Калькулятор концентрации ДНК

Введение

Калькулятор концентрации ДНК — это важный инструмент для молекулярных биологов, генетиков и лабораторных техников, которым необходимо точно определить концентрацию ДНК в своих образцах. Измерение концентрации ДНК является основополагающей процедурой в лабораториях молекулярной биологии и служит критическим этапом контроля качества перед проведением последующих приложений, таких как ПЦР, секвенирование, клонирование и другие молекулярные техники. Этот калькулятор использует спектрофотометрические принципы для расчета концентрации ДНК на основе УФ-абсорбции при 260 нм (A260), применяя стандартный коэффициент преобразования и учитывая любое разведение исходного образца.

Наш удобный калькулятор упрощает процесс определения как концентрации (нг/мкл), так и общего количества ДНК в вашем образце, исключая необходимость в ручных расчетах и снижая риск математических ошибок. Независимо от того, готовите ли вы образцы для секвенирования следующего поколения, количественно оцениваете плазмидные подготовки или оцениваете выход экстракции геномной ДНК, этот инструмент предоставляет быстрые и надежные результаты для поддержки ваших исследований и диагностических рабочих процессов.

Как рассчитывается концентрация ДНК

Основной принцип

Расчет концентрации ДНК основывается на законе Бера-Ламберта, который гласит, что абсорбция раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества в растворе и длине пути света через раствор. Для двуцепочечной ДНК абсорбция 1.0 при 260 нм (A260) в кювете длиной 1 см соответствует концентрации примерно 50 нг/мкл.

Формула

Концентрация ДНК рассчитывается по следующей формуле:

$\text{Концентрация ДНК (нг/мкл)} = A_{260} \times 50 \times \text{Коэффициент разведения}$

Где:

• A260 — это показание абсорбции при 260 нм
• 50 — это стандартный коэффициент преобразования для двуцепочечной ДНК (50 нг/мкл для A260 = 1.0)
• Коэффициент разведения — это коэффициент, на который был разбавлен исходный образец для измерения

Общее количество ДНК в образце можно затем рассчитать по формуле:

$\text{Общая ДНК (мкг)} = \frac{\text{Концентрация (нг/мкл)} \times \text{Объем (мкл)}}{1000}$

Понимание переменных

1. Абсорбция при 260 нм (A260):

   • Это измерение того, сколько УФ-света при длине волны 260 нм поглощается образцом ДНК
   • Нуклеотиды ДНК (особенно азотистые основания) поглощают УФ-свет с максимальным поглощением при 260 нм
   • Чем выше абсорбция, тем больше ДНК присутствует в растворе

2. Коэффициент преобразования (50):

   • Стандартный коэффициент преобразования 50 нг/мкл относится конкретно к двуцепочечной ДНК
   • Для одноцепочечной ДНК коэффициент составляет 33 нг/мкл
   • Для РНК коэффициент составляет 40 нг/мкл
   • Для олигонуклеотидов коэффициент варьируется в зависимости от последовательности

3. Коэффициент разведения:

   • Если образец был разбавлен перед измерением (например, 1 часть образца на 9 частей буфера = коэффициент разведения 10)
   • Рассчитывается как: (Объем образца + Объем разбавителя) ÷ Объем образца
   • Используется для определения концентрации в оригинальном, неразбавленном образце

4. Объем:

   • Общий объем вашего раствора ДНК в микролитрах (мкл)
   • Используется для расчета общего количества ДНК в образце

Как использовать этот калькулятор

Следуйте этим шагам, чтобы точно определить концентрацию вашей ДНК:

1. Подготовьте ваш образец:

   • Убедитесь, что ваш образец ДНК правильно растворен и перемешан
   • Если ожидаемая концентрация высокая, подготовьте разведение, чтобы убедиться, что показание попадает в линейный диапазон (обычно A260 между 0.1 и 1.0)

2. Измерьте абсорбцию:

   • Используйте спектрофотометр или устройство NanoDrop для измерения абсорбции при 260 нм
   • Также измерьте абсорбцию при 280 нм для оценки чистоты (соотношение A260/A280)
   • Используйте тот же буфер, который использовался для растворения/разбавления вашей ДНК, в качестве эталона

3. Введите значения в калькулятор:

   • Введите измеренное значение A260 в поле "Абсорбция при 260 нм"
   • Введите общий объем вашего раствора ДНК в микролитрах
   • Введите коэффициент разведения (используйте 1, если разбавления не было)

4. Интерпретируйте результаты:

