DNS koncentrācijas kalkulators

Ievads

DNS koncentrācijas kalkulators ir būtisks rīks molekulārajiem bioloģiem, ģenētiķiem un laboratorijas tehniķiem, kuriem nepieciešams precīzi noteikt DNS koncentrāciju savos paraugos. DNS koncentrācijas mērīšana ir pamatprocedūra molekulāro bioloģijas laboratorijās, kas kalpo kā kritiska kvalitātes kontroles pakāpe pirms turpmāku pielietojumu, piemēram, PCR, sekvencēšanas, klonēšanas un citu molekulāro tehniku, veikšanas. Šis kalkulators izmanto spektrofotometriskos principus, lai aprēķinātu DNS koncentrāciju, pamatojoties uz UV absorbciju 260nm (A260), pielietojot standarta pārvēršanas faktoru un ņemot vērā sākotnējā parauga atšķaidījumu.

Mūsu lietotājam draudzīgais kalkulators vienkāršo DNS koncentrācijas (ng/μL) un kopējā DNS daudzuma jūsu paraugā noteikšanas procesu, novēršot manuālu aprēķinu nepieciešamību un samazinot matemātisko kļūdu risku. Neatkarīgi no tā, vai jūs sagatavojat paraugus nākamās paaudzes sekvencēšanai, kvantificējat plazmīdu sagataves vai novērtējat genoma DNS ekstrakcijas ražību, šis rīks sniedz ātrus un uzticamus rezultātus, lai atbalstītu jūsu pētījumus un diagnostikas darba plūsmas.

Kā tiek aprēķināta DNS koncentrācija

Pamata princips

DNS koncentrācijas aprēķins balstās uz Bira-Lamberta likumu, kas nosaka, ka šķīduma absorbcija ir tieši proporcionāla absorbējošās vielas koncentrācijai šķīdumā un gaismas ceļa garumam caur šķīdumu. Dubultā ķēdes DNS gadījumā absorbcija 1.0 pie 260nm (A260) 1cm ceļa garuma kuvetē atbilst aptuveni 50 ng/μL koncentrācijai.

Formula

DNS koncentrācija tiek aprēķināta, izmantojot sekojošo formulu:

$\text{DNS koncentrācija (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Atšķaidījuma faktors}$

Kur:

• A260 ir absorbcijas rādījums pie 260nm
• 50 ir standarta pārvēršanas faktors dubultā ķēdes DNS (50 ng/μL pie A260 = 1.0)
• Atšķaidījuma faktors ir faktors, ar kuru sākotnējais paraugs tika atšķaidīts mērīšanai

Kopējā DNS daudzuma paraugā aprēķināšana var tikt veikta šādi:

$\text{Kopējā DNS (μg)} = \frac{\text{Kopējā koncentrācija (ng/μL)} \times \text{Tilpums (μL)}}{1000}$

Izpratne par mainīgajiem

1. Absorbcija pie 260nm (A260):

   • Tas ir mērījums, cik daudz UV gaismas pie 260nm viļņa garuma tiek absorbēts DNS paraugā
   • DNS nukleotīdi (īpaši slāpekļa bāzes) absorbē UV gaismu ar maksimumu pie 260nm
   • Jo augstāka absorbcija, jo vairāk DNS ir klāt šķīdumā

2. Pārvēršanas faktors (50):

   • Standarta pārvēršanas faktors 50 ng/μL ir specifisks dubultā ķēdes DNS
   • Vienkāršā ķēdes DNS gadījumā faktors ir 33 ng/μL
   • RNA gadījumā faktors ir 40 ng/μL
   • Oligonukleotīdu gadījumā faktors atšķiras atkarībā no secības

3. Atšķaidījuma faktors:

   • Ja paraugs tika atšķaidīts pirms mērīšanas (piemēram, 1 daļa parauga uz 9 daļām bufera = atšķaidījuma faktors 10)
   • Aprēķināts kā: (Parauga tilpums + Atšķaidītāja tilpums) ÷ Parauga tilpums
   • Izmanto, lai noteiktu koncentrāciju sākotnējā, neatšķaidītā paraugā

4. Tilpums:

   • Jūsu DNS šķīduma kopējais tilpums mikrolitros (μL)
   • Izmanto, lai aprēķinātu kopējo DNS daudzumu paraugā

