Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA per Protocolli di Laboratorio

Calcola volumi di campione precisi basati sulle letture di assorbanza del saggio BCA e sulla massa proteica desiderata. Essenziale per un caricamento proteico coerente nei western blot e in altre applicazioni di laboratorio.

Calcolatore del Volume del Campione di Assorbimento BCA

Questo strumento calcola il volume del campione richiesto in base ai risultati di assorbimento BCA e alla massa del campione. Inserisci il valore di assorbimento e la massa del campione per ciascun campione per calcolare il volume del campione corrispondente.

standardCurveTitle

standardCurveTypeLabel

curveTypeStandard

curveTypeEnhanced

curveTypeMicro

curveTypeCustom

Input Campione

Campione 1

Nome del Campione

Assorbimento BCA*

Massa del Campione (μg)*

Volume del Campione

Copy

N/A μL

Formula di Calcolo

Il volume del campione è calcolato utilizzando la seguente formula:

Volume del Campione (μL) = Massa del Campione (μg) / Concentrazione di Proteine (μg/μL)

usageTipsTitle

• tipAbsorbanceRange

• tipSampleMass

• tipSampleVolume

• tipStandardCurve

📚

Documentazione

Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA

Introduzione

Il Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA è uno strumento specializzato progettato per aiutare i ricercatori e i tecnici di laboratorio a determinare con precisione il volume del campione appropriato per esperimenti basati sui risultati dell'assay BCA (acido bicinchonico). Questo calcolatore prende le letture di assorbanza dal tuo assay BCA e la massa del campione desiderata per calcolare il volume preciso necessario per un caricamento di proteine coerente in applicazioni come il western blotting, gli assay enzimatici e altre tecniche di analisi delle proteine.

L'assay BCA è uno dei metodi più ampiamente utilizzati per la quantificazione delle proteine nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Misurando l'assorbanza dei tuoi campioni proteici e confrontandoli con una curva standard, puoi determinare la concentrazione di proteine con alta precisione. Il nostro calcolatore semplifica questo processo convertendo automaticamente le letture di assorbanza nei volumi esatti richiesti per i tuoi esperimenti.

Comprendere l'Assay BCA e il Calcolo del Volume del Campione

Cos'è un Assay BCA?

L'assay Bicinchonico (BCA) è un assay biochimico per determinare la concentrazione totale di proteine in una soluzione. Il principio di questo assay si basa sulla formazione di un complesso Cu²⁺-proteina in condizioni alcaline, seguito dalla riduzione di Cu²⁺ a Cu¹⁺. La quantità di riduzione è proporzionale alla proteina presente. Il BCA forma un complesso di colore viola con Cu¹⁺ in ambienti alcalini, fornendo una base per monitorare la riduzione del rame da parte delle proteine.

L'intensità del colore viola aumenta proporzionalmente con la concentrazione di proteine, che può essere misurata utilizzando uno spettrofotometro a circa 562 nm. Le letture di assorbanza vengono quindi confrontate con una curva standard per determinare la concentrazione di proteine nei campioni sconosciuti.

La Formula per il Calcolo del Volume del Campione

La formula fondamentale per calcolare il volume del campione dai risultati di assorbanza BCA è:

$\text{Volume del Campione (μL)} = \frac{\text{Massa del Campione (μg)}}{\text{Concentrazione di Proteine (μg/μL)}}$

Dove:

Volume del Campione è il volume del campione necessario (in microlitri, μL)
Massa del Campione è la quantità desiderata di proteine da utilizzare (in microgrammi, μg)
Concentrazione di Proteine è derivata dalla lettura di assorbanza BCA (in μg/μL)

La concentrazione di proteine è calcolata dalla lettura di assorbanza utilizzando l'equazione della curva standard:

$\text{Concentrazione di Proteine (μg/μL)} = \text{Inclinazione} \times \text{Assorbanza} + \text{Intercetta}$

Per un assay BCA standard, l'inclinazione tipica è di circa 2.0, e l'intercetta è spesso vicina a zero, anche se questi valori possono variare in base alle condizioni specifiche del tuo assay e della curva standard.

