Kalkulátor ředění buněk - Přesný laboratorní nástroj pro ředění

Kalkulačka ředění buněk

Kalkulačka ředění buněk určuje, jaké množství buněčné suspenze a jaké množství ředidla je třeba smíchat, aby bylo v požadovaném konečném objemu dosaženo cílové koncentrace buněk. Používá se v buněčných kulturách, mikrobiologii a další laboratorní práci, kde je třeba vzorek před použitím upravit na přesnou koncentraci.

Co znamená ředění buněk

Ředěním buněčné suspenze se nemění počet buněk, které obsahuje. Mění se pouze objem kapaliny, v níž jsou buňky, takže klesá jejich koncentrace. Suspenze s koncentrací 1 000 000 buněk na mililitr (buněk/ml) obsahuje po naředění stále stejný celkový počet buněk. Tento počet je pouze rozptýlen ve větším objemu kapaliny.

V laboratořích se buňky ředí před mnoha běžnými kroky: při rozdělení rostoucí kultury do nových baněk, při nanesení pevného počtu buněk do každé jamky destičky, při zmrazení buněk pro skladování nebo při přípravě vzorku pro počítač buněk či průtokový cytometr.

Vzorec pro ředění buněk

Výpočet vychází z jednoho pravidla. Počet buněk odebraných ze zásobní suspenze vynásobený její koncentrací se musí rovnat počtu buněk v konečném objemu vynásobenému cílovou koncentrací:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — výchozí (zásobní) koncentrace v buňkách/ml
• V₁ — objem použité zásobní suspenze v ml
• C₂ — cílová koncentrace v buňkách/ml
• V₂ — požadovaný celkový konečný objem v ml

Vyřešením rovnice pro V₁ získáme objem zásobní suspenze, který je třeba odpipetovat:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Zbytek výsledného objemu tvoří ředidlo, obvykle médium pro buněčné kultury, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) nebo jiný pufr:

Objem ředidla = V₂ − V₁

Cílová koncentrace (C₂) nikdy nemůže být vyšší než zásobní koncentrace (C₁). Ředění koncentraci pouze snižuje. Její zvýšení vyžaduje centrifugaci buněk a jejich resuspendování v menším objemu kapaliny.

Jak vypočítat ředění buněk

1. Spočítejte zásobní suspenzi pomocí hemocytometru nebo automatického počítače buněk a zjistěte C₁.
2. Zapište cílovou koncentraci C₂ požadovanou protokolem.
3. Určete požadovaný celkový konečný objem V₂.
4. Vypočítejte V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Vypočítejte objem ředidla jako V₂ − V₁.
6. Odpipetujte V₁ zásobní suspenze do zkumavky a poté přidejte odpovídající objem média nebo pufru.

Příklad výpočtu

Zásobní suspenze má koncentraci 1 000 000 buněk/ml. Protokol vyžaduje 100 000 buněk/ml v konečném objemu 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Objem ředidla = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Přidáním 1 mL zásobní suspenze k 9 mL média vznikne 10 mL suspenze s koncentrací 100 000 buněk/ml.

Druhý příklad

Test v destičce s 96 jamkami vyžaduje 10 000 buněk na jamku v 200 mikrolitrech (μL) média na jamku. To odpovídá cílové koncentraci 50 000 buněk/ml, protože 10 000 buněk děleno 0,2 mL se rovná 50 000 buněk/ml. Zásobní suspenze má koncentraci 2 000 000 buněk/ml a pro pokrytí celé destičky s určitou rezervou kvůli ztrátám při pipetování je potřeba celkem 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Objem ředidla = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Smícháním 0,5 mL zásobní suspenze s 19,5 mL média vznikne 20 mL suspenze s koncentrací 50 000 buněk/ml, tedy ředění 1 ku 40.

Zdroje chyb

Samotný vzorec je přesný. Chyby vznikají v číslech, která se do něj dosadí.

