ดีเอ็นเอ ความเข้มข้น เครื่องคำนวณ

บทนำ

เครื่องคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอเป็นเครื่องมือที่สำคัญสำหรับนักชีววิทยาโมเลกุล นักพันธุศาสตร์ และช่างเทคนิคในห้องปฏิบัติการที่ต้องการกำหนดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในตัวอย่างของพวกเขาอย่างแม่นยำ การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอเป็นขั้นตอนพื้นฐานในห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุล ซึ่งทำหน้าที่เป็นขั้นตอนการควบคุมคุณภาพที่สำคัญก่อนที่จะดำเนินการกับแอปพลิเคชันในระดับล่าง เช่น PCR การจัดลำดับ การทำคลอด และเทคนิคโมเลกุลอื่น ๆ เครื่องคำนวณนี้ใช้หลักการสเปกโตรโฟโตเมตริกเพื่อคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอตามการดูดกลืน UV ที่ 260nm (A260) โดยใช้ปัจจัยการแปลงมาตรฐานและคำนึงถึงการเจือจางของตัวอย่างต้นฉบับ

เครื่องคำนวณที่ใช้งานง่ายของเราช่วยให้กระบวนการกำหนดทั้งความเข้มข้น (ng/μL) และปริมาณรวมของดีเอ็นเอในตัวอย่างของคุณง่ายขึ้น โดยไม่ต้องคำนวณด้วยมือและลดความเสี่ยงของข้อผิดพลาดทางคณิตศาสตร์ ไม่ว่าคุณจะเตรียมตัวอย่างสำหรับการจัดลำดับรุ่นถัดไป การวัดปริมาณการเตรียมพลาสมิด หรือการประเมินผลผลิตการสกัดดีเอ็นเอของจีโนม เครื่องมือนี้ให้ผลลัพธ์ที่รวดเร็วและเชื่อถือได้เพื่อสนับสนุนการวิจัยและการวินิจฉัยของคุณ

วิธีการคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอ

หลักการพื้นฐาน

การคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับกฎของ Beer-Lambert ซึ่งระบุว่าการดูดกลืนของสารละลายมีความสัมพันธ์โดยตรงกับความเข้มข้นของสารที่ดูดกลืนในสารละลายและความยาวของเส้นทางของแสงที่ผ่านสารละลาย สำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่ การดูดกลืนที่ 1.0 ที่ 260nm (A260) ในหลอดทดลองที่มีความยาว 1 ซม. จะสัมพันธ์กับความเข้มข้นประมาณ 50 ng/μL

สูตร

ความเข้มข้นของดีเอ็นเอคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

$\text{DNA Concentration (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Dilution Factor}$

โดยที่:

• A260 คือการอ่านค่าการดูดกลืนที่ 260nm
• 50 คือปัจจัยการแปลงมาตรฐานสำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่ (50 ng/μL สำหรับ A260 = 1.0)
• Dilution Factor คือปัจจัยที่ใช้ในการเจือจางตัวอย่างต้นฉบับเพื่อการวัด

ปริมาณรวมของดีเอ็นเอในตัวอย่างสามารถคำนวณได้โดย:

$\text{Total DNA (μg)} = \frac{\text{Concentration (ng/μL)} \times \text{Volume (μL)}}{1000}$

การทำความเข้าใจตัวแปร

1. การดูดกลืนที่ 260nm (A260):

   • นี่คือการวัดว่ามีแสง UV ที่ความยาวคลื่น 260nm ถูกดูดกลืนโดยตัวอย่างดีเอ็นเอมากน้อยเพียงใด
   • นิวคลีโอไทด์ดีเอ็นเอ (โดยเฉพาะฐานไนโตรเจน) จะดูดกลืนแสง UV โดยมีการดูดกลืนสูงสุดที่ 260nm
   • ยิ่งการดูดกลืนสูงเท่าใด ยิ่งมีดีเอ็นเออยู่ในสารละลายมากขึ้น

2. ปัจจัยการแปลง (50):

   • ปัจจัยการแปลงมาตรฐานที่ 50 ng/μL ใช้เฉพาะสำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่
   • สำหรับดีเอ็นเอแบบสายเดียว ปัจจัยคือ 33 ng/μL
   • สำหรับ RNA ปัจจัยคือ 40 ng/μL
   • สำหรับออริโกนิวคลีโอไทด์ ปัจจัยจะแตกต่างกันตามลำดับ