   • Калькулятор покажет концентрацию ДНК в нг/мкл
   • Общее количество ДНК в образце будет показано в мкг
   • Используйте эти значения, чтобы определить необходимый объем для последующих приложений

5. Оцените чистоту ДНК (если A280 была измерена):

   • Соотношение A260/A280 около 1.8 указывает на чистую ДНК
   • Более низкие соотношения могут указывать на загрязнение белками
   • Более высокие соотношения могут свидетельствовать о загрязнении РНК

Случаи использования

Измерение концентрации ДНК имеет решающее значение во многих приложениях молекулярной биологии и биотехнологии:

Молекулярное клонирование

Перед лигированием фрагментов ДНК в векторы знание точной концентрации позволяет исследователям рассчитывать оптимальное соотношение вставки к вектору, максимизируя эффективность трансформации. Например, соотношение 3:1 молярное соотношение вставки к вектору часто дает наилучшие результаты, что требует точных измерений концентрации обоих компонентов.

ПЦР и qPCR

ПЦР-реакции обычно требуют 1-10 нг шаблонной ДНК для оптимальной амплификации. Слишком мало ДНК может привести к неудаче амплификации, в то время как слишком много может ингибировать реакцию. Для количественной ПЦР (qPCR) необходима еще более точная количественная оценка ДНК, чтобы обеспечить точные стандартные кривые и надежную количественную оценку.

Секвенирование следующего поколения (NGS)

Протоколы подготовки библиотек NGS требуют точных количеств ДНК на входе, часто в диапазоне от 1 до 500 нг в зависимости от платформы и приложения. Точное измерение концентрации имеет решающее значение для успешной подготовки библиотек и сбалансированного представительства образцов в многопоточных секвенирующих запусках.

Эксперименты по трансфекции

При введении ДНК в эукариотические клетки оптимальное количество ДНК варьируется в зависимости от типа клеток и метода трансфекции. Обычно используется 0.5-5 мкг плазмидной ДНК на лунку в формате 6-луночной пластины, что требует точного измерения концентрации для стандартизации экспериментов.

Судебный анализ ДНК

В судебных приложениях образцы ДНК часто ограничены и ценны. Точная количественная оценка позволяет судебным ученым определить, достаточно ли ДНК для профилирования, и стандартизировать количество ДНК, используемого в последующих анализах.

Переваривание с помощью рестрикционных ферментов

Рестрикционные ферменты имеют специфические единицы активности, определенные на мкг ДНК. Знание точной концентрации ДНК позволяет установить правильные соотношения фермента и ДНК, обеспечивая полное переваривание без звёздной активности (неселективного разрезания).

Альтернативы спектрофотометрическому измерению

Хотя УФ-спектрофотометрия является наиболее распространенным методом количественной оценки ДНК, существуют несколько альтернатив:

1. Флуорометрические методы:

   • Флуоресцентные красители, такие как PicoGreen, Qubit и SYBR Green, связываются специфически с двуцепочечной ДНК
   • Более чувствительны, чем спектрофотометрия (могут обнаруживать всего 25 пг/мл)
   • Менее подвержены влиянию загрязнителей, таких как белки, РНК или свободные нуклеотиды
   • Требуют флуориметра и специфических реагентов

2. Агарозный гель-электрофорез:

   • ДНК можно количественно оценить, сравнивая интенсивность полос с стандартами известной концентрации
   • Одновременно предоставляет информацию о размере и целостности ДНК
   • Менее точен, чем спектрофотометрические или флуорометрические методы
   • Занимает много времени, но полезен для визуального подтверждения

3. Реакция ПЦР в реальном времени:

   • Высоко чувствительный метод для количественной оценки специфических последовательностей ДНК
   • Может обнаруживать чрезвычайно низкие концентрации (до нескольких копий)
   • Требует специфических праймеров и более сложного оборудования
   • Используется, когда необходима количественная оценка, специфичная для последовательности

4. Цифровая ПЦР:

   • Абсолютная количественная оценка без стандартных кривых
   • Исключительно точна для редких мишеней
   • Дорогая и требует специализированного оборудования
   • Используется для обнаружения редких мутаций и анализа вариации числа копий

История измерения концентрации ДНК

Способность точно измерять концентрацию ДНК значительно эволюционировала вместе с развитием молекулярной биологии:

Ранние методы (1950-е - 1960-е)

После открытия структуры ДНК Уотсоном и Криком в 1953 году ученые начали разрабатывать методы для изоляции и количественной оценки ДНК. Ранние подходы полагались на колориметрические анализы, такие как реакция дифенилгидразина, которая производила синий цвет при реакции с дезоксирибозными сахарами в ДНК. Эти методы были относительно нечувствительными и подвержены помехам.

