DNA Ligation Calculator

Introduction

DNA ligation เป็นเทคนิคทางชีววิทยโมเลกุลที่สำคัญที่ใช้ในการเชื่อมต่อ DNA fragments เข้าด้วยกันด้วยพันธะโควาเลนต์ เครื่องมือ DNA Ligation Calculator เป็นเครื่องมือที่จำเป็นสำหรับนักวิจัย ช่วยในการกำหนดปริมาณที่เหมาะสมของ vector และ insert DNA ที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาการ ligation ที่ประสบความสำเร็จ โดยการคำนวณอัตราส่วนโมลาร์ที่ถูกต้องระหว่าง vector (plasmid) และ DNA fragments insert เครื่องมือนี้ช่วยให้การทดลองการโคลนนิ่งโมเลกุลมีประสิทธิภาพในขณะที่ลดการใช้สารเคมีที่ไม่จำเป็นและปฏิกิริยาที่ล้มเหลว

ปฏิกิริยาการ ligation เป็นพื้นฐานของวิศวกรรมพันธุกรรม ชีววิทยาสังเคราะห์ และขั้นตอนการโคลนนิ่งโมเลกุล พวกเขาอนุญาตให้นักวิทยาศาสตร์สร้างโมเลกุล DNA ที่ประกอบใหม่โดยการแทรกยีนที่สนใจลงใน plasmid vectors เพื่อการเปลี่ยนถ่ายเข้าสู่สิ่งมีชีวิตโฮสต์ในภายหลัง ความสำเร็จของปฏิกิริยาเหล่านี้ขึ้นอยู่กับการใช้ปริมาณ DNA ที่เหมาะสม ซึ่งเป็นสิ่งที่เครื่องมือนี้ช่วยกำหนด

ไม่ว่าคุณจะสร้าง expression vectors, สร้าง gene libraries, หรือทำการ subcloning ตามปกติ เครื่องคำนวณ DNA ligation นี้จะช่วยให้คุณปรับแต่งเงื่อนไขการทดลองของคุณและเพิ่มอัตราความสำเร็จของคุณ โดยการป้อนพารามิเตอร์หลักบางอย่างเกี่ยวกับตัวอย่าง DNA ของคุณ คุณสามารถรับปริมาณที่แน่นอนที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาการ ligation เฉพาะของคุณได้อย่างรวดเร็ว

Formula/Calculation

เครื่องคำนวณ DNA ligation ใช้สูตรทางชีววิทยโมเลกุลพื้นฐานที่คำนึงถึงขนาดและความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ DNA fragments ที่ถูกเชื่อมต่อ การคำนวณหลักจะกำหนดว่าจำเป็นต้องใช้ insert DNA เท่าใดเมื่อเปรียบเทียบกับ vector DNA ตามความยาวที่เกี่ยวข้องและอัตราส่วนโมลาร์ที่ต้องการ

Insert Amount Calculation

ปริมาณของ insert DNA ที่จำเป็น (ในหน่วยนาโนกรัม) จะถูกคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

ที่ไหน:

• ng of vector = ปริมาณของ vector DNA ที่ใช้ในปฏิกิริยา (โดยปกติ 50-100 ng)
• kb size of insert = ความยาวของ DNA fragment insert ในหน่วยกิโลเบส (kb)
• kb size of vector = ความยาวของ DNA vector ในหน่วยกิโลเบส (kb)
• molar ratio = อัตราส่วนที่ต้องการของโมเลกุล insert ต่อโมเลกุล vector (โดยปกติ 3:1 ถึง 5:1)

Volume Calculations

เมื่อปริมาณที่ต้องการของ insert DNA ถูกกำหนดแล้ว ปริมาณที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาจะถูกคำนวณ:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Example Calculation

มาทำการคำนวณตัวอย่างกัน:

• ความเข้มข้นของ vector: 50 ng/μL
• ความยาวของ vector: 3000 bp (3 kb)
• ความเข้มข้นของ insert: 25 ng/μL
• ความยาวของ insert: 1000 bp (1 kb)
• อัตราส่วนโมลาร์ที่ต้องการ (insert:vector): 3:1
• ปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด: 20 μL
• ปริมาณ vector ที่จะใช้: 50 ng

ขั้นตอนที่ 1: คำนวณปริมาณ insert ที่ต้องการ $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

ขั้นตอนที่ 2: คำนวณปริมาณ $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

การคำนวณนี้ช่วยให้มั่นใจว่ามีโมเลกุล insert สามโมเลกุลสำหรับโมเลกุล vector หนึ่งโมเลกุลในปฏิกิริยา ซึ่งเพิ่มโอกาสในการ ligation ที่ประสบความสำเร็จ

