptiomaksimin.
-
BCA-testi (1985): Paul Smith ja kollegat Pierce Chemical Companyltä kehittivät tämän menetelmän yhdistämällä biuret-reaktion BCA-havaitsemiseen, tarjoten parannettua herkkyyttä ja yhteensopivuutta pesuaineiden kanssa.
BCA-testin kehitys
BCA-testi kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1985 Smithin ja muiden kirjoittamassa artikkelissa "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Se kehitettiin vastaamaan olemassa olevien menetelmien rajoituksia, erityisesti kemikaalien häiriöitä, joita käytetään yleisesti proteiinien eristämisessä ja puhdistuksessa.
Keskeinen innovaatio oli käyttää bicinchoninic acidia havaitsemaan Cu¹⁺-ioneja, jotka syntyvät proteiinien välittämästä Cu²⁺-pelkistyksestä, muodostaen purppuranvärisen kompleksin, jota voidaan mitata spektrofotometrisesti. Tämä tarjosi useita etuja:
- Korkeampi herkkyys kuin biuret-menetelmällä
- Vähemmän alttiutta häiriöille kuin Lowry-menetelmällä
- Parempi yhteensopivuus pesuaineiden kanssa kuin Bradford-testissä
- Yksinkertaisempi protokolla, jossa on vähemmän reagensseja ja vaiheita
Sen käyttöönoton jälkeen BCA-testi on tullut yhdeksi laajimmin käytetyistä proteiinikvantifiointimenetelmistä biokemian ja molekyylibiologian laboratorioissa ympäri maailmaa.
Koodiesimerkit näytevolyymin laskemiseen
Excel-kaava
1=IF(B2<=0,"Virhe: Virheellinen absorbanssi",IF(C2<=0,"Virhe: Virheellinen näytemassa",C2/(2*B2)))
2
3' Missä:
4' B2 sisältää absorbanssilukeman
5' C2 sisältää halutun näytemassan μg:na
6' Kaava palauttaa vaaditun näytevolyymin μL:na
7Python-toteutus
1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Laske proteiinipitoisuus absorbanssista standardikäyrän avulla."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Laske tarvittava näytevolyymi absorbanssin ja halutun massan perusteella."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Näytemassan on oltava positiivinen")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Esimerkkikäyttö
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorbanssille {absorbance} ja halutulle proteiinimassalle {sample_mass} μg:")
31 print(f"Proteiinipitoisuus: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vaadittu näytevolyymi: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Virhe: {e}")
35R-koodi analyysiin
1# Funktio proteiinipitoisuuden laskemiseksi absorbanssista
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktio näytevolyymin laskemiseksi
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Näytemassan on oltava positiivinen")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Esimerkkikäyttö
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorbanssille %.2f ja halutulle proteiinimassalle %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Proteiinipitoisuus: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vaadittu näytevolyymi: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Virhe: %s\n", e$message))
39})
40JavaScript-toteutus
1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Näytemassan on oltava positiivinen");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Esimerkkikäyttö
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorbanssille ${absorbance} ja halutulle proteiinimassalle ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Proteiinipitoisuus: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vaadittu näytevolyymi: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Virhe: ${error.message}`);
37}
38Standardikäyrän visualisointi
Suhde absorbanssin ja proteiinipitoisuuden välillä on tyypillisesti lineaarinen tietyllä alueella. Alla on visualisointi BCA-standardikäyrästä:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Vertailu muihin proteiinikvantifiointimenetelmiin
Eri proteiinikvantifiointimenetelmillä on erilaisia etuja ja rajoituksia. Tässä on, kuinka BCA-testi vertautuu muihin yleisiin menetelmiin:
| Menetelmä | Herkkyysalue | Edut | Rajoitukset | Parasta varten |
|---|---|---|---|---|
| BCA-testi | 5-2000 μg/mL | • Yhteensopiva pesuaineiden kanssa • Vähemmän proteiini-proteiini-varianssia • Vakaat väri kehitys | • Häiriintyy pelkistysaineista • Vaikuttavat jotkin chelatoivat aineet | • Yleinen proteiinikvantifiointi • Näytteet, jotka sisältävät pesuaineita |
| Bradford-testi | 1-1500 μg/mL | • Nopea (2-5 min) • Vain vähän häiriöitä | • Suuri proteiini-proteiini-varianssi • Yhteensopimaton pesuaineiden kanssa | • Nopeita mittauksia • Pesuaineettomat näytteet |
| Lowry-menetelmä | 1-1500 μg/mL | • Hyvin vakiintunut • Hyvä herkkyys | • Monet häiriötekijät • Useita vaiheita | • Historiallinen johdonmukaisuus • Puhtaat proteiininäytteet |
| UV-absorptio (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Tuhoamaton • Erittäin nopea • Ei reagensseja tarvita | • Vaikuttavat nukleiinihapot • Vaatii puhtaita näytteitä | • Puhtaat proteiiniliuokset • Nopeat tarkistukset puhdistuksen aikana |
| Fluorometrinen | 0.1-500 μg/mL | • Korkein herkkyys • Laaja dynaaminen alue | • Kalliit reagenssit • Vaatii fluorometrin | • Erittäin laimeat näytteet • Rajoitettu näytemäärä |
Usein kysytyt kysymykset
Mihin BCA-testiä käytetään?
BCA (bicinchoninic acid) -testiä käytetään ensisijaisesti proteiinipitoisuuden kvantifioimiseen näytteessä. Sitä käytetään laajalti biokemiassa, solubiologiassa ja molekyylibiologiassa sovelluksissa, kuten western blotting, entsymaattiset testit, immunoprecipitaatio ja proteiinipuhdistus.