Эра спектрофотометрии (1970-е)

Применение УФ-спектрофотометрии для количественной оценки нуклеиновых кислот стало широко распространенным в 1970-х годах. Ученые обнаружили, что ДНК поглощает УФ-свет с максимумом при 260 нм, и что связь между абсорбцией и концентрацией была линейной в определенном диапазоне. Коэффициент преобразования 50 нг/мкл для двуцепочечной ДНК при A260 = 1.0 был установлен в этот период.

Флуорометрическая революция (1980-е - 1990-е)

Разработка специфических флуоресцентных красителей для ДНК в 1980-х и 1990-х годах произвела революцию в количественной оценке ДНК, особенно для разбавленных образцов. Красители Хоэшт и позже PicoGreen обеспечили гораздо более чувствительное обнаружение, чем было возможно с помощью спектрофотометрии. Эти методы стали особенно важными с появлением ПЦР, которая часто требовала точной количественной оценки минутных количеств ДНК.

Современная эра (2000-е - настоящее время)

Введение микроволновых спектрофотометров, таких как NanoDrop, в начале 2000-х годов преобразовало рутинную количественную оценку ДНК, требуя всего 0.5-2 мкл образца. Эта технология устранила необходимость в разбавлениях и кюветах, сделав процесс быстрее и удобнее.

Сегодня современные методы, такие как цифровая ПЦР и секвенирование следующего поколения, значительно расширили границы количественной оценки ДНК, позволяя абсолютную количественную оценку специфических последовательностей и обнаружение отдельных молекул. Тем не менее, основной спектрофотометрический принцип, установленный десятилетия назад, остается основой рутинного измерения концентрации ДНК в лабораториях по всему миру.

Практические примеры

Давайте рассмотрим некоторые практические примеры расчетов концентрации ДНК:

Пример 1: Стандартная подготовка плазмиды

Исследователь очистил плазмиду и получил следующие измерения:

• Показание A260: 0.75
• Разведение: 1:10 (коэффициент разведения = 10)
• Объем раствора ДНК: 50 мкл

Расчет:

• Концентрация = 0.75 × 50 × 10 = 375 нг/мкл
• Общая ДНК = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 мкг

Пример 2: Экстракция геномной ДНК

После экстракции геномной ДНК из крови:

• Показание A260: 0.15
• Без разведения (коэффициент разведения = 1)
• Объем раствора ДНК: 200 мкл

Расчет:

• Концентрация = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 нг/мкл
• Общая ДНК = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 мкг

Пример 3: Подготовка ДНК для секвенирования

Протокол секвенирования требует точно 500 нг ДНК:

• Концентрация ДНК: 125 нг/мкл
• Необходимое количество: 500 нг

Необходимый объем = 500 ÷ 125 = 4 мкл раствора ДНК

Примеры кода

Вот примеры того, как рассчитать концентрацию ДНК на различных языках программирования:

1' Excel формула для концентрации ДНК
2=A260*50*КоэффициентРазведения
3
4' Excel формула для общего количества ДНК в мкг
5=(A260*50*КоэффициентРазведения*Объем)/1000
6
7' Пример в ячейке с A260=0.5, КоэффициентРазведения=2, Объем=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Результат: 5 мкг
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Рассчитать концентрацию ДНК в нг/мкл
4    
5    Параметры:
6    absorbance (float): Показание абсорбции при 260 нм
7    dilution_factor (float): Коэффициент разведения образца
8    
9    Возвращает:
10    float: Концентрация ДНК в нг/мкл
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Рассчитать общее количество ДНК в мкг
17    
18    Параметры:
19    concentration (float): Концентрация ДНК в нг/мкл
20    volume_ul (float): Объем раствора ДНК в мкл
21    
22    Возвращает:
23    float: Общее количество ДНК в мкг
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Пример использования
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Концентрация ДНК: {concentration:.2f} нг/мкл")
36print(f"Общая ДНК: {total_dna:.2f} мкг")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Возвращает концентрацию ДНК в нг/мкл
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Возвращает общее количество ДНК в мкг
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Пример использования
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`Концентрация ДНК: ${concentration.toFixed(2)} нг/мкл`);
20console.log(`Общая ДНК: ${totalDNA.toFixed(2)} мкг`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Рассчитать концентрацию ДНК в нг/мкл
4     * 
5     * @param absorbance Показание абсорбции при 260 нм
6     * @param dilutionFactor Коэффициент разведения образца
7     * @return Концентрация ДНК в нг/мкл
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Рассчитать общее количество ДНК в мкг
15     * 
16     * @param concentration Концентрация ДНК в нг/мкл
17     * @param volumeUL Объем раствора ДНК в мкл
18     * @return Общее количество ДНК в мкг
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("Концентрация ДНК: %.2f нг/мкл%n", concentration);
33        System.out.printf("Общая ДНК: %.2f мкг%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# R функция для расчета концентрации ДНК
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Возвращает концентрацию ДНК в нг/мкл
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Возвращает общее количество ДНК в мкг
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Пример использования
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("Концентрация ДНК: %.2f нг/мкл\n", concentration))
22cat(sprintf("Общая ДНК: %.2f мкг\n", total_dna))
23