Come Utilizzare il Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA

Il nostro calcolatore semplifica il processo di determinazione dei volumi dei campioni dai risultati dell'assay BCA. Segui questi passaggi per ottenere calcoli accurati:

Inserisci le Informazioni sul Campione:
- Fornisci un nome per il tuo campione (opzionale ma utile per tenere traccia di più campioni)
- Inserisci la lettura di assorbanza BCA dal tuo spettrofotometro
- Inserisci la massa del campione desiderata (la quantità di proteine che desideri utilizzare in μg)
Seleziona il Tipo di Curva Standard:
- Standard (predefinito): Usa i parametri tipici della curva standard BCA
- Migliorata: Per protocollo di sensibilità migliorata
- Micro: Per protocollo a microtitolazione
- Personalizzato: Ti consente di inserire i tuoi valori di inclinazione e intercetta
Visualizza i Risultati:
- Il calcolatore mostrerà istantaneamente il volume del campione richiesto in microlitri
- I risultati sono presentati anche in una tabella di riepilogo per un facile riferimento
- Per più campioni, puoi aggiungere ulteriori voci e confrontare i risultati
Copia o Esporta i Risultati:
- Usa il pulsante di copia per trasferire i risultati nel tuo quaderno di laboratorio o in altre applicazioni
- Tutti i calcoli possono essere salvati per riferimento futuro

Esempio Passo-Passo

Facciamo un esempio pratico:

Hai eseguito un assay BCA e ottenuto una lettura di assorbanza di 0.75 per il tuo campione proteico.
Vuoi caricare 20 μg di proteine per il tuo western blot.
Utilizzando la curva standard (inclinazione = 2.0, intercetta = 0):
- Concentrazione di proteine = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
- Volume del campione richiesto = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

Ciò significa che dovresti caricare 13.33 μL del tuo campione per ottenere 20 μg di proteine.

Comprendere i Risultati

Il calcolatore fornisce diversi pezzi di informazione importanti:

Concentrazione di Proteine: Questa è calcolata dalla tua lettura di assorbanza utilizzando la curva standard selezionata. Rappresenta la quantità di proteine per unità di volume nel tuo campione (μg/μL).
Volume del Campione: Questo è il volume del tuo campione che contiene la quantità desiderata di proteine. Questo valore è ciò che utilizzerai quando prepari i tuoi esperimenti.
Avvertenze e Raccomandazioni: Il calcolatore può fornire avvertenze per:
- Letture di assorbanza molto alte (>3.0) che potrebbero essere al di fuori dell'intervallo lineare dell'assay
- Letture di assorbanza molto basse (<0.1) che potrebbero essere vicine al limite di rilevamento
- Volumi calcolati che sono impraticabilmente grandi (>1000 μL) o piccoli (<1 μL)

Applicazioni e Casi d'Uso

Preparazione dei Campioni per il Western Blot

Una delle applicazioni più comuni per questo calcolatore è la preparazione dei campioni per il western blotting. Un caricamento coerente delle proteine è cruciale per risultati affidabili del western blot, e questo calcolatore assicura che tu carichi la stessa quantità di proteine per ogni campione, anche quando le loro concentrazioni differiscono.

Flusso di lavoro esempio:

Esegui l'assay BCA su tutti i tuoi campioni proteici
Decidi su una quantità di proteine coerente da caricare (tipicamente 10-50 μg)
Usa il calcolatore per determinare il volume necessario per ogni campione
Aggiungi i volumi appropriati di tampone per campioni e agente riducente
Carica i volumi calcolati sul tuo gel

Assay Enzimatici

Per gli assay enzimatici, è spesso necessario utilizzare una quantità specifica di proteine per standardizzare le condizioni di reazione tra diversi campioni o esperimenti.