Step-by-Step Guide to Using the Calculator

เครื่องคำนวณ DNA Ligation ของเราออกแบบมาให้ใช้งานง่ายและตรงไปตรงมา ปฏิบัติตามขั้นตอนเหล่านี้เพื่อคำนวณปริมาณที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาการ ligation ของคุณ:

1. ป้อนข้อมูล Vector:

   • ป้อนความเข้มข้นของ vector ของคุณใน ng/μL
   • ป้อนความยาวของ vector ในหน่วยฐานคู่ (bp)
   • ระบุปริมาณ DNA vector ที่คุณต้องการใช้ในปฏิกิริยา (ng)

2. ป้อนข้อมูล Insert:

   • ป้อนความเข้มข้นของ insert ของคุณใน ng/μL
   • ป้อนความยาวของ insert ในหน่วยฐานคู่ (bp)

3. ตั้งค่าพารามิเตอร์การทดลอง:

   • ระบุอัตราส่วนโมลาร์ที่ต้องการ (insert:vector) - โดยปกติอยู่ระหว่าง 3:1 ถึง 5:1
   • ป้อนปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมดใน μL (โดยปกติ 10-20 μL)

4. ดูผลลัพธ์:

   • เครื่องคำนวณจะแสดงผลโดยอัตโนมัติ:
     • ปริมาณ vector ที่ต้องการ (μL)
     • ปริมาณ insert ที่ต้องการ (μL)
     • ปริมาณ buffer/water ที่ต้องเพิ่ม (μL)
     • ปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด (μL)
     • ปริมาณของ vector และ insert DNA ในปฏิกิริยา (ng)

5. คัดลอกผลลัพธ์ (ถ้าต้องการ):

   • ใช้ปุ่ม "คัดลอกผลลัพธ์" เพื่อคัดลอกการคำนวณทั้งหมดไปยังคลิปบอร์ดสำหรับสมุดบันทึกหรือลำดับการทดลองของคุณ

เครื่องคำนวณจะทำการตรวจสอบความถูกต้องเพื่อให้แน่ใจว่าข้อมูลทั้งหมดเป็นหมายเลขบวกและปริมาณทั้งหมดเพียงพอสำหรับปริมาณ DNA ที่จำเป็น หากตรวจพบข้อผิดพลาดใด ๆ ข้อความแสดงข้อผิดพลาดที่เป็นประโยชน์จะช่วยแนะนำคุณในการแก้ไขข้อมูล

Use Cases

เครื่องคำนวณ DNA Ligation มีค่าใช้จ่ายในแอปพลิเคชันทางชีววิทยโมเลกุลหลายประการ:

Molecular Cloning

กรณีการใช้งานที่พบบ่อยที่สุดคือการโคลนนิ่งโมเลกุลมาตรฐาน ซึ่งนักวิจัยจะใส่ยีนหรือ DNA fragments ลงใน plasmid vectors เครื่องคำนวณช่วยให้มั่นใจในเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับ:

• การ subcloning ยีนระหว่าง expression vectors ที่แตกต่างกัน
• การสร้างโปรตีนฟิวชันโดยการเชื่อมต่อหลาย fragment ยีน
• การสร้างการทดสอบยีนรายงาน
• การสร้าง plasmid libraries

Synthetic Biology

ในชีววิทยาสังเคราะห์ ซึ่งมักมีการประกอบ DNA หลายชิ้น:

• ปฏิกิริยา Gibson Assembly ได้รับประโยชน์จากอัตราส่วน insert:vector ที่แม่นยำ
• ระบบ Golden Gate assembly ต้องการความเข้มข้นของ DNA ที่เฉพาะเจาะจง
• การประกอบ BioBrick ของชิ้นส่วนทางพันธุกรรมที่ได้มาตรฐาน
• การสร้างวงจรพันธุกรรมสังเคราะห์

Diagnostic Kit Development

เมื่อพัฒนาชุดตรวจทางโมเลกุล:

• การโคลนนิ่งของเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่เฉพาะเจาะจงต่อโรค
• การสร้าง plasmids ควบคุมเชิงบวก
• การพัฒนามาตรฐานการสอบเทียบสำหรับ qPCR

Protein Expression Systems

สำหรับนักวิจัยที่ทำงานเกี่ยวกับการผลิตโปรตีน:

• การปรับแต่งอัตราส่วน insert:vector สำหรับ expression vectors ที่มีความเข้มข้นสูง
• การสร้างระบบการแสดงออกที่สามารถกระตุ้นได้
• การสร้าง vectors สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน

CRISPR-Cas9 Applications

ในแอปพลิเคชันการแก้ไขจีโนม:

• การโคลนนิ่ง guide RNA ลงใน vectors CRISPR
• การสร้างเทมเพลตผู้บริจาคสำหรับการซ่อมแซมที่กำหนดโดยความเหมือน
• การสร้างห้องสมุดของ guide RNA สำหรับการคัดกรอง

Challenging Ligations

เครื่องคำนวณมีค่าโดยเฉพาะสำหรับสถานการณ์การ ligation ที่ท้าทาย:

• การโคลนนิ่ง insert ขนาดใหญ่ (>5 kb)
• การแทรก fragment ขนาดเล็กมาก (<100 bp)
• การ ligation แบบ blunt-end ที่มีประสิทธิภาพต่ำกว่า
• การประกอบหลาย fragment

Alternatives

ในขณะที่เครื่องคำนวณ DNA Ligation ของเรามีการคำนวณที่แม่นยำสำหรับปฏิกิริยาการ ligation แบบดั้งเดิม แต่ก็มีวิธีการทางเลือกหลายประการในการเชื่อมต่อ DNA fragments:

1. Gibson Assembly: ใช้เอนไซม์ exonuclease, polymerase, และ ligase ในปฏิกิริยาในหลอดเดียวเพื่อเชื่อมต่อ DNA fragments ที่มีการทับซ้อนกัน ไม่จำเป็นต้องคำนวณการ ligation แบบดั้งเดิม แต่ยังคงมีความสำคัญในอัตราส่วนความเข้มข้น

2. Golden Gate Assembly: ใช้เอนไซม์การตัดประเภท IIS สำหรับการประกอบที่มีทิศทางและไม่มีรอยแผลจากการเชื่อมต่อหลาย fragment ต้องการปริมาณที่เท่ากันของทุก fragment

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): ใช้เอนไซม์ exonuclease เพื่อสร้าง overhangs แบบสายเดี่ยวที่เชื่อมต่อกัน โดยปกติจะใช้อัตราส่วนที่เท่ากันของ fragment

4. In-Fusion Cloning: ระบบเชิงพาณิชย์ที่อนุญาตให้เชื่อมต่อ fragment ที่มีการทับซ้อนกัน 15 bp ใช้อัตราส่วนเฉพาะตามขนาด fragment

5. Gateway Cloning: ใช้การ recombination ที่เฉพาะเจาะจงแทนการ ligation ต้องการ vectors ที่เป็นจุดเข้าและจุดปลายที่เฉพาะเจาะจง

6. Empirical Testing: ห้องปฏิบัติการบางแห่งชอบที่จะตั้งค่าปฏิกิริยา ligation หลายชุดด้วยอัตราส่วน insert:vector ที่แตกต่างกัน (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) และกำหนดว่าสิ่งใดทำงานได้ดีที่สุดสำหรับการสร้างที่เฉพาะเจาะจง

7. Software Calculators: แพ็คเกจซอฟต์แวร์เชิงพาณิชย์เช่น Vector NTI และ SnapGene รวมถึงเครื่องคำนวณการ ligation พร้อมฟีเจอร์เพิ่มเติมเช่นการวิเคราะห์ไซต์การตัด

History

การพัฒนาการคำนวณ DNA ligation ขนานไปกับการพัฒนาทางเทคนิคการโคลนนิ่งโมเลกุล ซึ่งได้ปฏิวัติวงการชีววิทยโมเลกุลและเทคโนโลยีชีวภาพ

Early Developments (1970s)

แนวคิดเกี่ยวกับ DNA ligation สำหรับการโคลนนิ่งโมเลกุลเกิดขึ้นในช่วงต้นปี 1970 โดยมีการทำงานที่เป็นแนวหน้าของ Paul Berg, Herbert Boyer, และ Stanley Cohen ซึ่งพัฒนาโมเลกุล DNA ที่ประกอบใหม่เป็นครั้งแรก ในช่วงเวลานี้ ปฏิกิริยาการ ligation ส่วนใหญ่เป็นแบบเชิงทดลอง โดยนักวิจัยใช้การทดลองและความผิดพลาดในการกำหนดเงื่อนไขที่เหมาะสม

การค้นพบเอนไซม์การตัดและ DNA ligase ได้มอบเครื่องมือที่จำเป็นสำหรับการตัดและเชื่อมต่อโมเลกุล DNA T4 DNA ligase ซึ่งแยกได้จาก E. coli ที่ติดเชื้อ T4 bacteriophage กลายเป็นเอนไซม์มาตรฐานสำหรับการเชื่อมต่อ DNA fragments เนื่องจากสามารถ ligate ได้ทั้งปลาย blunt และ cohesive

