BCA Absorbantie Monster Volume Calculator voor Laboratoriumprotocollen
Bereken nauwkeurige monster volumes op basis van BCA-assay absorbantiewaarden en gewenste proteïne massa. Essentieel voor consistente proteïnebelasting in western blots en andere laboratoriumtoepassingen.
BCA Absorbantie Monster Volume Calculator
Dit hulpmiddel berekent het vereiste monstervolume op basis van BCA absorbantieresultaten en monstergewicht. Voer de absorbentiewaarde en het monstergewicht voor elk monster in om het bijbehorende monstervolume te berekenen.
standardCurveTitle
Monster Invoer
Monster 1
Berekeningsformule
Het monstervolume wordt berekend met behulp van de volgende formule:
usageTipsTitle
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Documentatie
BCA Absorbent Monster Volume Calculator
Inleiding
De BCA Absorbent Monster Volume Calculator is een gespecialiseerd hulpmiddel dat is ontworpen om onderzoekers en laboratoriumtechnici te helpen bij het nauwkeurig bepalen van het juiste monstervolume voor experimenten op basis van BCA (bicinchoninezuur) assayresultaten. Deze calculator neemt de absorptielezingen van uw BCA-assay en uw gewenste monstergewicht om het precieze volume te berekenen dat nodig is voor consistente eiwitbelasting in toepassingen zoals western blotting, enzymatische assays en andere eiwitanalysetechnieken.
De BCA-assay is een van de meest gebruikte methoden voor eiwitkwantificatie in biochemie- en moleculaire biologie-laboratoria. Door de absorptie van uw eiwitmonsters te meten en deze te vergelijken met een standaardcurve, kunt u de eiwitconcentratie met hoge nauwkeurigheid bepalen. Onze calculator stroomlijnt dit proces door absorptielezingen automatisch om te zetten in de exacte monstervolumes die nodig zijn voor uw experimenten.
Het begrijpen van BCA-assay en monstervolume berekening
Wat is een BCA-assay?
De Bicinchoninezuur (BCA) assay is een biochemische assay voor het bepalen van de totale concentratie van eiwit in een oplossing. Het principe van deze assay is gebaseerd op de vorming van een Cu²⁺-eiwitcomplex onder alkalische omstandigheden, gevolgd door de reductie van Cu²⁺ naar Cu¹⁺. De hoeveelheid reductie is evenredig met het aanwezige eiwit. BCA vormt een paarse gekleurde complex met Cu¹⁺ in alkalische omgevingen, wat een basis biedt om de reductie van koper door eiwitten te monitoren.
De intensiteit van de paarse kleur neemt evenredig toe met de eiwitconcentratie, die kan worden gemeten met een spectrofotometer op ongeveer 562 nm. De absorptielezingen worden vervolgens vergeleken met een standaardcurve om de eiwitconcentratie in onbekende monsters te bepalen.
De formule voor monstervolume berekening
De fundamentele formule voor het berekenen van het monstervolume op basis van BCA absorptieresultaten is:
Waarbij:
- Monster Volume het benodigde monstervolume is (in microliters, μL)
- Monster Gewicht de gewenste hoeveelheid eiwit is die gebruikt moet worden (in microgrammen, μg)
- Eiwit Concentratie is afgeleid van de BCA absorptielezing (in μg/μL)
De eiwitconcentratie wordt berekend uit de absorptielezing met behulp van de vergelijking van de standaardcurve:
Voor een standaard BCA-assay is de typische helling ongeveer 2.0, en de interceptie is vaak dicht bij nul, hoewel deze waarden kunnen variëren op basis van uw specifieke assayomstandigheden en standaardcurve.
Hoe de BCA Absorbent Monster Volume Calculator te gebruiken
Onze calculator vereenvoudigt het proces van het bepalen van monstervolumes op basis van BCA-assayresultaten. Volg deze stappen om nauwkeurige berekeningen te krijgen:
-
Voer Monsterinformatie in:
- Geef een naam op voor uw monster (optioneel, maar nuttig voor het bijhouden van meerdere monsters)
- Voer de BCA absorptielezing in van uw spectrofotometer
- Voer uw gewenste monstergewicht in (de hoeveelheid eiwit die u wilt gebruiken in μg)
-
Selecteer het type standaardcurve:
- Standaard (standaard): gebruikt de typische BCA standaardcurveparameters
- Verbeterd: voor verbeterde gevoeligheidsprotocol
- Micro: voor microplaatprotocol
- Aangepast: stelt u in staat om uw eigen hellings- en interceptiewaarden in te voeren
-
Bekijk de resultaten:
- De calculator toont onmiddellijk het vereiste monstervolume in microliters
- Resultaten worden ook gepresenteerd in een samenvattingstabel voor gemakkelijke referentie
- Voor meerdere monsters kunt u meer invoer toevoegen en resultaten vergelijken
-
Kopieer of exporteer resultaten:
- Gebruik de kopieerknop om resultaten over te brengen naar uw labnotitieboek of andere toepassingen
- Alle berekeningen kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik
Stap-voor-stap voorbeeld
Laten we een praktisch voorbeeld doornemen:
- U heeft een BCA-assay uitgevoerd en een absorptielezing van 0.75 verkregen voor uw eiwitmonster.