Flusso di lavoro esempio:

Determina la concentrazione di proteine utilizzando l'assay BCA
Calcola il volume necessario per ottenere la quantità di proteine desiderata
Aggiungi questo volume al tuo miscuglio di reazione
Procedi con il tuo assay enzimatico

Esperimenti di Immunoprecipitazione

Negli esperimenti di immunoprecipitazione (IP), iniziare con una quantità coerente di proteine è importante per confrontare i risultati tra diverse condizioni.

Flusso di lavoro esempio:

Misura la concentrazione di proteine di lisati cellulari o tissutali utilizzando l'assay BCA
Calcola i volumi necessari per ottenere quantità di proteine uguali (tipicamente 500-1000 μg)
Regola tutti i campioni allo stesso volume con tampone di lisi
Procedi con l'incubazione e la precipitazione degli anticorpi

Purificazione delle Proteine

Durante la purificazione delle proteine, è spesso necessario tenere traccia della concentrazione di proteine e calcolare i rendimenti in diverse fasi.

Flusso di lavoro esempio:

Raccogli le frazioni durante la purificazione
Esegui l'assay BCA su frazioni selezionate
Calcola la concentrazione di proteine e la quantità totale di proteine
Determina i volumi necessari per le applicazioni successive

Funzionalità Avanzate e Considerazioni

Curve Standard Personalizzate

Sebbene il calcolatore fornisca parametri predefiniti per gli assay BCA standard, puoi anche inserire valori personalizzati se hai generato la tua curva standard. Questo è particolarmente utile quando:

Lavori con campioni di proteine non standard
Utilizzi protocolli BCA modificati
Lavori in presenza di sostanze che potrebbero interferire con l'assay

Per utilizzare una curva standard personalizzata:

Seleziona "Personalizzato" dalle opzioni della curva standard
Inserisci i tuoi valori di inclinazione e intercetta
Il calcolatore utilizzerà questi valori per tutti i calcoli successivi

Gestire Più Campioni

Il calcolatore ti consente di aggiungere più campioni e calcolare i loro volumi simultaneamente. Questo è particolarmente utile quando prepari campioni per esperimenti che richiedono un caricamento coerente delle proteine attraverso più condizioni.

Vantaggi dell'elaborazione in batch:

Risparmia tempo calcolando tutti i volumi in una volta
Assicura coerenza tra tutti i tuoi campioni
Confronta facilmente le concentrazioni di proteine tra i campioni
Identifica valori anomali o potenziali errori di misurazione

Gestire Casi Limite

Letture di Assorbanza Molto Alte

Se la tua lettura di assorbanza è superiore a 2.0, potrebbe essere al di fuori dell'intervallo lineare dell'assay BCA. In questi casi:

Diluisci il tuo campione e ripeti l'assay BCA
In alternativa, utilizza il sistema di avviso del calcolatore, che segnalerà letture potenzialmente problematiche

Letture di Assorbanza Molto Basse

Per letture di assorbanza inferiori a 0.1, potresti essere vicino al limite di rilevamento dell'assay, il che potrebbe influenzare l'accuratezza. Considera:

Concentrando il tuo campione se possibile
Utilizzando un metodo di quantificazione delle proteine più sensibile
Regolando il tuo design sperimentale per adattarsi a quantità di proteine inferiori

Volumi Calcolati Impraticabilmente Grandi

Se il calcolatore suggerisce un volume che è troppo grande per la tua applicazione:

Considera di concentrare il tuo campione di proteine
Regola la tua quantità di proteine desiderata verso il basso se il tuo esperimento lo consente
Usa il volume massimo pratico e annota la quantità effettiva di proteine utilizzate

Storia della Quantificazione delle Proteine e dell'Assay BCA

La quantificazione accurata delle proteine è stata una necessità fondamentale in biochimica e biologia molecolare sin dall'emergere di questi campi. I metodi iniziali si basavano sulla determinazione del contenuto di azoto, che era dispendioso in termini di tempo e richiedeva attrezzature specializzate.

