حاسبة تركيز الحمض النووي

المقدمة

تُعد حاسبة تركيز الحمض النووي أداة أساسية لعلماء البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة وفنيي المختبرات الذين يحتاجون إلى تحديد تركيز الحمض النووي بدقة في عيناتهم. يعد قياس تركيز الحمض النووي إجراءً أساسيًا في مختبرات البيولوجيا الجزيئية، حيث يعمل كخطوة حيوية لمراقبة الجودة قبل المضي قدمًا في التطبيقات اللاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتسلسل والاستنساخ وغيرها من التقنيات الجزيئية. تستخدم هذه الحاسبة مبادئ الطيف الضوئي لحساب تركيز الحمض النووي بناءً على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر (A260)، مع تطبيق عامل التحويل القياسي وأخذ أي تخفيف للعينة الأصلية في الاعتبار.

تُبسط حاسبتنا سهلة الاستخدام عملية تحديد كل من التركيز (نانوغرام/ميكرولتر) والكمية الإجمالية من الحمض النووي في عينتك، مما يلغي الحاجة إلى الحسابات اليدوية ويقلل من خطر الأخطاء الرياضية. سواء كنت تقوم بإعداد عينات للتسلسل من الجيل التالي، أو تحديد كميات تحضيرات البلازميد، أو تقييم غلة استخراج الحمض النووي الجينومي، توفر هذه الأداة نتائج سريعة وموثوقة لدعم أبحاثك وسير العمل التشخيصي.

كيفية حساب تركيز الحمض النووي

المبدأ الأساسي

يعتمد حساب تركيز الحمض النووي على قانون بير-لامبرت، الذي ينص على أن امتصاص محلول ما يتناسب طرديًا مع تركيز الأنواع الممتصة في المحلول وطول مسار الضوء عبر المحلول. بالنسبة للحمض النووي مزدوج الشريطة، يتوافق امتصاص قدره 1.0 عند 260 نانومتر (A260) في قنينة بطول 1 سم مع تركيز يقارب 50 نانوغرام/ميكرولتر.

المعادلة

يتم حساب تركيز الحمض النووي باستخدام المعادلة التالية:

$\text{تركيز الحمض النووي (نانوغرام/ميكرولتر)} = A_{260} \times 50 \times \text{عامل التخفيف}$

حيث:

• A260 هو قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر
• 50 هو عامل التحويل القياسي للحمض النووي مزدوج الشريطة (50 نانوغرام/ميكرولتر لـ A260 = 1.0)
• عامل التخفيف هو العامل الذي تم تخفيف العينة الأصلية من أجله للقياس

يمكن بعد ذلك حساب الكمية الإجمالية من الحمض النووي في العينة باستخدام:

$\text{إجمالي الحمض النووي (ميكروغرام)} = \frac{\text{التركيز (نانوغرام/ميكرولتر)} \times \text{الحجم (ميكرولتر)}}{1000}$

فهم المتغيرات

1. الامتصاص عند 260 نانومتر (A260):

   • هذه هي قياس مدى امتصاص الضوء فوق البنفسجي عند طول موجة 260 نانومتر بواسطة عينة الحمض النووي
   • تمتص النيوكليوتيدات في الحمض النووي (خاصة القواعد النيتروجينية) الضوء فوق البنفسجي مع ذروة امتصاص عند 260 نانومتر
   • كلما زاد الامتصاص، زادت كمية الحمض النووي الموجودة في المحلول

2. عامل التحويل (50):

   • عامل التحويل القياسي البالغ 50 نانوغرام/ميكرولتر هو خاص بالحمض النووي مزدوج الشريطة
   • بالنسبة للحمض النووي أحادي الشريطة، فإن العامل هو 33 نانوغرام/ميكرولتر
   • بالنسبة للحمض النووي الريبي، فإن العامل هو 40 نانوغرام/ميكرولتر
   • بالنسبة للأوليغونوكليوتيدات، يختلف العامل بناءً على التسلسل

3. عامل التخفيف:

   • إذا تم تخفيف العينة قبل القياس (على سبيل المثال، 1 جزء من العينة إلى 9 أجزاء من المحلول = عامل تخفيف 10)
   • يُحسب كالتالي: (حجم العينة + حجم المذيب) ÷ حجم العينة
   • يُستخدم لتحديد التركيز في العينة الأصلية غير المخففة

4. الحجم:

   • الحجم الكلي لمحلول الحمض النووي الخاص بك بالميكرولترات (ميكرولتر)
   • يُستخدم لحساب الكمية الإجمالية من الحمض النووي في العينة

كيفية استخدام هذه الحاسبة

اتبع هذه الخطوات لتحديد تركيز الحمض النووي بدقة:

1. تحضير عينتك:

   • تأكد من أن عينة الحمض النووي الخاصة بك مذابة ومختلطة بشكل صحيح
   • إذا كان التركيز المتوقع مرتفعًا، قم بإعداد تخفيف لضمان أن القراءة تقع ضمن النطاق الخطي (عادةً A260 بين 0.1 و 1.0)

2. قياس الامتصاص:

   • استخدم مطياف ضوئي أو جهاز نانو دروب لقياس الامتصاص عند 260 نانومتر
   • قم أيضًا بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر لتقييم النقاء (نسبة A260/A280)
   • استخدم نفس المذيب المستخدم في إذابة/تخفيف الحمض النووي كمرجع فارغ

3. أدخل القيم في الحاسبة:

   • أدخل قيمة A260 المقاسة في حقل "الامتصاص عند 260 نانومتر"
   • أدخل الحجم الكلي لمحلول الحمض النووي الخاص بك بالميكرولترات
   • أدخل عامل التخفيف (استخدم 1 إذا لم يتم إجراء تخفيف)

4. تفسير النتائج:

   • ستعرض الحاسبة تركيز الحمض النووي بوحدات نانوغرام/ميكرولتر
   • سيتم عرض إجمالي كمية الحمض النووي في العينة بوحدات ميكروغرام
   • استخدم هذه القيم لتحديد الحجم المناسب المطلوب للتطبيقات اللاحقة

5. تقييم نقاء الحمض النووي (إذا تم قياس A280):

   • نسبة A260/A280 تبلغ حوالي 1.8 تشير إلى حمض نووي نقي
   • النسب الأقل قد تشير إلى تلوث بالبروتين
   • النسب الأعلى قد تشير إلى تلوث بالحمض النووي الريبي

حالات الاستخدام

يعد قياس تركيز الحمض النووي أمرًا حيويًا في العديد من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية:

الاستنساخ الجزيئي

قبل ربط قطع الحمض النووي في المتجهات، يسمح معرفة التركيز الدقيق للباحثين بحساب نسبة الإدخال إلى المتجه المثلى، مما يزيد من كفاءة التحول. على سبيل المثال، غالبًا ما يوفر نسبة 3:1 من الإدخال إلى المتجه أفضل النتائج، مما يتطلب قياسات دقيقة لتركيز كلا المكونين.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و qPCR

تتطلب تفاعلات PCR عادةً 1-10 نانوغرام من الحمض النووي القالب لتحقيق تضخيم مثالي. قد تؤدي كميات قليلة جدًا من الحمض النووي إلى فشل في التضخيم، بينما يمكن أن يؤدي الكثير إلى تثبيط التفاعل. بالنسبة لتفاعل PCR الكمي (qPCR)، تكون الحاجة إلى قياس تركيز الحمض النووي بدقة أكبر لضمان دقة المنحنيات القياسية وموثوقية القياس.

تسلسل الجيل التالي (NGS)

تحدد بروتوكولات إعداد مكتبات NGS كميات إدخال الحمض النووي الدقيقة، وغالبًا ما تتراوح بين 1-500 نانوغرام حسب النظام الأساسي والتطبيق. يعد قياس التركيز الدقيق أمرًا أساسيًا لنجاح إعداد المكتبة وتمثيل العينات بشكل متوازن في عمليات التسلسل المتعددة.

تجارب النقل

عند إدخال الحمض النووي في خلايا حقيقية النواة، تختلف الكمية المثلى من الحمض النووي حسب نوع الخلية وطريقة النقل. عادةً ما يتم استخدام 0.5-5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي لكل بئر في تنسيق 6 آبار، مما يتطلب قياس تركيز دقيق لتوحيد التجارب.

تحليل الحمض النووي الجنائي

في التطبيقات الجنائية، غالبًا ما تكون عينات الحمض النووي محدودة وثمينة. يسمح القياس الدقيق للكمية للعلماء الجنائيين بتحديد ما إذا كانت كمية الحمض النووي كافية للتوصيف وتوحيد كمية الحمض النووي المستخدمة في التحليلات اللاحقة.