- U wilt 20 μg eiwit laden voor uw western blot.
- Met behulp van de standaardcurve (helling = 2.0, interceptie = 0):
- Eiwitconcentratie = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
- Vereist monstervolume = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL
Dit betekent dat u 13.33 μL van uw monster moet laden om 20 μg eiwit te verkrijgen.
Het begrijpen van de resultaten
De calculator biedt verschillende belangrijke informatie:
-
Eiwitconcentratie: Dit wordt berekend uit uw absorptielezing met behulp van de geselecteerde standaardcurve. Het vertegenwoordigt de hoeveelheid eiwit per eenheid volume in uw monster (μg/μL).
-
Monster Volume: Dit is het volume van uw monster dat de gewenste hoeveelheid eiwit bevat. Deze waarde is wat u zult gebruiken bij het voorbereiden van uw experimenten.
-
Waarschuwingen en Aanbevelingen: De calculator kan waarschuwingen geven voor:
- Zeer hoge absorptielezingen (>3.0) die mogelijk buiten het lineaire bereik van de assay liggen
- Zeer lage absorptielezingen (<0.1) die mogelijk dicht bij de detectielimiet liggen
- Berekende volumes die onpraktisch groot (>1000 μL) of klein (<1 μL) zijn
Toepassingen en gebruiksgevallen
Voorbereiding van western blotmonsters
Een van de meest voorkomende toepassingen voor deze calculator is het voorbereiden van monsters voor western blotting. Consistente eiwitbelasting is cruciaal voor betrouwbare western blotresultaten, en deze calculator zorgt ervoor dat u dezelfde hoeveelheid eiwit voor elk monster laadt, zelfs wanneer hun concentraties verschillen.
Voorbeeldworkflow:
- Voer BCA-assay uit op al uw eiwitmonsters
- Bepaal een consistente eiwithoeveelheid om te laden (typisch 10-50 μg)
- Gebruik de calculator om het volume te bepalen dat voor elk monster nodig is
- Voeg de juiste volumes monsterbuffer en reducerend middel toe
- Laad de berekende volumes op uw gel
Enzymatische assays
Voor enzymatische assays is het vaak noodzakelijk om een specifieke hoeveelheid eiwit te gebruiken om de reactieve omstandigheden tussen verschillende monsters of experimenten te standaardiseren.
Voorbeeldworkflow:
- Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van BCA-assay
- Bereken het volume dat nodig is om uw gewenste eiwithoeveelheid te verkrijgen
- Voeg dit volume toe aan uw reactiemengsel
- Ga verder met uw enzymatische assay
Immunoprecipitatie-experimenten
In immunoprecipitatie-experimenten is het belangrijk om te beginnen met een consistente hoeveelheid eiwit om resultaten tussen verschillende omstandigheden te vergelijken.
Voorbeeldworkflow:
- Meet de eiwitconcentratie van cel- of weefsellysaten met behulp van BCA-assay
- Bereken volumes die nodig zijn om gelijke eiwithoeveelheden te verkrijgen (typisch 500-1000 μg)
- Pas alle monsters aan tot hetzelfde volume met lysaatbuffer
- Ga verder met antilichaamincubatie en precipitatie
Eiwitzuivering
Tijdens eiwitzuivering is het vaak noodzakelijk om de eiwitconcentratie en totale eiwithoeveelheden bij verschillende stappen bij te houden.