• Chyba při počítání. Nesprávný počet buněk se přímo promítne do nesprávného ředění. Toto riziko snižuje spočítání všech čtyř rohových čtverců mřížky hemocytometru a výpočet jejich průměru.
• Shluky buněk. Shluk buněk vypadá pod mikroskopem jako jedna buňka, ve skutečnosti jich však obsahuje několik, a proto snižuje zdánlivou koncentraci.
• Rozsah pipety. Pipeta používaná mimo svůj stanovený objemový rozsah poskytuje nepřesné výsledky. Pipeta o objemu 1000 μL nastavená k dávkování 5 μL není spolehlivá; místo ní je třeba použít menší pipetu.
• Záměna jednotek. Smíchání jednotek buněk/ml a buněk/μl způsobí chybu tisíckrát větší nebo menší.
• Mrtvé buňky. Celkový počet buněk zahrnuje mrtvé buňky, pokud nebylo použito barvení pro stanovení viability, například trypanová modř. Počet skutečně přítomných živých buněk tak může být nadhodnocen.

Omezení této kalkulačky

Kalkulačka odmítá čísla, z nichž nelze získat smysluplný výsledek:

• Každá hodnota musí být větší než nula.
• Cílová koncentrace nemůže být vyšší než výchozí koncentrace.
• Výchozí koncentrace musí být nejvýše 1 bilion buněk/ml (1 × 10¹²).
• Vypočtený objem zásobní suspenze musí být alespoň 0,001 mL, což je 1 mikrolitr. Menší objem nelze přesně odpipetovat, takže kalkulačka vyžaduje jiná čísla. Tento problém obvykle vyřeší zvětšení celkového objemu.

Objemy se zobrazují na dvě desetinná místa, nebo na tři, pokud je objem zásobní suspenze menší než 0,01 mL, takže se malý objem nikdy nezobrazí jako 0,00 mL.

Často kladené otázky

Jaký je vzorec pro ředění buněk?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, kde C₁ a C₂ jsou výchozí a cílová koncentrace a V₁ a V₂ jsou objem odebraný ze zásobní suspenze a celkový konečný objem.

Může být cílová koncentrace vyšší než výchozí koncentrace?

Ne. Ředění koncentraci pouze snižuje. Dosažení vyšší koncentrace vyžaduje centrifugaci buněk a jejich resuspendování v menším objemu.

Jakou kapalinu použít k ředění buněk?

Kompletní kultivační médium se používá, když musí buňky zůstat zdravé po dobu hodin nebo dnů, například před nasazením do destičky. PBS nebo podobný pufrovaný fyziologický roztok je vhodný pro krátká ředění, kratší než přibližně 30 minut, před dalším zpracováním buněk. Médium bez séra se používá tehdy, když by sérové bílkoviny narušovaly následný test.

Funguje tento vzorec i pro bakterie nebo kvasinky?

Ano. C₁V₁ = C₂V₂ platí pro jakoukoli suspenzi částic, včetně bakterií měřených v jednotkách tvořících kolonie na mililitr (CFU/ml), kvasinek a virových částic měřených v plakotvorných jednotkách na mililitr (PFU/ml), pokud jsou na obou stranách rovnice použity stejné jednotky.

Mají se při ředění započítávat mrtvé buňky?

Při nasazování živé kultury se mají započítávat pouze životaschopné buňky. Pokud je suspenze z 80 % životaschopná, její životaschopná koncentrace je 0,8 násobkem celkového počtu buněk a tato koncentrace se má použít jako C₁.

Jak přesně připravit velmi vysoká ředění?

Vysoká ředění, například 1 ku 1000, se obvykle připravují jako série menších kroků označovaných jako sériová ředění. Tři po sobě následující ředění 1 ku 10 vytvoří celkové ředění 1 ku 1000 a současně udrží každý krok pipetování v přesném objemovém rozsahu.