Kā izmantot šo kalkulatoru

Izpildiet šos soļus, lai precīzi noteiktu savu DNS koncentrāciju:

1. Sagatavojiet savu paraugu:

   • Pārliecinieties, ka jūsu DNS paraugs ir pareizi izšķīdināts un sajaukts
   • Ja gaidāmā koncentrācija ir augsta, sagatavojiet atšķaidījumu, lai nodrošinātu, ka mērījums ir lineārā diapazonā (parasti A260 starp 0.1 un 1.0)

2. Mēriet absorbciju:

   • Izmantojiet spektrofotometru vai nanodrop ierīci, lai izmērītu absorbciju pie 260nm
   • Tāpat izmēriet absorbciju pie 280nm, lai novērtētu tīrību (A260/A280 attiecība)
   • Izmantojiet to pašu buferi, ko izmantojāt, lai izšķīdinātu/atšķaidītu savu DNS, kā tukšo atsauci

3. Ievadiet vērtības kalkulatorā:

   • Ievadiet izmērīto A260 vērtību laukā "Absorbcija pie 260nm"
   • Ievadiet jūsu DNS šķīduma kopējo tilpumu mikrolitros
   • Ievadiet atšķaidījuma faktoru (izmantojiet 1, ja atšķaidījums netika veikts)

4. Interpretējiet rezultātus:

   • Kalkulators parādīs DNS koncentrāciju ng/μL
   • Kopējā DNS daudzums paraugā tiks parādīts μg
   • Izmantojiet šīs vērtības, lai noteiktu nepieciešamo tilpumu turpmākām pielietojumprogrammām

5. Novērtējiet DNS tīrību (ja tika izmērīta A280):

   • A260/A280 attiecība ~1.8 norāda uz tīru DNS
   • Zemākas attiecības var liecināt par olbaltumvielu piesārņojumu
   • Augstākas attiecības var liecināt par RNA piesārņojumu

Lietošanas gadījumi

DNS koncentrācijas mērīšana ir būtiska daudzos molekulārās bioloģijas un biotehnoloģijas pielietojumos:

Molekulārā klonēšana

Pirms DNS fragmentu ligēšanas vektoros, precīza koncentrācijas noteikšana ļauj pētniekiem aprēķināt optimālo ievietošanas un vektora attiecību, maksimāli palielinot transformācijas efektivitāti. Piemēram, 3:1 molārā attiecība starp ievietojumu un vektoru bieži sniedz labākos rezultātus, kas prasa precīzus koncentrācijas mērījumus abu komponentu.

PCR un qPCR

PCR reakcijām parasti nepieciešami 1-10 ng parauga DNS optimālai amplifikācijai. Pārāk maz DNS var izraisīt amplifikācijas neveiksmi, savukārt pārāk daudz var kavēt reakciju. Kvantitatīvai PCR (qPCR) ir nepieciešama vēl precīzāka DNS kvantifikācija, lai nodrošinātu precīzus standarta līknes un uzticamu kvantifikāciju.

Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS)

NGS bibliotēku sagatavošanas protokoli nosaka precīzus DNS ievades apjomus, bieži diapazonā no 1-500 ng atkarībā no platformas un pielietojuma. Precīza koncentrācijas mērīšana ir būtiska veiksmīgas bibliotēku sagatavošanas un līdzsvarotas paraugu pārstāvniecības nodrošināšanai multiplexētas sekvencēšanas skrējienos.

Transfekcijas eksperimenti

Ieviešot DNS eikariotu šūnās, optimālais DNS daudzums atšķiras atkarībā no šūnu veida un transfekcijas metodes. Parasti tiek izmantoti 0.5-5 μg plazmīda DNS uz labi 6 labi plāksnē, kas prasa precīzu koncentrācijas mērījumu, lai standartizētu eksperimentus.

Forensiskā DNS analīze

Forensiskās lietojumprogrammās DNS paraugi bieži ir ierobežoti un dārgi. Precīza kvantifikācija ļauj forensiskajiem zinātniekiem noteikt, vai pietiekami daudz DNS ir klāt profilēšanai un standartizēt izmantoto DNS daudzumu turpmākajās analīzēs.