Voorbeeldworkflow:
- Verzamel fracties tijdens zuivering
- Voer BCA-assay uit op geselecteerde fracties
- Bereken eiwitconcentratie en totale eiwithoeveelheid
- Bepaal volumes die nodig zijn voor volgende toepassingen
Geavanceerde functies en overwegingen
Aangepaste standaardcurves
Hoewel de calculator standaardparameters voor standaard BCA-assays biedt, kunt u ook aangepaste waarden invoeren als u uw eigen standaardcurve hebt gegenereerd. Dit is bijzonder nuttig wanneer:
- U werkt met niet-standaard eiwitmonsters
- U gewijzigde BCA-protocollen gebruikt
- U werkt in de aanwezigheid van stoffen die de assay kunnen verstoren
Om een aangepaste standaardcurve te gebruiken:
- Selecteer "Aangepast" in de standaardcurve-opties
- Voer uw hellings- en interceptiewaarden in
- De calculator gebruikt deze waarden voor alle volgende berekeningen
Omgaan met meerdere monsters
De calculator stelt u in staat om meerdere monsters toe te voegen en hun volumes gelijktijdig te berekenen. Dit is vooral nuttig wanneer u monsters voorbereidt voor experimenten die consistente eiwitbelasting over meerdere omstandigheden vereisen.
Voordelen van batchverwerking:
- Bespaar tijd door alle volumes tegelijk te berekenen
- Zorg voor consistentie tussen al uw monsters
- Vergelijk eiwitconcentraties tussen monsters gemakkelijk
- Identificeer uitschieters of potentiële meetfouten
Omgaan met randgevallen
Zeer hoge absorptielezingen
Als uw absorptielezing boven de 2.0 ligt, kan deze buiten het lineaire bereik van de BCA-assay liggen. In dergelijke gevallen:
- Verdun uw monster en herhaal de BCA-assay
- Gebruik alternatieve methoden voor eiwitkwantificatie
- Pas de standaardcurve aan om hogere concentratiestandaarden op te nemen
Zeer lage absorptielezingen
Voor absorptielezingen onder de 0.1, kunt u dicht bij de detectielimiet van de assay zijn, wat de nauwkeurigheid kan beïnvloeden. Overweeg:
- Indien mogelijk uw monster te concentreren
- Een gevoeligere eiwitkwantificatiemethode te gebruiken
- Uw experimentele ontwerp aan te passen om lagere eiwithoeveelheden te accommoderen
Onpraktisch grote berekende volumes
Als de calculator een volume suggereert dat te groot is voor uw toepassing:
- Overweeg uw eiwitmonster te concentreren
- Pas uw gewenste eiwithoeveelheid naar beneden aan als uw experiment dat toelaat
- Gebruik het maximaal praktische volume en noteer de werkelijke hoeveelheid eiwit die is gebruikt
Geschiedenis van eiwitkwantificatie en BCA-assay
De nauwkeurige kwantificatie van eiwitten is een fundamentele vereiste in biochemie en moleculaire biologie sinds deze velden zijn ontstaan. Vroege methoden waren gebaseerd op de bepaling van het stikstofgehalte, wat tijdrovend was en gespecialiseerde apparatuur vereiste.
Evolutie van eiwitkwantificatiemethoden
-
Kjeldahl Methode (1883): Een van de vroegste methoden voor eiwitkwantificatie, gebaseerd op het meten van stikstofgehalte.
-
Biuret Test (Begin 1900): Deze methode is gebaseerd op de reactie tussen peptidebindingen en koperionen in een alkalische oplossing, wat een violetkleurige kleur produceert.
-
Lowry Assay (1951): Ontwikkeld door Oliver Lowry, deze methode combineerde de Biuret-reactie met het Folin-Ciocalteu-reagens, wat de gevoeligheid verhoogde.
-
Bradford Assay (1976): Marion Bradford ontwikkelde deze methode met behulp van Coomassie Brilliant Blue G-250-dye, die aan eiwitten bindt en de absorptiemaximum verschuift.
-
BCA Assay (1985): Ontwikkeld door Paul Smith en collega's van Pierce Chemical Company, deze methode combineerde de biuretreactie met BCA-detectie, wat verbeterde gevoeligheid en compatibiliteit met detergenten bood.
Ontwikkeling van de BCA-assay
De BCA-assay werd voor het eerst beschreven in een artikel uit 1985 door Smith et al. getiteld "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Het werd ontwikkeld om de beperkingen van bestaande methoden aan te pakken, vooral de interferentie van verschillende chemicaliën die vaak worden gebruikt in eiwitextractie en -zuivering.
De belangrijkste innovatie was het gebruik van bicinchoninezuur om de Cu¹⁺-ionen te detecteren die worden geproduceerd door eiwitgemedieerde reductie van Cu²⁺, wat een paarse gekleurde complex vormt dat spectrofotometrisch kan worden gemeten. Dit bood verschillende voordelen:
- Hogere gevoeligheid dan de Biuret-methode
- Minder gevoelig voor interferentie van niet-eiwitstoffen in vergelijking met de Lowry-methode
- Betere compatibiliteit met detergenten dan de Bradford-assay
- Eenvoudiger protocol met minder reagentia en stappen
Sinds de introductie is de BCA-assay een van de meest gebruikte methoden voor eiwitkwantificatie in biochemie- en moleculaire biologie-laboratoria over de hele wereld geworden.