3. ปัจจัยการเจือจาง:

   • หากตัวอย่างถูกเจือจางก่อนการวัด (เช่น 1 ส่วนตัวอย่างต่อ 9 ส่วนบัฟเฟอร์ = ปัจจัยการเจือจาง 10)
   • คำนวณได้จาก: (ปริมาณของตัวอย่าง + ปริมาณของตัวทำละลาย) ÷ ปริมาณของตัวอย่าง
   • ใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นในตัวอย่างที่ไม่ได้เจือจาง

4. ปริมาณ:

   • ปริมาณรวมของสารละลายดีเอ็นเอของคุณในไมโครลิตร (μL)
   • ใช้ในการคำนวณปริมาณรวมของดีเอ็นเอในตัวอย่าง

วิธีการใช้เครื่องคำนวณนี้

ทำตามขั้นตอนเหล่านี้เพื่อกำหนดความเข้มข้นของดีเอ็นเอของคุณอย่างแม่นยำ:

1. เตรียมตัวอย่างของคุณ:

   • ตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างดีเอ็นเอของคุณละลายและผสมอย่างถูกต้อง
   • หากความเข้มข้นที่คาดหวังสูง ให้เตรียมการเจือจางเพื่อให้แน่ใจว่าการอ่านอยู่ในช่วงเชิงเส้น (โดยทั่วไป A260 ระหว่าง 0.1 และ 1.0)

2. วัดการดูดกลืน:

   • ใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์หรืออุปกรณ์นานโดรอปเพื่อวัดการดูดกลืนที่ 260nm
   • วัดการดูดกลืนที่ 280nm เพื่อประเมินความบริสุทธิ์ (อัตราส่วน A260/A280)
   • ใช้บัฟเฟอร์เดียวกันที่ใช้ในการละลาย/เจือจางดีเอ็นเอของคุณเป็นการอ้างอิง

3. ป้อนค่าในเครื่องคำนวณ:

   • ป้อนค่า A260 ที่วัดได้ในช่อง "การดูดกลืนที่ 260nm"
   • ป้อนปริมาณรวมของสารละลายดีเอ็นเอของคุณในไมโครลิตร
   • ป้อนปัจจัยการเจือจาง (ใช้ 1 หากไม่มีการเจือจาง)

4. ตีความผลลัพธ์:

   • เครื่องคำนวณจะแสดงความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
   • ปริมาณดีเอ็นเอรวมในตัวอย่างจะแสดงเป็น μg
   • ใช้ค่าดังกล่าวเพื่อกำหนดปริมาณที่เหมาะสมสำหรับแอปพลิเคชันในระดับล่าง

5. ประเมินความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ (หากวัด A280):

   • อัตราส่วน A260/A280 ประมาณ 1.8 แสดงถึงดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์
   • อัตราส่วนที่ต่ำกว่าจะแสดงถึงการปนเปื้อนของโปรตีน
   • อัตราส่วนที่สูงกว่าจะบ่งชี้ถึงการปนเปื้อนของ RNA

กรณีการใช้งาน

การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอมีความสำคัญในแอปพลิเคชันชีววิทยาโมเลกุลและเทคโนโลยีชีวภาพหลายประการ:

การทำคลอดโมเลกุล

ก่อนที่จะเชื่อมต่อชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้ากับเวกเตอร์ การทราบความเข้มข้นที่แน่นอนช่วยให้นักวิจัยคำนวณอัตราส่วนของการใส่ต่อเวกเตอร์ที่เหมาะสม ซึ่งจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการเปลี่ยนถ่าย ตัวอย่างเช่น อัตราส่วน 3:1 ของการใส่ต่อเวกเตอร์มักให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด ซึ่งต้องการการวัดความเข้มข้นที่แม่นยำของทั้งสองส่วนประกอบ

PCR และ qPCR

PCR มักต้องการดีเอ็นเอแม่แบบ 1-10 ng เพื่อการขยายที่เหมาะสม ดีเอ็นเอที่น้อยเกินไปอาจทำให้การขยายล้มเหลว ขณะที่ดีเอ็นเอที่มากเกินไปอาจทำให้เกิดการยับยั้งการทำงาน สำหรับการทำ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่แม่นยำยิ่งขึ้นจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าเส้นโค้งมาตรฐานที่เชื่อถือได้และการวัดที่เชื่อถือได้

การจัดลำดับรุ่นถัดไป (NGS)