Restrikcijas enzīmu gremošana

Restrikcijas enzīmiem ir specifiski aktivitātes vienības, kas definētas uz μg DNS. Zinot precīzu DNS koncentrāciju, ir iespējams nodrošināt pareizas enzīmu un DNS attiecības, nodrošinot pilnīgu gremošanu bez zvaigžņu aktivitātes (nespecifiska griešana).

Alternatīvas spektrofotometriskai mērīšanai

Lai gan UV spektrofotometrija ir visizplatītākais DNS kvantifikācijas veids, pastāv vairākas alternatīvas:

1. Fluorometriskās metodes:

   • Fluorescējošas krāsas, piemēram, PicoGreen, Qubit un SYBR Green, specifiski saistās ar dubultā ķēdes DNS
   • Jūtīgākas nekā spektrofotometrija (var noteikt pat 25 pg/mL)
   • Mazāk ietekmētas no piesārņotājiem, piemēram, olbaltumvielām, RNA vai brīviem nukleotīdiem
   • Prasa fluorometru un specifiskus reaģentus

2. Agarozes gela elektroforēze:

   • DNS var kvantificēt, salīdzinot joslu intensitāti ar standarta zināmu koncentrāciju
   • Sniedz informāciju par DNS izmēru un integritāti vienlaikus
   • Mazāk precīza nekā spektrofotometriskās vai fluorometriskās metodes
   • Laika patērējoša, bet noderīga vizuālai apstiprināšanai

3. Reālā laika PCR:

   • Ļoti jutīga metode specifisku DNS sekvences kvantificēšanai
   • Var noteikt ārkārtīgi zemas koncentrācijas (līdz dažām kopijām)
   • Prasa specifiskus primerus un sarežģītāku aprīkojumu
   • Izmanto, kad nepieciešama secības specifiska kvantifikācija

4. Digitālā PCR:

   • Absolūta kvantifikācija bez standarta līknes
   • Ļoti precīza zemas abundances mērķiem
   • Dārga un prasa specializētu aprīkojumu
   • Izmanto retu mutāciju noteikšanai un kopiju skaita variācijas analīzei

DNS koncentrācijas mērīšanas vēsture

Spēja precīzi izmērīt DNS koncentrāciju ir ievērojami attīstījusies līdz ar molekulārās bioloģijas attīstību:

Agrīnas metodes (1950. - 1960. gadi)

Pēc DNS struktūras atklāšanas, ko veica Votsons un Kriks 1953. gadā, zinātnieki sāka izstrādāt metodes DNS izolēšanai un kvantifikācijai. Agrīnie pieejas balstījās uz krāsu reakcijām, piemēram, diphenylamine reakciju, kas radīja zilu krāsu, reaģējot ar deoksiribozi DNS. Šīs metodes bija salīdzinoši mazjutīgas un pakļautas traucējumiem.

Spektrofotometriskā ēra (1970. gadi)

UV spektrofotometrijas pielietojums nukleīnskābju kvantifikācijai kļuva izplatīts 1970. gados. Zinātnieki atklāja, ka DNS absorbē UV gaismu ar maksimumu pie 260nm un ka attiecība starp absorbciju un koncentrāciju ir lineāra noteiktā diapazonā. Pārvēršanas faktors 50 ng/μL dubultā ķēdes DNS pie A260 = 1.0 tika noteikts šajā periodā.

Fluorometriskā revolūcija (1980. - 1990. gadi)

DNS specifisku fluorescējošu krāsu izstrāde 1980. un 1990. gados revolucionizēja DNS kvantifikāciju, īpaši atšķaidītiem paraugiem. Hoechst krāsas un vēlāk PicoGreen ļāva noteikt daudz jūtīgāk nekā ar spektrofotometriju. Šīs metodes kļuva īpaši svarīgas PCR attīstības laikā, kur bieži bija nepieciešama precīza minūtu DNS daudzumu kvantifikācija.

Mūsdienu ēra (2000. gadi - pašreiz)

Mikrotilpuma spektrofotometru, piemēram, NanoDrop, ieviešana agrīnā 2000. gadā pārveidoja rutīnas DNS kvantifikāciju, prasa tikai 0.5-2 μL parauga. Šī tehnoloģija novērsa nepieciešamību pēc atšķaidījumiem un kuvetēm, padarot procesu ātrāku un ērtāku.