Codevoorbeelden voor het berekenen van monstervolume
Excel-formule
1=IF(B2<=0,"Fout: Ongeldige absorptie",IF(C2<=0,"Fout: Ongeldig monstergewicht",C2/(2*B2)))
2
3' Waar:
4' B2 bevat de absorptielezing
5' C2 bevat het gewenste monstergewicht in μg
6' De formule retourneert het vereiste monstervolume in μL
7Python-implementatie
1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Bereken eiwitconcentratie uit absorptie met behulp van standaardcurve."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorptie kan niet negatief zijn")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Bereken vereist monstervolume op basis van absorptie en gewenste massa."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Monstergewicht moet positief zijn")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Voorbeeldgebruik
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Voor absorptie {absorbance} en gewenste eiwitmassa {sample_mass} μg:")
31 print(f"Eiwitconcentratie: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vereist monstervolume: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Fout: {e}")
35R-code voor analyse
1# Functie om eiwitconcentratie uit absorptie te berekenen
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorptie kan niet negatief zijn")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Functie om monstervolume te berekenen
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Monstergewicht moet positief zijn")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Voorbeeldgebruik
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Voor absorptie %.2f en gewenste eiwitmassa %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Eiwitconcentratie: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vereist monstervolume: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Fout: %s\n", e$message))
39})
40JavaScript-implementatie
1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorptie kan niet negatief zijn");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Monstergewicht moet positief zijn");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Voorbeeldgebruik
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Voor absorptie ${absorbance} en gewenste eiwitmassa ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Eiwitconcentratie: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vereist monstervolume: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Fout: ${error.message}`);
37}
38Standaardcurvevisualisatie
De relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie is doorgaans lineair binnen een bepaald bereik. Hieronder staat een visualisatie van een standaard BCA-curve:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Vergelijking met andere eiwitkwantificatiemethoden
Verschillende eiwitkwantificatiemethoden hebben verschillende voordelen en beperkingen. Hier is hoe de BCA-assay zich verhoudt tot andere veelgebruikte methoden:
| Methode | Gevoeligheidsbereik | Voordelen | Beperkingen | Het beste voor |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Compatibel met detergenten • Minder eiwit-tot-eiwitvariatie • Stabiele kleurontwikkeling | • Gehinderd door reducerende middelen • Beïnvloed door sommige chelerende middelen | • Algemene eiwitkwantificatie • Monsters die detergenten bevatten |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Snel (2-5 min) • Weinig interfererende stoffen | • Hoge eiwit-tot-eiwitvariatie • Incompatibel met detergenten | • Snelle metingen • Detergent-vrije monsters |
| Lowry Methode | 1-1500 μg/mL | • Goed gevestigde methode • Goede gevoeligheid | • Veel interfererende stoffen • Meerdere stappen | • Historische consistentie • Pure eiwitmonsters |
| UV Absorptie (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Niet-destructief • Zeer snel • Geen reagentia nodig | • Beïnvloed door nucleïnezuren • Vereist pure monsters | • Pure eiwitoplossingen • Snelle controles tijdens zuivering |
| Fluorometrisch | 0.1-500 μg/mL | • Hoogste gevoeligheid • Brede dynamische range | • Duur reagentia • Vereist fluorometer | • Zeer verdunde monsters • Beperkt monstervolume |
Veelgestelde vragen
Waarvoor wordt de BCA-assay gebruikt?
De BCA (bicinchoninezuur) assay wordt voornamelijk gebruikt voor het kwantificeren van de totale eiwitconcentratie in een monster. Het wordt veel gebruikt in biochemie, cellulaire biologie en moleculaire biologie voor toepassingen zoals western blotting, enzymassays, immunoprecipitatie en eiwitzuivering.
Hoe nauwkeurig is de BCA-assay?
De BCA-assay is over het algemeen nauwkeurig binnen 5-10% wanneer deze correct wordt uitgevoerd. De nauwkeurigheid hangt af van verschillende factoren, waaronder de kwaliteit van de standaardcurve, de afwezigheid van interfererende stoffen en of de samenstelling van het onbekende eiwit vergelijkbaar is met het standaard eiwit dat wordt gebruikt.
Wat kan de resultaten van de BCA-assay beïnvloeden?