Refinement Period (1980s-1990s)

เมื่อการโคลนนิ่งโมเลกุลกลายเป็นเรื่องปกติ นักวิจัยเริ่มพัฒนาวิธีการที่เป็นระบบมากขึ้นสำหรับปฏิกิริยาการ ligation ความสำคัญของอัตราส่วนโมลาร์ระหว่าง vector และ insert DNA เริ่มชัดเจน นำไปสู่การพัฒนาสูตรพื้นฐานที่ยังคงใช้ในปัจจุบัน

ในช่วงเวลานี้ นักวิจัยได้ตั้งข้อสังเกตว่าการใช้ insert DNA ที่มากเกินไป (โดยปกติ 3:1 ถึง 5:1 อัตราส่วนโมลาร์ของ insert ต่อ vector) มักจะปรับปรุงประสิทธิภาพการ ligation สำหรับแอปพลิเคชันการโคลนนิ่งมาตรฐาน ข้อมูลนี้ถูกแบ่งปันในเอกสารทางห้องปฏิบัติการและค่อยๆ แทรกซึมเข้าไปในคู่มือและตำราเรียนทางชีววิทยโมเลกุล

Modern Era (2000s-Present)

การเกิดขึ้นของเครื่องมือคอมพิวเตอร์และเครื่องคำนวณออนไลน์ในปี 2000 ทำให้การคำนวณการ ligation ที่แม่นยำเข้าถึงได้มากขึ้นสำหรับนักวิจัย เมื่อเทคนิคทางชีววิทยโมเลกุลมีความซับซ้อนมากขึ้น ความจำเป็นในการคำนวณที่แม่นยำก็มีความสำคัญมากขึ้น โดยเฉพาะสำหรับโครงการการโคลนนิ่งที่ท้าทายซึ่งเกี่ยวข้องกับหลาย fragment หรือ insert ขนาดใหญ่

ในปัจจุบัน การคำนวณ DNA ligation เป็นส่วนสำคัญของเวิร์กโฟลว์การโคลนนิ่งโมเลกุล โดยมีเครื่องคำนวณเฉพาะเช่นเครื่องนี้ช่วยให้นักวิจัยปรับแต่งการทดลองของพวกเขา สูตรพื้นฐานยังคงไม่เปลี่ยนแปลงมากนัก แม้ว่าความเข้าใจของเราที่มีต่อปัจจัยที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพการ ligation จะดีขึ้น

การเกิดขึ้นของวิธีการโคลนนิ่งทางเลือกเช่น Gibson Assembly และ Golden Gate cloning ได้แนะนำความต้องการการคำนวณใหม่ แต่แนวคิดพื้นฐานของอัตราส่วนโมลาร์ระหว่าง DNA fragments ยังคงมีความสำคัญในเทคนิคเหล่านี้

Code Examples

นี่คือตัวอย่างการใช้งานของเครื่องคำนวณ DNA ligation ในหลายภาษาโปรแกรม:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculate required insert amount in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculate vector volume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculate insert volume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculate buffer/water volume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Usage example in a cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calculate volumes for a DNA ligation reaction.
5    
6    Parameters:
7    vector_concentration (float): Concentration of vector DNA in ng/μL
8    vector_length (float): Length of vector DNA in base pairs
9    insert_concentration (float): Concentration of insert DNA in ng/μL
10    insert_length (float): Length of insert DNA in base pairs
11    molar_ratio (float): Desired molar ratio of insert:vector
12    total_volume (float): Total reaction volume in μL
13    vector_amount (float): Amount of vector DNA to use in ng (default: 50)
14    
15    Returns:
16    dict: Dictionary containing calculated volumes and amounts
17    """
18    # Calculate vector volume
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calculate required insert amount
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calculate insert volume
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calculate buffer/water volume
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Example usage
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convert lengths to kb for calculation
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calculate required insert amount
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calculate volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Example usage
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convert lengths to kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calculate required insert amount
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calculate volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Round to 2 decimal places
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convert lengths to kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calculate required insert amount
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calculate volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Round to 2 decimal places
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Frequently Asked Questions (FAQ)

What is the optimal molar ratio for DNA ligation?