هضم إنزيمات التقييد

تمتلك إنزيمات التقييد وحدات نشاط محددة تُعرف لكل ميكروغرام من الحمض النووي. يسمح معرفة التركيز الدقيق للحمض النووي بتحقيق النسب الصحيحة من الإنزيم إلى الحمض النووي، مما يضمن هضمًا كاملاً دون نشاط غير محدد (قطع غير محدد).

بدائل قياس التركيز الطيفي

بينما يُعد قياس الطيف الضوئي فوق البنفسجي الطريقة الأكثر شيوعًا لتقدير تركيز الحمض النووي، توجد العديد من البدائل:

1. طرق الفلورية:

   • ترتبط الأصباغ الفلورية مثل PicoGreen وQubit وSYBR Green بشكل خاص بالحمض النووي مزدوج الشريطة
   • أكثر حساسية من الطيف الضوئي (يمكن أن تكشف عن كميات صغيرة تصل إلى 25 بيكوغرام/مل)
   • أقل تأثرًا بالملوثات مثل البروتينات أو الحمض النووي الريبي أو النيوكليوتيدات الحرة
   • تتطلب جهاز قياس الفلورية ومواد كيميائية محددة

2. التحليل الكهربائي بالهلام الأجاروز:

   • يمكن تقدير الحمض النووي من خلال مقارنة شدة الشريط بمعايير ذات تركيز معروف
   • يوفر معلومات حول حجم الحمض النووي وسلامته في الوقت نفسه
   • أقل دقة من الطرق الطيفية أو الفلورية
   • يستغرق وقتًا طويلاً ولكنه مفيد للتأكيد البصري

3. تفاعل PCR في الوقت الحقيقي:

   • طريقة حساسة للغاية لتقدير تسلسلات الحمض النووي المحددة
   • يمكن أن تكشف عن تركيزات منخفضة جدًا (تصل إلى عدة نسخ)
   • تتطلب مواد كيميائية محددة ومعدات أكثر تعقيدًا
   • تُستخدم عندما تكون الحاجة إلى تقدير محدد للتسلسل ضرورية

4. PCR الرقمي:

   • تقدير مطلق بدون منحنيات قياسية
   • دقيق للغاية للأهداف ذات الوفرة المنخفضة
   • مكلف ويتطلب معدات متخصصة
   • يُستخدم للكشف عن الطفرات النادرة وتحليل عدد النسخ

تاريخ قياس تركيز الحمض النووي

تطورت القدرة على قياس تركيز الحمض النووي بدقة بشكل كبير بالتوازي مع التقدم في البيولوجيا الجزيئية:

الطرق المبكرة (1950-1960)

بعد اكتشاف هيكل الحمض النووي بواسطة واتسون وكريك في عام 1953، بدأ العلماء في تطوير طرق لعزل وتقدير الحمض النووي. اعتمدت الأساليب المبكرة على اختبارات لونية مثل تفاعل الديفينيل أمين، الذي أنتج لونًا أزرق عند تفاعله مع السكريات المنقوصة في الحمض النووي. كانت هذه الطرق حساسة نسبيًا وعرضة للتداخل.

عصر الطيف الضوئي (1970)

أصبح تطبيق الطيف الضوئي فوق البنفسجي على تقدير الأحماض النووية شائعًا في السبعينيات. اكتشف العلماء أن الحمض النووي يمتص الضوء فوق البنفسجي مع ذروة عند 260 نانومتر، وأن العلاقة بين الامتصاص والتركيز كانت خطية ضمن نطاق معين. تم تأسيس عامل التحويل البالغ 50 نانوغرام/ميكرولتر للحمض النووي مزدوج الشريطة عند A260 = 1.0 خلال هذه الفترة.

ثورة الفلورية (1980-1990)

أدى تطوير الأصباغ الفلورية المحددة للحمض النووي في الثمانينيات والتسعينيات إلى ثورة في تقدير الحمض النووي، خاصةً للعينات المخففة. مكنت أصباغ هوشت من الكشف عن كميات أكثر حساسية بكثير مما كان ممكنًا مع الطيف الضوئي. أصبحت هذه الطرق مهمة بشكل خاص مع ظهور PCR، الذي غالبًا ما يتطلب تقديرًا دقيقًا لكميات دقيقة من الحمض النووي.

العصر الحديث (2000-الحاضر)

أدى إدخال مطياف ضوئي صغير الحجم مثل نانو دروب في أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين إلى تحويل تقدير الحمض النووي الروتيني من خلال الحاجة فقط إلى 0.5-2 ميكرولتر من العينة. أزالت هذه التقنية الحاجة إلى التخفيفات والقناني، مما جعل العملية أسرع وأكثر ملاءمة.