Verschillende stoffen kunnen de resultaten van de BCA-assay beïnvloeden, waaronder:
- Reducerende middelen (DTT, β-mercapto-ethanol, glutathion)
- Chelaterende middelen (EDTA, EGTA)
- Hoge concentraties eenvoudige suikers
- Lipiden
- Sommige detergenten bij hoge concentraties
- Ammoniakverbindingen
Wat is het verschil tussen BCA- en Bradford-assays?
De belangrijkste verschillen zijn:
- BCA-assay is meer compatibel met detergenten en oppervlakteactieve stoffen
- Bradford-assay is sneller (2-5 minuten vs. 30+ minuten voor BCA)
- BCA heeft minder eiwit-tot-eiwitvariatie
- Bradford is gevoeliger voor basische aminozuren
- BCA wordt beïnvloed door reducerende middelen, terwijl Bradford dat niet doet
Waarom is mijn berekende monstervolume te groot?
Als uw calculator een zeer groot monstervolume toont, geeft dit meestal een lage eiwitconcentratie in uw monster aan. Dit kan het gevolg zijn van:
- Werkelijke lage eiwitinhoud in uw oorspronkelijke monster
- Eiwitverlies tijdens voorbereiding
- Fouten in de BCA-assayprocedure
- Onnauwkeurige absorptielezing
Overweeg uw monster te concentreren of uw experimentele ontwerp aan te passen om de lagere eiwitconcentratie te accommoderen.
Kan ik deze calculator gebruiken voor andere eiwitkwantificatiemethoden?
Deze calculator is specifiek ontworpen voor BCA-assayresultaten. Hoewel het basisprincipe (omzetten van concentratie naar volume) ook van toepassing is op andere methoden, varieert de relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie tussen verschillende assays. Voor andere methoden zoals Bradford of Lowry moet u verschillende standaardcurveparameters gebruiken.
Hoe ga ik om met monsters met absorptie buiten het lineaire bereik?
Voor absorptielezingen buiten het lineaire bereik (typisch >2.0):
- Verdun uw monster en herhaal de BCA-assay
- Gebruik een andere eiwitkwantificatiemethode
- Pas de standaardcurve aan om hogere concentratiestandaarden op te nemen
Welk eiwit moet ik als standaard gebruiken?
Boviene serumalbumine (BSA) is het meest gebruikte standaard voor BCA-assays omdat het:
- Gemakkelijk verkrijgbaar en goedkoop is
- Hoog oplosbaar is
- Stabiel in oplossing is
- Goed gekarakteriseerd is
Als uw monsters echter een overwegend eiwit bevatten dat aanzienlijk verschilt van BSA, overweeg dan om dat eiwit als uw standaard te gebruiken voor nauwkeurigere resultaten.
Hoe lang is de BCA-reactie stabiel?
De paarse kleur die in de BCA-reactie wordt ontwikkeld, is enkele uren bij kamertemperatuur stabiel en kan op elk moment binnen die periode worden gemeten. Voor de beste resultaten wordt echter aanbevolen om alle standaarden en monsters op ongeveer hetzelfde moment na kleurontwikkeling te meten.
Kan ik de standaardcurve van een vorig experiment hergebruiken?
Hoewel het technisch mogelijk is om een standaardcurve te hergebruiken, wordt het niet aanbevolen voor nauwkeurige kwantificatie. Variaties in reagentia, incubatieomstandigheden en instrumentkalibratie kunnen de relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie beïnvloeden. Voor betrouwbare resultaten, genereer elke keer dat u de assay uitvoert een nieuwe standaardcurve.
Referenties
-
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
-
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instructies. Beschikbaar op: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
-
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
-
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
-
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Probeer vandaag onze BCA Absorbent Monster Volume Calculator!
Nu u de principes achter BCA-eiwitkwantificatie en monstervolume berekening begrijpt, probeer onze calculator om uw laboratoriumworkflow te stroomlijnen. Voer eenvoudig uw absorptielezingen en gewenste monstergewicht in om directe, nauwkeurige monstervolume berekeningen te krijgen.
Of u nu monsters voorbereidt voor western blotting, enzymatische assays of andere eiwitgebaseerde experimenten, onze calculator helpt ervoor te zorgen dat u consistente en betrouwbare resultaten krijgt. Bespaar tijd, verminder fouten en verbeter de reproduceerbaarheid van uw experimenten met de BCA Absorbent Monster Volume Calculator.
Gerelateerde Tools
Ontdek meer tools die handig kunnen zijn voor uw workflow