Kuinka tarkka BCA-testi on?
BCA-testi on yleensä tarkka 5-10 %:n sisällä, kun se suoritetaan oikein. Sen tarkkuus riippuu useista tekijöistä, mukaan lukien standardikäyrän laatu, häiriöiden puuttuminen ja onko tuntemattoman proteiinin koostumus samanlainen kuin käytetyn standardiproteiinin.
Mitkä asiat voivat häiritä BCA-testin tuloksia?
Useat aineet voivat häiritä BCA-testin tuloksia, mukaan lukien:
- Pelkistysaineet (DTT, β-merkaptobutanoli, glutationi)
- Chelatoivat aineet (EDTA, EGTA)
- Korkeat yksinkertaisten sokerien pitoisuudet
- Lipidit
- Jotkut pesuaineet suurilla pitoisuuksilla
- Ammoniumyhdisteet
Mikä on ero BCA- ja Bradford-testausten välillä?
Pääasialliset erot ovat:
- BCA-testi on yhteensopivampi pesuaineiden ja pinta-aktiivisten aineiden kanssa
- Bradford-testi on nopeampi (2-5 minuuttia vs. 30+ minuuttia BCA:lle)
- BCA:lla on vähemmän proteiini-proteiini-varianssia
- Bradford on herkempi emäksisille aminohapoille
- BCA häiriintyy pelkistysaineista, kun taas Bradford ei
Miksi lasketut näytevolyymit ovat liian suuria?
Jos laskurisi näyttää erittäin suurta näytevolyymiä, se yleensä tarkoittaa matalaa proteiinipitoisuutta alkuperäisessä näytteessäsi. Tämä voi johtua:
- Todellisesta alhaisesta proteiinipitoisuudesta alkuperäisessä näytteessä
- Proteiinin häviämisestä valmistelun aikana
- Virheistä BCA-testimenettelyssä
- Epätarkasta absorbanssilukemasta
Harkitse näytteen tiivistämistä tai halutun proteiinimäärän säätämistä alaspäin, jos kokeesi sallii sen.
Voinko käyttää tätä laskuria muihin proteiinikvantifiointimenetelmiin?
Tämä laskuri on erityisesti suunniteltu BCA-testin tuloksille. Vaikka perusperiaate (pitoisuuden muuntaminen volyymiksi) pätee muihin menetelmiin, absorbanssin ja proteiinipitoisuuden välinen suhde vaihtelee eri testeissä. Toisten menetelmien, kuten Bradfordin tai Lowryn, osalta sinun on käytettävä erilaisia standardikäyrän parametreja.
Kuinka käsitellä näytteitä, joiden absorbanssi on lineaarisen alueen ulkopuolella?
Jos absorbanssilukemasi on lineaarisen alueen ulkopuolella (yleensä >2.0):
- Laimenna näytettä ja toista BCA-testi
- Käytä toista proteiinikvantifiointimenetelmää
- Säädä standardikäyrää sisältämään korkeampia pitoisuusstandardeja
Mikä proteiini tulisi käyttää standardina?
Bovine Serum Albumin (BSA) on yleisimmin käytetty standardi BCA-testeissä, koska se on:
- Helposti saatavilla ja edullinen
- Erittäin liukoinen
- Vakaana liuoksessa
- Hyvin karakterisoitu
Kuitenkin, jos näytteesi sisältävät vallitsevan proteiinin, joka poikkeaa merkittävästi BSA:sta, harkitse sen proteiinin käyttöä standardina tarkempien tulosten saamiseksi.
Kuinka kauan BCA-reaktio on vakaa?
Purppuranvärinen väri, joka kehittyy BCA-reaktiossa, on vakaa useita tunteja huoneenlämmössä ja sitä voidaan mitata milloin tahansa tuona aikana. Kuitenkin parhaan tuloksen saamiseksi suositellaan mittaamaan kaikki standardit ja näytteet suunnilleen samaan aikaan värin kehittämisen jälkeen.
Voinko käyttää aiemmin tehtyä standardikäyrää uudelleen?
Vaikka on teknisesti mahdollista käyttää aiemmin tehtyä standardikäyrää, sitä ei suositella tarkkojen kvantifiointitulosten saamiseksi. Reagenssien, inkubointiolosuhteiden ja instrumentin kalibroinnin vaihtelut voivat vaikuttaa absorbanssin ja proteiinipitoisuuden väliseen suhteeseen. Luotettavien tulosten saamiseksi luo uusi standardikäyrä jokaiselle testille.
Viitteet
-
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
-
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Ohjeet. Saatavilla: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
-
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
-
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
-
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Kokeile BCA Absorbanssinäytevolyymilaskuria tänään!
Nyt kun ymmärrät BCA-proteiinikvantifioinnin ja näytevolyymin laskemisen periaatteet, kokeile laskuriamme yksinkertaistaaksesi laboratorio työprosessejasi. Syötä vain absorbanssilukemat ja haluttu näytemassa saadaksesi välittömiä, tarkkoja näytevolymlaskelmia.
Olitpa valmistamassa näytteitä western blottingia, entsymaattisia testejä tai muita proteiinipohjaisia kokeita varten, laskurimme auttaa varmistamaan johdonmukaiset ja luotettavat tulokset. Säästä aikaa, vähennä virheitä ja paranna kokeidesi toistettavuutta BCA Absorbanssinäytevolyymilaskurilla.
Liittyvät Työkalut
Löydä lisää työkaluja, jotka saattavat olla hyödyllisiä työnkulullesi