اليوم، دفعت التقنيات المتقدمة مثل PCR الرقمي وتسلسل الجيل التالي حدود تقدير الحمض النووي إلى أبعد من ذلك، مما يسمح بالتقدير المطلق لتسلسلات محددة والكشف عن الجزيئات الفردية. ومع ذلك، فإن المبدأ الطيفي الضوئي الأساسي الذي تم تأسيسه قبل عقود لا يزال العمود الفقري لقياس تركيز الحمض النووي الروتيني في المختبرات في جميع أنحاء العالم.

أمثلة عملية

دعونا نستعرض بعض الأمثلة العملية لحساب تركيز الحمض النووي:

المثال 1: تحضير بلازميد قياسي

لدى باحث بلازميد منقى وحصل على القياسات التالية:

• قراءة A260: 0.75
• التخفيف: 1:10 (عامل التخفيف = 10)
• حجم محلول الحمض النووي: 50 ميكرولتر

الحساب:

• التركيز = 0.75 × 50 × 10 = 375 نانوغرام/ميكرولتر
• إجمالي الحمض النووي = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 ميكروغرام

المثال 2: استخراج الحمض النووي الجينومي

بعد استخراج الحمض النووي الجينومي من الدم:

• قراءة A260: 0.15
• لا يوجد تخفيف (عامل التخفيف = 1)
• حجم محلول الحمض النووي: 200 ميكرولتر

الحساب:

• التركيز = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 نانوغرام/ميكرولتر
• إجمالي الحمض النووي = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 ميكروغرام

المثال 3: إعداد الحمض النووي للتسلسل

يتطلب بروتوكول التسلسل بالضبط 500 نانوغرام من الحمض النووي:

• تركيز الحمض النووي: 125 نانوغرام/ميكرولتر
• الكمية المطلوبة: 500 نانوغرام

الحجم المطلوب = 500 ÷ 125 = 4 ميكرولتر من محلول الحمض النووي

أمثلة على التعليمات البرمجية

إليك أمثلة على كيفية حساب تركيز الحمض النووي في لغات برمجة مختلفة:

1' صيغة Excel لحساب تركيز الحمض النووي
2=A260*50*عامل_التخفيف
3
4' صيغة Excel لحساب إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
5=(A260*50*عامل_التخفيف*الحجم)/1000
6
7' مثال في خلية مع A260=0.5، عامل_التخفيف=2، الحجم=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' النتيجة: 5 ميكروغرام
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    حساب تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
4    
5    المعلمات:
6    absorbance (float): قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر
7    
8    الإرجاع:
9    float: تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
10    """
11    return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14    """
15    حساب إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
16    
17    المعلمات:
18    concentration (float): تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
19    volume_ul (float): حجم محلول الحمض النووي بالميكرولترات
20    
21    الإرجاع:
22    float: إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
23    """
24    return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# مثال على الاستخدام
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"تركيز الحمض النووي: {concentration:.2f} نانوغرام/ميكرولتر")
35print(f"إجمالي الحمض النووي: {total_dna:.2f} ميكروغرام")
36

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // إرجاع تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // إرجاع إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// مثال على الاستخدام
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`تركيز الحمض النووي: ${concentration.toFixed(2)} نانوغرام/ميكرولتر`);
20console.log(`إجمالي الحمض النووي: ${totalDNA.toFixed(2)} ميكروغرام`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * حساب تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
4     * 
5     * @param absorbance قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر
6     * @param dilutionFactor عامل التخفيف للعينة
7     * @return تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * حساب إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
15     * 
16     * @param concentration تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
17     * @param volumeUL حجم محلول الحمض النووي بالميكرولترات
18     * @return إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("تركيز الحمض النووي: %.2f نانوغرام/ميكرولتر%n", concentration);
33        System.out.printf("إجمالي الحمض النووي: %.2f ميكروغرام%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# دالة R لحساب تركيز الحمض النووي
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # إرجاع تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # إرجاع إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# مثال على الاستخدام
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("تركيز الحمض النووي: %.2f نانوغرام/ميكرولتر\n", concentration))
22cat(sprintf("إجمالي الحمض النووي: %.2f ميكروغرام\n", total_dna))
23