โปรโตคอลการเตรียมไลบรารี NGS กำหนดจำนวนดีเอ็นเอที่ป้อนที่แน่นอนซึ่งมักอยู่ในช่วง 1-500 ng ขึ้นอยู่กับแพลตฟอร์มและแอปพลิเคชัน การวัดความเข้มข้นที่แม่นยำมีความสำคัญต่อการเตรียมไลบรารีที่ประสบความสำเร็จและการแสดงตัวอย่างที่สมดุลในรอบการจัดลำดับที่หลายตัวอย่าง

การทดลองการถ่ายโอน

เมื่อแนะนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ยูคาริโอต ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสมจะแตกต่างกันไปตามประเภทเซลล์และวิธีการถ่ายโอน โดยทั่วไปจะใช้ดีเอ็นเอพลาสมิด 0.5-5 μg ต่อหลุมในรูปแบบจาน 6 หลุม ซึ่งต้องการการวัดความเข้มข้นที่แม่นยำเพื่อทำให้การทดลองเป็นมาตรฐาน

การวิเคราะห์ดีเอ็นเอทางนิติวิทยาศาสตร์

ในแอปพลิเคชันทางนิติวิทยาศาสตร์ ตัวอย่างดีเอ็นเอมักมีจำกัดและมีค่า การวัดความเข้มข้นที่แม่นยำช่วยให้นักวิทยาศาสตร์ทางนิติวิทยาศาสตร์สามารถกำหนดได้ว่ามีดีเอ็นเอเพียงพอสำหรับการสร้างโปรไฟล์หรือไม่ และเพื่อทำให้ปริมาณดีเอ็นเอที่ใช้ในการวิเคราะห์ถัดไปเป็นมาตรฐาน

การย่อยด้วยเอนไซม์จำกัด

เอนไซม์จำกัดมีหน่วยกิจกรรมเฉพาะที่กำหนดต่อ μg ของดีเอ็นเอ การทราบความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่แน่นอนช่วยให้ได้อัตราส่วนเอนไซม์ต่อดีเอ็นเอที่เหมาะสม ซึ่งจะช่วยให้การย่อยเสร็จสมบูรณ์โดยไม่มีการทำลายแบบดาว (การตัดที่ไม่เฉพาะเจาะจง)

ทางเลือกในการวัดความเข้มข้นของสเปกโตรโฟโตเมตริก

ในขณะที่การสเปกโตรโฟโตเมตริเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอ แต่ก็มีทางเลือกหลายประการ:

1. วิธีฟลูออโรเมตริก:

   • สีย้อมฟลูออเรสเซนต์เช่น PicoGreen, Qubit และ SYBR Green จะผูกพันกับดีเอ็นเอแบบสายคู่โดยเฉพาะ
   • มีความไวมากกว่าการสเปกโตรโฟโตเมตริ (สามารถตรวจจับได้ต่ำถึง 25 pg/mL)
   • น้อยกว่าที่จะได้รับผลกระทบจากสารปนเปื้อนเช่นโปรตีน RNA หรือกรดนิวคลีอิกฟรี
   • ต้องการฟลูออโรมิเตอร์และสารเคมีเฉพาะ

2. อิเล็กโทรฟอเรซิสในเจลอะการ์ส:

   • ดีเอ็นเอสามารถวัดได้โดยการเปรียบเทียบความเข้มของแถบกับมาตรฐานที่มีความเข้มข้นที่ทราบ
   • ให้ข้อมูลเกี่ยวกับขนาดและความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอในเวลาเดียวกัน
   • น้อยกว่าแม่นยำกว่าวิธีการสเปกโตรโฟโตเมตริกหรือฟลูออโรเมตริก
   • ใช้เวลานานแต่มีประโยชน์สำหรับการยืนยันภาพ

3. PCR เชิงเวลาจริง:

   • วิธีที่มีความไวสูงในการวัดปริมาณดีเอ็นเอเฉพาะ
   • สามารถตรวจจับความเข้มข้นที่ต่ำมาก (ต่ำถึงไม่กี่สำเนา)
   • ต้องการไพรเมอร์เฉพาะและอุปกรณ์ที่ซับซ้อนมากขึ้น
   • ใช้เมื่อจำเป็นต้องมีการวัดเฉพาะลำดับ

4. ดิจิทัล PCR:

   • การวัดแบบสัมบูรณ์โดยไม่มีเส้นโค้งมาตรฐาน
   • มีความแม่นยำสูงสำหรับเป้าหมายที่มีความเข้มข้นต่ำ
   • มีราคาแพงและต้องการอุปกรณ์เฉพาะทาง
   • ใช้สำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ที่หายากและการวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา

ประวัติการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอ

ความสามารถในการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเออย่างแม่นยำได้พัฒนาขึ้นอย่างมากควบคู่กับความก้าวหน้าในชีววิทยาโมเลกุล:

วิธีการในช่วงแรก (1950s-1960s)

หลังจากการค้นพบโครงสร้างของดีเอ็นเอโดยวัตสันและคริกในปี 1953 นักวิทยาศาสตร์เริ่มพัฒนาวิธีการแยกและวัดดีเอ็นเอ วิธีการในช่วงแรกพึ่งพาการทดสอบสีเช่นปฏิกิริยาดิฟีนิลอะมีน ซึ่งผลิตสีฟ้าขึ้นเมื่อทำปฏิกิริยากับน้ำตาลดีออกซีไรโบสในดีเอ็นเอ วิธีการเหล่านี้มีความไวสัมพัทธ์ต่ำและมีแนวโน้มที่จะมีการรบกวน

ยุคสเปกโตรโฟโตเมตริก (1970s)

การใช้สเปกโตรโฟโตเมตริ UV ในการวัดปริมาณกรดนิวคลีอิกเริ่มแพร่หลายตั้งแต่ปี 1970 นักวิทยาศาสตร์ค้นพบว่าดีเอ็นเอดูดกลืนแสง UV ที่มีความยาวคลื่นสูงสุดที่ 260nm และความสัมพันธ์ระหว่างการดูดกลืนและความเข้มข้นเป็นเชิงเส้นภายในช่วงหนึ่ง ปัจจัยการแปลง 50 ng/μL สำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่ที่ A260 = 1.0 ได้รับการกำหนดในช่วงเวลานี้

การปฏิวัติฟลูออโรเมตริก (1980s-1990s)

การพัฒนาสีย้อมฟลูออเรสเซนต์เฉพาะดีเอ็นเอในปี 1980 และ 1990 ได้ปฏิวัติการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับตัวอย่างที่เจือจาง สีย้อม Hoechst และต่อมา PicoGreen ทำให้สามารถตรวจจับได้ไวมากกว่าที่เป็นไปได้ด้วยการสเปกโตรโฟโตเมตริก วิธีการเหล่านี้กลายเป็นสิ่งสำคัญโดยเฉพาะเมื่อมีการเกิด PCR ซึ่งมักต้องการการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในปริมาณน้อย

ยุคปัจจุบัน (2000s-ปัจจุบัน)

การแนะนำสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครวอลุ่มเช่น NanoDrop ในช่วงต้นปี 2000 ได้เปลี่ยนแปลงการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในกิจวัตร โดยต้องการเพียง 0.5-2 μL ของตัวอย่างเท่านั้น เทคโนโลยีนี้ทำให้ไม่จำเป็นต้องมีการเจือจางและหลอดทดลอง ทำให้กระบวนการรวดเร็วและสะดวกยิ่งขึ้น

ในปัจจุบัน เทคนิคที่ก้าวหน้าเช่นดิจิทัล PCR และการจัดลำดับรุ่นถัดไปได้ผลักดันขอบเขตของการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอไปอีกขั้น โดยอนุญาตให้มีการวัดปริมาณสัมบูรณ์ของลำดับเฉพาะและการตรวจจับโมเลกุลเดียว อย่างไรก็ตาม หลักการสเปกโตรโฟโตเมตริกพื้นฐานที่ตั้งขึ้นเมื่อหลายสิบปีก่อนยังคงเป็นกระดูกสันหลังของการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในห้องปฏิบัติการทั่วโลก

ตัวอย่างการปฏิบัติ

มาดูตัวอย่างการคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอกัน:

ตัวอย่างที่ 1: การเตรียมพลาสมิดมาตรฐาน

นักวิจัยได้ทำการทำให้พลาสมิดบริสุทธิ์และได้รับการวัดดังต่อไปนี้:

• การอ่าน A260: 0.75
• การเจือจาง: 1:10 (ปัจจัยการเจือจาง = 10)
• ปริมาณของสารละลายดีเอ็นเอ: 50 μL

การคำนวณ:

• ความเข้มข้น = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• ดีเอ็นเอรวม = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