Часто задаваемые вопросы

В чем разница между концентрацией ДНК и чистотой ДНК?

Концентрация ДНК относится к количеству ДНК, присутствующему в растворе, обычно измеряемому в нг/мкл или мкг/мл. Это говорит вам о том, сколько ДНК у вас есть, но не указывает на ее качество. Чистота ДНК оценивает наличие загрязнителей в вашем образце ДНК, обычно измеряемая по соотношениям абсорбции, таким как A260/A280 (для загрязнения белками) и A260/A230 (для загрязнения органическими соединениями). Чистая ДНК обычно имеет соотношение A260/A280 около 1.8 и соотношение A260/A230 2.0-2.2.

Почему коэффициенты преобразования различаются для ДНК, РНК и белков?

Коэффициенты преобразования различаются, потому что каждая биомолекула имеет уникальный коэффициент поглощения (способность поглощать свет) из-за их различного химического состава. Двуцепочечная ДНК имеет коэффициент преобразования 50 нг/мкл при A260=1.0, тогда как одноцепочечная ДНК составляет 33 нг/мкл, РНК — 40 нг/мкл, а белки (измеряемые при 280 нм) варьируются, но в среднем составляют около 1 мг/мл при A280=1.0. Эти различия возникают из-за различных составов нуклеотидов или аминокислот и их соответствующих свойств поглощения.

Насколько точна спектрофотометрическая количественная оценка ДНК?

Спектрофотометрическая количественная оценка ДНК обычно точна в пределах линейного диапазона (обычно A260 между 0.1 и 1.0), с точностью примерно ±3-5%. Однако точность снижается при очень низких концентрациях (ниже 5 нг/мкл) и может быть затруднена загрязнителями, такими как белки, РНК, свободные нуклеотиды или определенные буферы. Для высокоточных измерений разбавленных образцов или когда требуется высокая чистота рекомендуется использовать флуорометрические методы, такие как Qubit или PicoGreen, так как они более специфичны для двуцепочечной ДНК.

Как интерпретировать соотношение A260/A280?

Соотношение A260/A280 указывает на чистоту вашего образца ДНК относительно загрязнения белками:

• Соотношение около 1.8 обычно считается "чистым" для ДНК
• Соотношения ниже 1.8 могут указывать на загрязнение белками
• Соотношения выше 2.0 могут свидетельствовать о загрязнении РНК
• pH и ионная сила раствора также могут повлиять на это соотношение

Хотя это полезно как проверка качества, соотношение A260/A280 не гарантирует функциональной ДНК, так как другие загрязнители или деградация ДНК могут не повлиять на это соотношение.

Могу ли я измерять концентрацию ДНК в окрашенных растворах?

Измерение концентрации ДНК в окрашенных растворах с помощью спектрофотометрии может быть сложным, так как цвет может поглощать на или около 260 нм, что мешает измерению ДНК. В таких случаях:

1. Проведите сканирование длины волны (220-320 нм), чтобы проверить на наличие аномальных абсорбционных паттернов
2. Используйте флуорометрический метод, такой как Qubit, который менее подвержен влиянию цвета образца
3. Дополнительно очистите ДНК, чтобы удалить окрашенные соединения
4. Примените математические коррекции, если спектр абсорбции мешающего соединения известен

Каков минимальный объем, необходимый для измерения концентрации ДНК?