Evoluzione dei Metodi di Quantificazione delle Proteine

Metodo Kjeldahl (1883): Uno dei primi metodi per la quantificazione delle proteine, basato sulla misurazione del contenuto di azoto.
Test Biuret (Inizio 1900): Questo metodo si basa sulla reazione tra legami peptidici e ioni di rame in una soluzione alcalina, producendo un colore viola.
Assay Lowry (1951): Sviluppato da Oliver Lowry, questo metodo ha combinato la reazione Biuret con il reagente Folin-Ciocalteu, aumentando la sensibilità.
Assay Bradford (1976): Marion Bradford ha sviluppato questo metodo utilizzando il colorante Coomassie Brilliant Blue G-250, che si lega alle proteine e sposta il massimo di assorbimento.
Assay BCA (1985): Sviluppato da Paul Smith e colleghi della Pierce Chemical Company, questo metodo ha combinato la reazione biuret con la rilevazione BCA, offrendo una sensibilità migliorata e compatibilità con i detergenti.

Sviluppo dell'Assay BCA

L'assay BCA è stato descritto per la prima volta in un articolo del 1985 di Smith et al. intitolato "Measurement of protein using bicinchoninic acid." È stato sviluppato per affrontare le limitazioni dei metodi esistenti, in particolare l'interferenza da varie sostanze chimiche comunemente utilizzate nell'estrazione e purificazione delle proteine.

L'innovazione chiave è stata l'uso dell'acido bicinchonico per rilevare gli ioni Cu¹⁺ prodotti dalla riduzione mediata dalle proteine di Cu²⁺, formando un complesso di colore viola che poteva essere misurato spettrofotometricamente. Questo ha fornito diversi vantaggi:

Sensibilità più alta rispetto al metodo Biuret
Minore suscettibilità all'interferenza da sostanze non proteiche rispetto al metodo Lowry
Migliore compatibilità con i detergenti rispetto all'assay Bradford
Protocollo più semplice con meno reagenti e passaggi

Dalla sua introduzione, l'assay BCA è diventato uno dei metodi di quantificazione delle proteine più utilizzati nei laboratori di biochimica e biologia molecolare in tutto il mondo.

Esempi di Codice per Calcolare il Volume del Campione

Formula Excel

1=IF(B2<=0,"Errore: Assorbanza non valida",IF(C2<=0,"Errore: Massa del campione non valida",C2/(2*B2)))
2
3' Dove:
4' B2 contiene la lettura di assorbanza
5' C2 contiene la massa del campione desiderata in μg
6' La formula restituisce il volume del campione richiesto in μL
7

Implementazione Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Calcola la concentrazione di proteine dalla assorbanza utilizzando la curva standard."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("L'assorbanza non può essere negativa")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Calcola il volume del campione richiesto in base all'assorbanza e alla massa desiderata."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("La massa del campione deve essere positiva")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Esempio di utilizzo
23assorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(assorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Per assorbanza {assorbance} e massa di proteine desiderata {sample_mass} μg:")
31    print(f"Concentrazione di proteine: {calculate_protein_concentration(assorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"Volume del campione richiesto: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"Errore: {e}")
35

Codice R per l'Analisi

1# Funzione per calcolare la concentrazione di proteine dall'assorbanza
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("L'assorbanza non può essere negativa")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funzione per calcolare il volume del campione
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("La massa del campione deve essere positiva")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Esempio di utilizzo
25assorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(assorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(assorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Per assorbanza %.2f e massa di proteine desiderata %.2f μg:\n", assorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Concentrazione di proteine: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Volume del campione richiesto: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Errore: %s\n", e$message))
39})
40

Implementazione JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("L'assorbanza non può essere negativa");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("La massa del campione deve essere positiva");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Esempio di utilizzo
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Per assorbanza ${assorbance} e massa di proteine desiderata ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`Concentrazione di proteine: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`Volume del campione richiesto: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Errore: ${error.message}`);
37}
38