ตัวอย่างที่ 2: การสกัดดีเอ็นเอจากจีโนม

หลังจากการสกัดดีเอ็นเอจากเลือด:

• การอ่าน A260: 0.15
• ไม่มีการเจือจาง (ปัจจัยการเจือจาง = 1)
• ปริมาณของสารละลายดีเอ็นเอ: 200 μL

การคำนวณ:

• ความเข้มข้น = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• ดีเอ็นเอรวม = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

ตัวอย่างที่ 3: การเตรียมดีเอ็นเอสำหรับการจัดลำดับ

โปรโตคอลการจัดลำดับต้องการดีเอ็นเอ 500 ng:

• ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ: 125 ng/μL
• ปริมาณที่ต้องการ: 500 ng

ปริมาณที่ต้องการ = 500 ÷ 125 = 4 μL ของสารละลายดีเอ็นเอ

ตัวอย่างโค้ด

นี่คือตัวอย่างวิธีการคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอในหลายภาษาโปรแกรม:

1' สูตร Excel สำหรับความเข้มข้นของดีเอ็นเอ
2=A260*50*DilutionFactor
3
4' สูตร Excel สำหรับปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
5=(A260*50*DilutionFactor*Volume)/1000
6
7' ตัวอย่างในเซลล์ที่มี A260=0.5, DilutionFactor=2, Volume=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' ผลลัพธ์: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    คำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
4    
5    พารามิเตอร์:
6    absorbance (float): การอ่านค่าการดูดกลืนที่ 260nm
7    
8    คืนค่า:
9    float: ความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
10    """
11    return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14    """
15    คำนวณปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
16    
17    พารามิเตอร์:
18    concentration (float): ความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
19    volume_ul (float): ปริมาณของสารละลายดีเอ็นเอใน μL
20    
21    คืนค่า:
22    float: ปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
23    """
24    return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# การใช้งานตัวอย่าง
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"DNA Concentration: {concentration:.2f} ng/μL")
35print(f"Total DNA: {total_dna:.2f} μg")
36

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // คืนค่าความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // คืนค่าปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// การใช้งานตัวอย่าง
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA Concentration: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Total DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * คำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance การอ่านค่าการดูดกลืนที่ 260nm
6     * @param dilutionFactor ปัจจัยการเจือจางของตัวอย่าง
7     * @return ความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * คำนวณปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
15     * 
16     * @param concentration ความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
17     * @param volumeUL ปริมาณของสารละลายดีเอ็นเอใน μL
18     * @return ปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNA Concentration: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Total DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# ฟังก์ชัน R สำหรับการคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอ
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # คืนค่าความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # คืนค่าปริมาณดีเอ็นเอรวมใน μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# การใช้งานตัวอย่าง
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNA Concentration: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Total DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

คำถามที่พบบ่อย

ความแตกต่างระหว่างความเข้มข้นของดีเอ็นเอและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอคืออะไร?

ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ หมายถึงปริมาณของดีเอ็นเอที่มีอยู่ในสารละลาย โดยทั่วไปจะวัดใน ng/μL หรือ μg/mL มันบอกคุณว่าคุณมีดีเอ็นเอมากน้อยเพียงใด แต่ไม่บอกถึงคุณภาพของมัน ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ ประเมินการมีอยู่ของสารปนเปื้อนในตัวอย่างดีเอ็นเอของคุณ โดยทั่วไปจะวัดจากอัตราส่วนการดูดกลืน A260/A280 (สำหรับการปนเปื้อนของโปรตีน) และ A260/A230 (สำหรับการปนเปื้อนของสารประกอบอินทรีย์) ดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์มักมีอัตราส่วน A260/A280 ประมาณ ~1.8 และอัตราส่วน A260/A230 ประมาณ 2.0-2.2

ทำไมปัจจัยการแปลงจึงแตกต่างกันสำหรับดีเอ็นเอ RNA และโปรตีน?