Šodien modernās tehnikas, piemēram, digitālā PCR un nākamās paaudzes sekvencēšana, ir paplašinājušas DNS kvantifikācijas robežas vēl tālāk, ļaujot absolūti kvantificēt specifiskas secības un vienas molekulas noteikšanu. Tomēr pamata spektrofotometriskā principa, kas izveidots pirms desmitgadēm, joprojām ir rutīnas DNS koncentrācijas mērīšanas pamats laboratorijās visā pasaulē.

Praktiski piemēri

Pastaigāsim cauri dažiem praktiskiem DNS koncentrācijas aprēķinu piemēriem:

Piemērs 1: Standarta plazmīda sagatavošana

Pētnieks ir attīrījis plazmīdu un ieguvis sekojošus mērījumus:

• A260 rādījums: 0.75
• Atšķaidījums: 1:10 (atšķaidījuma faktors = 10)
• DNS šķīduma tilpums: 50 μL

Aprēķins:

• Koncentrācija = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• Kopējā DNS = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

Piemērs 2: Genoma DNS ekstrakcija

Pēc genoma DNS ekstrakcijas no asinīm:

• A260 rādījums: 0.15
• Nav atšķaidījuma (atšķaidījuma faktors = 1)
• DNS šķīduma tilpums: 200 μL

Aprēķins:

• Koncentrācija = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• Kopējā DNS = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

Piemērs 3: DNS sagatavošana sekvencēšanai

Sekvencēšanas protokolam nepieciešami tieši 500 ng DNS:

• DNS koncentrācija: 125 ng/μL
• Nepieciešamais daudzums: 500 ng

Nepieciešamais tilpums = 500 ÷ 125 = 4 μL DNS šķīduma

Koda piemēri

Šeit ir piemēri, kā aprēķināt DNS koncentrāciju dažādās programmēšanas valodās:

1' Excel formula DNS koncentrācijai
2=A260*50*AtšķaidījumaFaktors
3
4' Excel formula kopējā DNS daudzuma aprēķināšanai μg
5=(A260*50*AtšķaidījumaFaktors*Tilpums)/1000
6
7' Piemērs šūnā ar A260=0.5, AtšķaidījumaFaktors=2, Tilpums=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Rezultāts: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Aprēķināt DNS koncentrāciju ng/μL
4    
5    Parametri:
6    absorbance (float): Absorbcijas rādījums pie 260nm
7    
8    Atgriež:
9    float: DNS koncentrācija ng/μL
10    """
11    return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14    """
15    Aprēķināt kopējo DNS daudzumu μg
16    
17    Parametri:
18    concentration (float): DNS koncentrācija ng/μL
19    volume_ul (float): DNS šķīduma tilpums μL
20    
21    Atgriež:
22    float: Kopējā DNS daudzums μg
23    """
24    return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# Piemēra izmantošana
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"DNS koncentrācija: {concentration:.2f} ng/μL")
35print(f"Kopējā DNS: {total_dna:.2f} μg")
36

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Atgriež DNS koncentrāciju ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Atgriež kopējo DNS daudzumu μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Piemēra izmantošana
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNS koncentrācija: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Kopējā DNS: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Aprēķināt DNS koncentrāciju ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance Absorbcijas rādījums pie 260nm
6     * @param dilutionFactor Atšķaidījuma faktors paraugam
7     * @return DNS koncentrācija ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Aprēķināt kopējo DNS daudzumu μg
15     * 
16     * @param concentration DNS koncentrācija ng/μL
17     * @param volumeUL DNS šķīduma tilpums μL
18     * @return Kopējā DNS daudzums μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNS koncentrācija: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Kopējā DNS: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# R funkcija DNS koncentrācijas aprēķināšanai
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Atgriež DNS koncentrāciju ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Atgriež kopējo DNS daudzumu μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Piemēra izmantošana
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNS koncentrācija: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Kopējā DNS: %.2f μg\n", total_dna))
23

Biežāk uzdotie jautājumi

Kas ir atšķirība starp DNS koncentrāciju un DNS tīrību?