Минимальный объем зависит от используемого прибора:

• Традиционные спектрофотометры с кюветами обычно требуют 50-100 мкл
• Микроволновые спектрофотометры, такие как NanoDrop, требуют всего 0.5-2 мкл
• Флуорометрические методы обычно требуют 1-20 мкл образца плюс объем реагента
• Микропланшетные считыватели обычно используют 100-200 мкл на лунку

Микроволновые спектрофотометры произвели революцию в количественной оценке ДНК, позволяя измерения драгоценных образцов с минимальными требованиями к объему.

Как рассчитать коэффициент разведения?

Коэффициент разведения рассчитывается как:

$\text{Коэффициент разведения} = \frac{\text{Общий объем (образец + разбавитель)}}{\text{Объем образца}}$

Например:

• Если вы добавляете 1 мкл ДНК в 99 мкл буфера, коэффициент разведения составляет 100
• Если вы добавляете 5 мкл ДНК в 45 мкл буфера, коэффициент разведения составляет 10
• Если вы используете неразбавленную ДНК, коэффициент разведения составляет 1

Всегда используйте тот же буфер для разведения, что и для эталона спектрофотометра.

Как конвертировать между различными единицами концентрации?

Общие преобразования единиц концентрации ДНК:

• 1 нг/мкл = 1 мкг/мл
• 1 мкг/мл = 0.001 мг/мл
• 1 нг/мкл = 1000 пг/мкл
• 1 мкмол/л 1000-базовой ДНК ≈ 660 нг/мкл

Чтобы преобразовать из массовой концентрации (нг/мкл) в молярную концентрацию (нМ) для фрагмента ДНК:

$\text{Концентрация (нМ)} = \frac{\text{Концентрация (нг/мкл)} \times 10^6}{\text{Длина ДНК (п.н.)} \times 660}$

Что может вызвать неточные измерения концентрации ДНК?

Несколько факторов могут привести к неточным измерениям концентрации ДНК:

1. Загрязнение: Белки, фенол, гуанидин или другие реагенты экстракции могут повлиять на абсорбцию
2. Пузыри: Воздушные пузыри в световом пути могут вызывать ошибочные показания
3. Деградация ДНК: Фрагментированная ДНК может иметь измененные свойства абсорбции
4. Неправильное обнуление: Использование другого буфера для обнуления, чем тот, что использовался для растворения ДНК
5. Несоответствующее смешивание: Неправильно перемешанные растворы ДНК дают непоследовательные показания
6. Калибровка прибора: Некалиброванные или грязные спектрофотометры дают ненадежные результаты
7. Измерения вне линейного диапазона: Очень высокие или очень низкие значения абсорбции могут быть неточными

Могу ли я использовать этот калькулятор для концентрации РНК?

Хотя этот калькулятор оптимизирован для двуцепочечной ДНК (с использованием коэффициента преобразования 50 нг/мкл), вы можете адаптировать его для РНК, выполнив следующие действия:

1. Измерьте A260 как обычно
2. Умножьте на 40 вместо 50 (коэффициент, специфичный для РНК)
3. Примените соответствующий коэффициент разведения

Формула для РНК будет: $\text{Концентрация РНК (нг/мкл)} = A_{260} \times 40 \times \text{Коэффициент разведения}$

Ссылки

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Количественная оценка ДНК и РНК с помощью абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии. Текущие протоколы в молекулярной биологии, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Молекулярное клонирование: лабораторный справочник (3-е изд.). Издательство Cold Spring Harbor Laboratory.

3. Manchester, K. L. (1995). Значение соотношений A260/A280 для измерения чистоты нуклеиновых кислот. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Влияние pH и ионной силы на спектрофотометрическую оценку чистоты нуклеиновых кислот. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). Количественная оценка нуклеиновых кислот с помощью NanoDrop. Журнал визуализированных экспериментов, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Подводные камни количественной оценки ДНК с использованием флуоресцентных красителей, специфичных для ДНК, и предложенные решения. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Оценка чистоты нуклеиновых кислот. T042-Технический бюллетень.

8. Huberman, J. A. (1995). Важность измерения абсорбции нуклеиновых кислот при 240 нм, а также при 260 и 280 нм. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Изоляция и кристаллизация энолазы. Биохимическая записка, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Действительность чистоты нуклеиновых кислот, контролируемой соотношениями 260 нм/280 нм абсорбции. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Готовы рассчитать вашу концентрацию ДНК? Используйте наш калькулятор выше, чтобы мгновенно получить точные результаты. Просто введите ваше показание абсорбции, объем и коэффициент разведения, чтобы определить как концентрацию, так и общее количество ДНК в вашем образце.