Visualizzazione della Curva Standard

La relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine è tipicamente lineare all'interno di un certo intervallo. Di seguito è riportata una visualizzazione di una curva standard BCA:

<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0.0

<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Assorbanza (562 nm) Concentrazione di Proteine (μg/μL)

Curva Standard Campioni Standard

Curva Standard BCA

Confronto con Altri Metodi di Quantificazione delle Proteine

Diversi metodi di quantificazione delle proteine hanno vari vantaggi e limitazioni. Ecco come l'assay BCA si confronta con altri metodi comuni:

Metodo	Intervallo di Sensibilità	Vantaggi	Limitazioni	Migliore per
Assay BCA	5-2000 μg/mL	• Compatibile con i detergenti • Minore variazione da proteina a proteina • Stabilità dello sviluppo del colore	• Interferito da agenti riducenti • Influenzato da alcuni agenti chelanti	• Quantificazione generale delle proteine • Campioni contenenti detergenti
Assay Bradford	1-1500 μg/mL	• Rapido (2-5 min) • Poche sostanze interferenti	• Alta variazione da proteina a proteina • Incompatibile con i detergenti	• Misurazioni rapide • Campioni privi di detergenti
Metodo Lowry	1-1500 μg/mL	• Ben consolidato • Buona sensibilità	• Molte sostanze interferenti • Più passaggi	• Coerenza storica • Campioni di proteine pure
Assorbanza UV (280 nm)	20-3000 μg/mL	• Non distruttivo • Molto rapido • Nessun reagente necessario	• Influenzato da acidi nucleici • Richiede campioni puri	• Soluzioni di proteine pure • Controlli rapidi durante la purificazione
Fluorometrico	0.1-500 μg/mL	• Sensibilità massima • Ampio intervallo dinamico	• Reagenti costosi • Richiede fluorometro	• Campioni molto diluiti • Volume di campione limitato

Domande Frequenti

A cosa serve l'assay BCA?

L'assay BCA (acido bicinchonico) è principalmente utilizzato per quantificare la concentrazione totale di proteine in un campione. È ampiamente utilizzato in biochimica, biologia cellulare e biologia molecolare per applicazioni come il western blotting, gli assay enzimatici, l'immunoprecipitazione e la purificazione delle proteine.

Quanto è accurato l'assay BCA?

L'assay BCA è generalmente accurato entro il 5-10% quando eseguito correttamente. La sua accuratezza dipende da diversi fattori, tra cui la qualità della curva standard, l'assenza di sostanze interferenti e se la composizione della proteina sconosciuta è simile a quella della proteina standard utilizzata.

Cosa può interferire con i risultati dell'assay BCA?

Diverse sostanze possono interferire con i risultati dell'assay BCA, tra cui:

Agenti riducenti (DTT, β-mercaptoetanolo, glutatione)
Agenti chelanti (EDTA, EGTA)
Alte concentrazioni di zuccheri semplici
Lipidi
Alcuni detergenti ad alte concentrazioni
Composti di ammoniaca

Qual è la differenza tra gli assay BCA e Bradford?

Le principali differenze sono:

L'assay BCA è più compatibile con i detergenti e i tensioattivi
L'assay Bradford è più veloce (2-5 minuti contro 30+ minuti per BCA)
L'assay BCA ha meno variazione da proteina a proteina
L'assay Bradford è più sensibile agli amminoacidi basici
L'assay BCA è influenzato da agenti riducenti, mentre l'assay Bradford non lo è

Perché il mio volume del campione calcolato è troppo grande?

Se il tuo calcolatore mostra un volume del campione molto grande, di solito indica una bassa concentrazione di proteine nel tuo campione. Questo potrebbe essere dovuto a:

Effettivo basso contenuto di proteine nel tuo campione originale
Perdita di proteine durante la preparazione
Errori nella procedura dell'assay BCA
Lettura di assorbanza inaccurata

Considera di concentrare il tuo campione o di regolare il tuo design sperimentale per adattarsi alla bassa concentrazione di proteine.