DNS koncentrācija attiecas uz DNS daudzumu šķīdumā, parasti izmērītu ng/μL vai μg/mL. Tas norāda, cik daudz DNS jums ir, bet nesniedz informāciju par tā kvalitāti. DNS tīrība novērtē piesārņotāju klātbūtni jūsu DNS paraugā, parasti mērīta ar absorbcijas attiecībām, piemēram, A260/A280 (olbaltumvielu piesārņojumam) un A260/A230 (organisko savienojumu piesārņojumam). Tīram DNS parasti ir A260/A280 attiecība ~1.8 un A260/A230 attiecība 2.0-2.2.

Kāpēc pārvēršanas faktors atšķiras DNS, RNA un olbaltumvielām?

Pārvēršanas faktori atšķiras, jo katram biomolekulam ir unikāls iznīcināšanas koeficients (spēja absorbēt gaismu) atkarībā no to ķīmiskās sastāva. Dubultā ķēdes DNS ir pārvēršanas faktors 50 ng/μL pie A260=1.0, kamēr vienkāršā ķēdes DNS ir 33 ng/μL, RNA ir 40 ng/μL, un olbaltumvielas (mērītas pie 280nm) atšķiras, bet vidēji ir apmēram 1 mg/mL pie A280=1.0. Šīs atšķirības rodas no dažādām nukleotīdu vai aminoskābju sastāvdaļām un to attiecīgajām absorbances īpašībām.

Cik precīza ir spektrofotometriskā DNS kvantifikācija?

Spektrofotometriskā DNS kvantifikācija parasti ir precīza noteiktā lineārā diapazonā (parasti A260 starp 0.1 un 1.0), ar precizitāti aptuveni ±3-5%. Tomēr precizitāte samazinās ļoti zemu koncentrāciju gadījumā (zem 5 ng/μL) un var tikt ietekmēta no piesārņotājiem, piemēram, olbaltumvielām, RNA, brīviem nukleotīdiem vai noteiktām buferiem. Ļoti precīzai mērīšanai atšķaidītos paraugos vai kad ir nepieciešama augsta tīrība, ieteicams izmantot fluorometriskās metodes, piemēram, Qubit vai PicoGreen, jo tās ir specifiskākas dubultā ķēdes DNS.

Kā interpretēt A260/A280 attiecību?

A260/A280 attiecība norāda uz jūsu DNS parauga tīrību attiecībā uz olbaltumvielu piesārņojumu:

• Attiecība ~1.8 parasti tiek uzskatīta par "tīru" DNS
• Zemākas attiecības var liecināt par olbaltumvielu piesārņojumu
• Augstākas attiecības var liecināt par RNA piesārņojumu
• Šķīduma pH un joniskā stiprība var arī ietekmēt šo attiecību

Lai gan tas ir noderīgs kvalitātes pārbaudei, A260/A280 attiecība negarantē funkcionālu DNS, jo citi piesārņotāji vai DNS degradācija var neietekmēt šo attiecību.

Vai varu mērīt DNS koncentrāciju krāsainos šķīdumos?

DNS koncentrācijas mērīšana krāsainos šķīdumos, izmantojot spektrofotometriju, var būt sarežģīta, jo krāsa var absorbēt pie vai tuvu 260nm, traucējot DNS mērījumu. Šādos gadījumos:

1. Veiciet viļņu skenēšanu (220-320nm), lai pārbaudītu anomālas absorbcijas paraugus
2. Izmantojiet fluorometrisku metodi, piemēram, Qubit, kas ir mazāk ietekmēta no šķīduma krāsas
3. Turpiniet attīrīt DNS, lai noņemtu krāsainos savienojumus
4. Ja traucējošā savienojuma absorbcijas spektrs ir zināms, var veikt matemātiskas korekcijas

Kāds ir minimālais tilpums, kas nepieciešams DNS koncentrācijas mērīšanai?

Minimālais tilpums ir atkarīgs no izmantotā instrumenta:

• Tradicionālām spektrofotometrām ar kuvetēm parasti ir nepieciešami 50-100 μL
• Mikrotilpuma spektrofotometriem, piemēram, NanoDrop, nepieciešami tikai 0.5-2 μL
• Fluorometriskās metodes parasti prasa 1-20 μL parauga plus reaģenta tilpumu
• Mikroplāksnes lasītāji parasti izmanto 100-200 μL uz labi

Mikrotilpuma spektrofotometri ir revolucionizējuši DNS kvantifikāciju, ļaujot mērījumus veikt no dārgiem paraugiem ar minimālām tilpuma prasībām.