ปัจจัยการแปลงแตกต่างกันเพราะโมเลกุลชีวภาพแต่ละชนิดมีสัมประสิทธิ์การยับยั้งที่ไม่เหมือนกัน (ความสามารถในการดูดกลืนแสง) เนื่องจากองค์ประกอบทางเคมีที่แตกต่างกัน ดีเอ็นเอแบบสายคู่มีปัจจัยการแปลง 50 ng/μL ที่ A260=1.0 ในขณะที่ดีเอ็นเอแบบสายเดียวคือ 33 ng/μL RNA คือ 40 ng/μL และโปรตีน (วัดที่ 280nm) มีความหลากหลาย แต่เฉลี่ยอยู่ที่ประมาณ 1 mg/mL ที่ A280=1.0 ความแตกต่างเหล่านี้เกิดจากองค์ประกอบที่แตกต่างกันของนิวคลีโอไทด์หรือกรดอะมิโนและคุณสมบัติการดูดกลืนของพวกเขา

การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอด้วยการสเปกโตรโฟโตเมตริกมีความแม่นยำแค่ไหน?

การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอด้วยการสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยทั่วไปมีความแม่นยำภายในช่วงเชิงเส้น (โดยทั่วไป A260 ระหว่าง 0.1 และ 1.0) โดยมีความแม่นยำประมาณ ±3-5% อย่างไรก็ตาม ความแม่นยำจะลดลงที่ความเข้มข้นต่ำมาก (ต่ำกว่า 5 ng/μL) และอาจได้รับผลกระทบจากสารปนเปื้อนเช่นโปรตีน RNA นิวคลีโอไทด์ฟรี หรือบัฟเฟอร์บางชนิด สำหรับการวัดที่มีความแม่นยำสูงของตัวอย่างที่เจือจางหรือเมื่อความบริสุทธิ์สูงเป็นสิ่งจำเป็น วิธีการฟลูออโรเมตริกเช่น Qubit หรือ PicoGreen จะถูกแนะนำเนื่องจากมีความเฉพาะเจาะจงมากกว่าสำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่

ฉันจะตีความอัตราส่วน A260/A280 ได้อย่างไร?

อัตราส่วน A260/A280 บ่งชี้ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างดีเอ็นเอของคุณในแง่ของการปนเปื้อนของโปรตีน:

• อัตราส่วนประมาณ ~1.8 ถือว่า "บริสุทธิ์" สำหรับดีเอ็นเอ
• อัตราส่วนที่ต่ำกว่า 1.8 แสดงถึงการปนเปื้อนของโปรตีน
• อัตราส่วนที่สูงกว่า 2.0 อาจบ่งชี้ถึงการปนเปื้อนของ RNA
• ค่า pH และความเข้มข้นของไอออนในสารละลายก็สามารถส่งผลต่ออัตราส่วนนี้ได้เช่นกัน

แม้ว่าจะมีประโยชน์ในการตรวจสอบคุณภาพ แต่ค่าอัตราส่วน A260/A280 ไม่รับประกันว่าดีเอ็นเอจะทำงานได้ เนื่องจากสารปนเปื้อนอื่น ๆ หรือการเสื่อมสภาพของดีเอ็นเออาจไม่ส่งผลต่ออัตราส่วนนี้

ฉันสามารถวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในสารละลายที่มีสีได้หรือไม่?

การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอในสารละลายที่มีสีโดยใช้การสเปกโตรโฟโตเมตริกอาจเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจากสีอาจดูดซับที่ 260nm หรือใกล้เคียง ทำให้การวัดดีเอ็นเอเกิดความยุ่งเหยิง ในกรณีเช่นนี้:

1. ทำการสแกนความยาวคลื่น (220-320nm) เพื่อตรวจสอบรูปแบบการดูดกลืนที่ผิดปกติ
2. ใช้วิธีฟลูออโรเมตริกเช่น Qubit ซึ่งมีผลกระทบน้อยกว่าสีของตัวอย่าง
3. ทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์มากขึ้นเพื่อกำจัดสารประกอบที่มีสี
4. ใช้การแก้ไขทางคณิตศาสตร์หากสเปกตรัมการดูดกลืนของสารที่รบกวนเป็นที่รู้จัก

ปริมาณขั้นต่ำที่ต้องการสำหรับการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอคืออะไร?

ปริมาณขั้นต่ำขึ้นอยู่กับอุปกรณ์ที่ใช้:

• สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบดั้งเดิมที่ใช้หลอดทดลองมักต้องการ 50-100 μL
• สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครวอลุ่มเช่น NanoDrop ต้องการเพียง 0.5-2 μL
• วิธีฟลูออโรเมตริกมักต้องการ 1-20 μL ของตัวอย่างบวกกับปริมาณสารเคมี
• เครื่องอ่านไมโครเพลตมักใช้ 100-200 μL ต่อหลุม

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครวอลุ่มได้ปฏิวัติการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดยอนุญาตให้มีการวัดตัวอย่างที่มีค่าใช้จ่ายน้อยด้วยปริมาณขั้นต่ำ

ฉันจะคำนวณปัจจัยการเจือจางได้อย่างไร?