الأسئلة الشائعة

ما الفرق بين تركيز الحمض النووي ونقاء الحمض النووي؟

تركيز الحمض النووي يشير إلى كمية الحمض النووي الموجودة في محلول، عادةً ما تقاس بالنانوغرام/ميكرولتر أو ميكروغرام/مل. يخبرك بمدى كمية الحمض النووي لديك ولكنه لا يشير إلى جودته. نقاء الحمض النووي يقيم وجود الملوثات في عينة الحمض النووي الخاصة بك، وعادة ما يقاس بنسب الامتصاص مثل A260/A280 (لتلوث البروتين) وA260/A230 (لتلوث المركبات العضوية). عادةً ما يكون للحمض النووي النقي نسبة A260/A280 تبلغ حوالي 1.8 ونسبة A260/A230 تبلغ 2.0-2.2.

لماذا يختلف عامل التحويل بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات؟

تختلف عوامل التحويل لأن كل جزيء حيوي له معامل امتصاص فريد (قدرة على امتصاص الضوء) بسبب تركيباته الكيميائية المختلفة. يحتوي الحمض النووي مزدوج الشريطة على عامل تحويل يبلغ 50 نانوغرام/ميكرولتر عند A260=1.0، بينما يكون الحمض النووي أحادي الشريطة 33 نانوغرام/ميكرولتر، والحمض النووي الريبي 40 نانوغرام/ميكرولتر، وتختلف البروتينات (المقاسة عند 280 نانومتر) على نطاق واسع ولكنها تتوسط حوالي 1 ملغ/مل عند A280=1.0. تنشأ هذه الاختلافات من التركيب الكيميائي المتنوع للنيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية وخصائص الامتصاص الخاصة بها.

ما مدى دقة قياس تركيز الحمض النووي بالطيف الضوئي؟

يعد قياس تركيز الحمض النووي بالطيف الضوئي دقيقًا عمومًا ضمن النطاق الخطي (عادةً A260 بين 0.1 و1.0)، مع دقة تبلغ حوالي ±3-5%. ومع ذلك، تنخفض الدقة عند التركيزات المنخفضة جدًا (أقل من 5 نانوغرام/ميكرولتر) ويمكن أن تتأثر بالملوثات مثل البروتينات أو الحمض النووي الريبي أو النيوكليوتيدات الحرة أو بعض المحاليل. للحصول على قياسات دقيقة للغاية للعينات المخففة أو عند الحاجة إلى نقاء عالٍ، يُوصى باستخدام طرق الفلورية مثل Qubit أو PicoGreen، حيث إنها أكثر تحديدًا للحمض النووي مزدوج الشريطة.

كيف أفسر نسبة A260/A280؟

تشير نسبة A260/A280 إلى نقاء عينة الحمض النووي لديك بالنسبة لتلوث البروتين:

• تشير النسبة التي تبلغ حوالي 1.8 إلى "نقاء" الحمض النووي
• تشير النسب الأقل من 1.8 إلى تلوث بالبروتين
• تشير النسب الأعلى من 2.0 إلى تلوث بالحمض النووي الريبي
• يمكن أن تؤثر درجة الحموضة وقوة الأيونات في المحلول أيضًا على هذه النسبة

بينما تعتبر مفيدة كتحقق من الجودة، لا تضمن نسبة A260/A280 وجود حمض نووي وظيفي، حيث قد لا تؤثر الملوثات الأخرى أو تحلل الحمض النووي على هذه النسبة.

هل يمكنني قياس تركيز الحمض النووي في المحاليل الملونة؟

يمكن أن يكون قياس تركيز الحمض النووي في المحاليل الملونة باستخدام الطيف الضوئي تحديًا حيث قد تمتص اللون عند أو بالقرب من 260 نانومتر، مما يتداخل مع قياس الحمض النووي. في مثل هذه الحالات:

1. قم بإجراء مسح لطيف الموجات (220-320 نانومتر) للتحقق من الأنماط غير الطبيعية في الامتصاص
2. استخدم طريقة فلورية مثل Qubit، والتي تتأثر أقل بلون العينة
3. قم بتنقية الحمض النووي أكثر لإزالة المركبات الملونة
4. طبق تصحيحات رياضية إذا كانت طيف الامتصاص للمركب المتداخل معروفًا

ما الحد الأدنى من الحجم المطلوب لقياس تركيز الحمض النووي؟

يعتمد الحد الأدنى من الحجم على الجهاز المستخدم:

• تتطلب المطياف الضوئي التقليدية ذات القناني عادةً 50-100 ميكرولتر
• تحتاج المطياف الضوئي صغير الحجم مثل نانو دروب فقط إلى 0.5-2 ميكرولتر
• تتطلب الطرق الفلورية عادةً 1-20 ميكرولتر من العينة بالإضافة إلى حجم المادة الكيميائية
• تستخدم أجهزة قراءة الميكرو بلايت عادةً 100-200 ميكرولتر لكل بئر

لقد أحدثت المطياف الضوئي صغير الحجم ثورة في تقدير الحمض النووي من خلال السماح بقياسات للعينات الثمينة مع متطلبات حجم ضئيلة.