Kā aprēķināt atšķaidījuma faktoru?

Atšķaidījuma faktors tiek aprēķināts šādi:

$\text{Atšķaidījuma faktors} = \frac{\text{Kopējais tilpums (Paraugs + Atšķaidītājs)}}{\text{Parauga tilpums}}$

Piemēram:

• Ja jūs pievienojat 1 μL DNS 99 μL bufera, atšķaidījuma faktors ir 100
• Ja jūs pievienojat 5 μL DNS 45 μL bufera, atšķaidījuma faktors ir 10
• Ja izmantojat neatšķaidītu DNS, atšķaidījuma faktors ir 1

Vienmēr izmantojiet to pašu buferi atšķaidīšanai, kādu izmantojāt, lai tukšo spektrofotometru.

Kā pārvērst starp dažādām koncentrācijas vienībām?

Izplatītas DNS koncentrācijas vienību pārvēršanas:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM no 1000 bp DNS fragmenta ≈ 660 ng/μL

Lai pārvērstu no masas koncentrācijas (ng/μL) uz molāro koncentrāciju (nM) DNS fragmentam:

$\text{Koncentrācija (nM)} = \frac{\text{Koncentrācija (ng/μL)} \times 10^6}{\text{DNS garums (bp)} \times 660}$

Kas var izraisīt neprecīzus DNS koncentrācijas mērījumus?

Vairāki faktori var novest pie neprecīziem DNS koncentrācijas mērījumiem:

1. Piesārņojums: Olbaltumvielas, fenols, guanidīns vai citi ekstrakcijas reaģenti var ietekmēt absorbciju
2. Gaisa burbuļi: Gaisa burbuļi gaismas ceļā var radīt nepareizus rādījumus
3. DNS degradācija: Fragmentēta DNS var būt mainījusi absorbcijas īpašības
4. Nepareiza tukšošana: Izmantojot citu buferi tukšumam nekā tas, ko izmantoja DNS izšķīdināšanai
5. Neviendabīgs šķīdums: Nepietiekami sajaukti DNS šķīdumi dod nesakritīgas rādījumus
6. Ierīces kalibrēšana: Nekalibrēti vai netīri spektrofotometri ražo nepārliecinošus rezultātus
7. Mērījumi ārpus lineārā diapazona: Ļoti augstas vai ļoti zemas absorbcijas vērtības var nebūt precīzas

Vai varu izmantot šo kalkulatoru RNA koncentrācijai?

Lai gan šis kalkulators ir optimizēts dubultā ķēdes DNS (izmantojot 50 ng/μL pārvēršanas faktoru), jūs varat to pielāgot RNA, veicot sekojošo:

1. Mēriet A260 kā parasti
2. Reiziniet ar 40, nevis 50 (RNA specifiskais pārvēršanas faktors)
3. Pielietojiet atbilstošo atšķaidījuma faktoru

RNA formula būtu: $\text{RNA koncentrācija (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Atšķaidījuma faktors}$

Atsauces

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Nukleīnskābju kvantifikācija ar absorbciju un fluorescenci. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molekulārā klonēšana: laboratorijas rokasgrāmata (3. izdevums). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). A260/A280 attiecības vērtība nukleīnskābju tīrības mērīšanai. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). DNS tīrības spektrofotometriskā novērtēšana. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop mikrotilpuma nukleīnskābju kvantifikācija. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). DNS kvantifikācijas kļūdas, izmantojot DNS saistošas fluorescējošas krāsas un ieteiktie risinājumi. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Nukleīnskābju tīrības novērtējums. T042-Tehniskā brošūra.

8. Huberman, J. A. (1995). Svarīgums, mērījot nukleīnskābju absorbciju 240 nm, kā arī 260 un 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Enolāzes izolācija un kristalizācija. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Nukleīnskābju tīrības novērtēšanas derīgums, izmantojot 260nm/280nm absorbcijas attiecības. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Gatavs aprēķināt savu DNS koncentrāciju? Izmantojiet mūsu kalkulatoru augstāk, lai iegūtu precīzus rezultātus nekavējoties. Vienkārši ievadiet savu absorbcijas rādījumu, tilpumu un atšķaidījuma faktoru, lai noteiktu gan koncentrāciju, gan kopējo DNS daudzumu jūsu paraugā.