ปัจจัยการเจือจางคำนวณได้จาก:

$\text{Dilution Factor} = \frac{\text{Total Volume (Sample + Diluent)}}{\text{Sample Volume}}$

ตัวอย่างเช่น:

• หากคุณเพิ่ม 1 μL ของดีเอ็นเอไปยัง 99 μL ของบัฟเฟอร์ ปัจจัยการเจือจางคือ 100
• หากคุณเพิ่ม 5 μL ของดีเอ็นเอไปยัง 45 μL ของบัฟเฟอร์ ปัจจัยการเจือจางคือ 10
• หากใช้ดีเอ็นเอที่ไม่ได้เจือจาง ปัจจัยการเจือจางคือ 1

ให้ใช้บัฟเฟอร์เดียวกันสำหรับการเจือจางที่ใช้ในการวัดสเปกโตรโฟโตเมตริก

ฉันจะแปลงระหว่างหน่วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันได้อย่างไร?

การแปลงหน่วยความเข้มข้นของดีเอ็นเอทั่วไป:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM ของดีเอ็นเอที่มีความยาว 1000 bp ≈ 660 ng/μL

ในการแปลงจากความเข้มข้นมวล (ng/μL) เป็นความเข้มข้นโมเลกุล (nM) สำหรับชิ้นส่วนดีเอ็นเอ:

$\text{Concentration (nM)} = \frac{\text{Concentration (ng/μL)} \times 10^6}{\text{DNA length (bp)} \times 660}$

อะไรบ้างที่อาจทำให้การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอไม่ถูกต้อง?

ปัจจัยหลายประการอาจทำให้การวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอไม่ถูกต้อง:

1. การปนเปื้อน: โปรตีน ฟีนอล กัวนิดีน หรือสารเคมีอื่น ๆ ที่ใช้ในการสกัดอาจส่งผลต่อการดูดกลืน
2. ฟองอากาศ: ฟองอากาศในเส้นทางแสงอาจทำให้การอ่านค่าผิดพลาด
3. การเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ: ดีเอ็นเอที่แตกเป็นชิ้นอาจมีคุณสมบัติการดูดกลืนที่เปลี่ยนแปลง
4. การอ้างอิงที่ไม่ถูกต้อง: การใช้บัฟเฟอร์ที่แตกต่างกันสำหรับการอ้างอิงจากที่ใช้ในการละลายดีเอ็นเอ
5. สารละลายที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน: สารละลายดีเอ็นเอที่ผสมไม่ดีให้การอ่านค่าที่ไม่สอดคล้องกัน
6. การสอบเทียบอุปกรณ์: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ไม่ได้สอบเทียบหรือสกปรกให้ผลลัพธ์ที่ไม่น่าเชื่อถือ
7. การวัดที่อยู่นอกช่วงเชิงเส้น: ค่าการดูดกลืนที่สูงหรือต่ำเกินไปอาจไม่ถูกต้อง

ฉันสามารถใช้เครื่องคำนวณนี้สำหรับความเข้มข้นของ RNA ได้หรือไม่?

แม้ว่าเครื่องคำนวณนี้จะถูกปรับให้เหมาะสมสำหรับดีเอ็นเอแบบสายคู่ (โดยใช้ปัจจัยการแปลง 50 ng/μL) แต่คุณสามารถปรับใช้สำหรับ RNA ได้โดย:

1. วัด A260 ตามปกติ
2. คูณด้วย 40 แทนที่จะเป็น 50 (ปัจจัยการแปลงเฉพาะสำหรับ RNA)
3. ใช้ปัจจัยการเจือจางที่เหมาะสม

สูตรสำหรับ RNA จะเป็น: $\text{RNA Concentration (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Dilution Factor}$

อ้างอิง

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

พร้อมที่จะคำนวณความเข้มข้นของดีเอ็นเอของคุณแล้วหรือยัง? ใช้เครื่องคำนวณของเราเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำทันที เพียงป้อนการอ่านค่าการดูดกลืน ปริมาณ และปัจจัยการเจือจางเพื่อกำหนดทั้งความเข้มข้นและปริมาณรวมของดีเอ็นเอในตัวอย่างของคุณ