Posso utilizzare questo calcolatore per altri metodi di quantificazione delle proteine?

Questo calcolatore è specificamente progettato per i risultati dell'assay BCA. Sebbene il principio di base (convertire la concentrazione in volume) si applichi ad altri metodi, la relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine varia tra i diversi assay. Per altri metodi come Bradford o Lowry, dovresti utilizzare parametri di curva standard diversi.

Come gestisco i campioni con assorbanza al di fuori dell'intervallo lineare?

Per letture di assorbanza al di fuori dell'intervallo lineare (tipicamente >2.0):

Diluisci il tuo campione e ripeti l'assay BCA
Usa un metodo di quantificazione delle proteine diverso
Regola la curva standard per includere standard a concentrazioni più elevate

Quale proteina dovrei usare come standard?

L'albumina sierica bovina (BSA) è il standard più comunemente utilizzato per gli assay BCA perché è:

Facilmente disponibile e poco costosa
Altamente solubile
Stabile in soluzione
Ben caratterizzata

Tuttavia, se i tuoi campioni contengono una proteina predominante che differisce significativamente dalla BSA, considera di utilizzare quella proteina come tuo standard per risultati più accurati.

Quanto tempo è stabile la reazione BCA?

Il colore viola sviluppato nella reazione BCA è stabile per diverse ore a temperatura ambiente e può essere misurato in qualsiasi momento all'interno di quel periodo. Tuttavia, per i migliori risultati, è consigliabile misurare tutti gli standard e i campioni all'incirca nello stesso momento dopo lo sviluppo del colore.

Posso riutilizzare la curva standard di un esperimento precedente?

Sebbene sia tecnicamente possibile riutilizzare una curva standard, non è raccomandato per una quantificazione accurata. Variazioni nei reagenti, nelle condizioni di incubazione e nella calibrazione degli strumenti possono influenzare la relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine. Per risultati affidabili, genera una nuova curva standard ogni volta che esegui l'assay.

Riferimenti

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Istruzioni. Disponibile su: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

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Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA per Protocolli di Laboratorio

Calcolatore del Volume del Campione di Assorbimento BCA

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Input Campione

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Formula di Calcolo

Documentazione

Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA

Introduzione

Comprendere l'Assay BCA e il Calcolo del Volume del Campione

Cos'è un Assay BCA?

La Formula per il Calcolo del Volume del Campione

Come Utilizzare il Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA

Esempio Passo-Passo

Comprendere i Risultati

Applicazioni e Casi d'Uso

Preparazione dei Campioni per il Western Blot

Assay Enzimatici

Esperimenti di Immunoprecipitazione

Purificazione delle Proteine

Funzionalità Avanzate e Considerazioni

Curve Standard Personalizzate

Gestire Più Campioni

Gestire Casi Limite

Letture di Assorbanza Molto Alte

Letture di Assorbanza Molto Basse

Volumi Calcolati Impraticabilmente Grandi

Storia della Quantificazione delle Proteine e dell'Assay BCA

Evoluzione dei Metodi di Quantificazione delle Proteine

Sviluppo dell'Assay BCA

Esempi di Codice per Calcolare il Volume del Campione

Formula Excel

Implementazione Python

Codice R per l'Analisi

Implementazione JavaScript

Visualizzazione della Curva Standard

Confronto con Altri Metodi di Quantificazione delle Proteine

Domande Frequenti

A cosa serve l'assay BCA?

Quanto è accurato l'assay BCA?

Cosa può interferire con i risultati dell'assay BCA?

Qual è la differenza tra gli assay BCA e Bradford?

Perché il mio volume del campione calcolato è troppo grande?

Posso utilizzare questo calcolatore per altri metodi di quantificazione delle proteine?

Come gestisco i campioni con assorbanza al di fuori dell'intervallo lineare?

Quale proteina dovrei usare come standard?

Quanto tempo è stabile la reazione BCA?

Posso riutilizzare la curva standard di un esperimento precedente?

Riferimenti

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