كيف أحسب عامل التخفيف؟

يتم حساب عامل التخفيف كالتالي:

$\text{عامل التخفيف} = \frac{\text{الحجم الكلي (العينة + المذيب)}}{\text{حجم العينة}}$

على سبيل المثال:

• إذا أضفت 1 ميكرولتر من الحمض النووي إلى 99 ميكرولتر من المذيب، فإن عامل التخفيف هو 100
• إذا أضفت 5 ميكرولتر من الحمض النووي إلى 45 ميكرولتر من المذيب، فإن عامل التخفيف هو 10
• إذا كنت تستخدم الحمض النووي غير المخفف، فإن عامل التخفيف هو 1

استخدم دائمًا نفس المذيب للتخفيف كما تم استخدامه لتفريغ المطياف الضوئي.

كيف يمكنني التحويل بين وحدات التركيز المختلفة؟

تحويلات وحدات تركيز الحمض النووي الشائعة:

• 1 نانوغرام/ميكرولتر = 1 ميكروغرام/مل
• 1 ميكروغرام/مل = 0.001 ملغ/مل
• 1 نانوغرام/ميكرولتر = 1000 بيكوغرام/ميكرولتر
• 1 ميكرو مول من قطعة الحمض النووي بطول 1000 زوج قاعدي ≈ 660 نانوغرام/ميكرولتر

لتحويل من تركيز الكتلة (نانوغرام/ميكرولتر) إلى التركيز المولي (نانو مول) لقطعة الحمض النووي:

$\text{التركيز (نانو مول)} = \frac{\text{التركيز (نانوغرام/ميكرولتر)} \times 10^6}{\text{طول الحمض النووي (زوج قاعدي)} \times 660}$

ما الذي يمكن أن يسبب قياسات غير دقيقة لتركيز الحمض النووي؟

يمكن أن تؤدي عدة عوامل إلى قياسات غير دقيقة لتركيز الحمض النووي:

1. التلوث: يمكن أن تؤثر البروتينات أو الفينول أو الغوانيدين أو مواد استخراج أخرى على الامتصاص
2. الفقاعات: يمكن أن تسبب فقاعات الهواء في مسار الضوء قراءات خاطئة
3. تحلل الحمض النووي: قد يكون للحمض النووي المجزأ خصائص امتصاص معدلة
4. التفريغ غير السليم: استخدام مذيب مختلف للتفريغ عن ذلك الذي تم إذابة الحمض النووي فيه
5. محلول غير متجانس: الحلول غير المختلطة بشكل كافٍ تعطي قراءات غير متسقة
6. معايرة الجهاز: يمكن أن تنتج المطياف الضوئي غير المعايرة أو المتسخة نتائج غير موثوقة
7. القياسات خارج النطاق الخطي: قد لا تكون القيم العالية جدًا أو المنخفضة جدًا دقيقة

هل يمكنني استخدام هذه الحاسبة لقياس تركيز الحمض النووي الريبي؟

بينما تم تحسين هذه الحاسبة للحمض النووي مزدوج الشريطة (باستخدام عامل التحويل 50 نانوغرام/ميكرولتر)، يمكنك تعديلها للحمض النووي الريبي عن طريق:

1. قياس A260 كالمعتاد
2. الضرب في 40 بدلاً من 50 (عامل التحويل الخاص بالحمض النووي الريبي)
3. تطبيق عامل التخفيف المناسب

ستكون المعادلة للحمض النووي الريبي كالتالي: $\text{تركيز الحمض النووي الريبي (نانوغرام/ميكرولتر)} = A_{260} \times 40 \times \text{عامل التخفيف}$

المراجع

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

استعد لحساب تركيز الحمض النووي الخاص بك؟ استخدم حاسبتنا أعلاه للحصول على نتائج دقيقة على الفور. ببساطة أدخل قراءة الامتصاص، والحجم، وعامل التخفيف لتحديد كل من التركيز والكمية الإجمالية من الحمض النووي في عينتك.