อัตราส่วนโมลาร์ที่เหมาะสมของ insert ต่อ vector มักอยู่ระหว่าง 3:1 ถึง 5:1 สำหรับแอปพลิเคชันการ ligation แบบมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้อาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับสถานการณ์การ ligation ที่เฉพาะเจาะจง:

• สำหรับการ ligation แบบ blunt-end: 3:1 ถึง 5:1
• สำหรับการ ligation แบบ sticky-end: 1:1 ถึง 3:1
• สำหรับการ insert ขนาดใหญ่ (>10 kb): 1:1 ถึง 2:1
• สำหรับการ insert ขนาดเล็ก (<500 bp): 5:1 ถึง 10:1
• สำหรับการประกอบหลาย fragment: 3:1 สำหรับแต่ละ insert ต่อ vector

Why is my ligation reaction failing despite using the calculated volumes?

หลายปัจจัยสามารถส่งผลต่อประสิทธิภาพการ ligation นอกเหนือจากอัตราส่วนโมลาร์:

1. คุณภาพ DNA: ตรวจสอบให้แน่ใจว่า vector และ insert ทั้งคู่มีปลายที่สะอาดและไม่มีความเสียหาย
2. Dephosphorylation: ตรวจสอบว่า vector ของคุณถูก dephosphorylated หรือไม่ ซึ่งป้องกันการ ligation ตัวเอง
3. กิจกรรมของเอนไซม์: ตรวจสอบให้แน่ใจว่า ligase ของคุณยังมีประสิทธิภาพและใช้ที่อุณหภูมิที่ถูกต้อง
4. เวลาในการเพาะเลี้ยง: การ ligation บางอย่างได้รับประโยชน์จากการเพาะเลี้ยงที่ยาวนานขึ้น (ข้ามคืนที่ 16°C)
5. สภาพบัฟเฟอร์: ตรวจสอบให้แน่ใจว่าใช้บัฟเฟอร์ที่ถูกต้องพร้อม ATP
6. สารปนเปื้อน: ทำความสะอาด DNA เพื่อขจัดสารยับยั้งเช่น EDTA หรือเกลือสูง

How much vector DNA should I use in a ligation reaction?

โดยทั่วไปแนะนำให้ใช้ DNA vector 50-100 ng สำหรับปฏิกิริยาการ ligation แบบมาตรฐาน การใช้ vector มากเกินไปอาจนำไปสู่พื้นหลังที่สูงขึ้นของ vector ที่ไม่ได้ตัดหรือ self-ligated ในขณะที่ใช้ไม่เพียงพออาจลดประสิทธิภาพการเปลี่ยนถ่าย สำหรับการ ligation ที่ท้าทาย คุณอาจต้องปรับแต่งปริมาณนี้

Should I adjust calculations for blunt-end versus sticky-end ligations?

ใช่ การ ligation แบบ blunt-end โดยทั่วไปมีประสิทธิภาพน้อยกว่าการ ligation แบบ sticky-end (cohesive-end) สำหรับการ ligation แบบ blunt-end ให้ใช้:

• อัตราส่วนโมลาร์ที่สูงขึ้น (3:1 ถึง 5:1 หรือสูงกว่า)
• T4 DNA ligase ที่มากขึ้น (โดยปกติ 2-3 เท่า)
• เวลาในการเพาะเลี้ยงที่นานขึ้น
• พิจารณาเพิ่ม PEG เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการ ligation

How do I calculate ligation for multiple inserts?

สำหรับการประกอบหลาย fragment:

1. คำนวณปริมาณ insert แต่ละชิ้นแยกกันโดยใช้สูตรเดียวกัน
2. รักษาอัตราส่วนโมลาร์ทั้งหมดให้เท่ากัน (เช่น สำหรับ insert สองชิ้น ใช้ 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vector)
3. ปรับปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมดเพื่อรองรับ DNA fragments ทั้งหมด
4. พิจารณาการ ligation ทีละขั้นตอนหรือใช้วิธีการประกอบเช่น Gibson Assembly สำหรับหลาย fragment

Can I use this calculator for Gibson Assembly or Golden Gate Assembly?

เครื่องคำนวณนี้ออกแบบมาเฉพาะสำหรับการโคลนนิ่งแบบดั้งเดิมที่ใช้เอนไซม์การตัดและ ligase สำหรับ Gibson Assembly อัตราส่วนที่เท่ากันของทุก fragment มักจะถูกแนะนำ (1:1) แม้ว่าการคำนวณพื้นฐานของปริมาณ DNA ตามความยาวจะคล้ายกัน สำหรับ Golden Gate Assembly อัตราส่วนที่เท่ากันของส่วนประกอบทั้งหมดจะถูกใช้เช่นกัน

How do I account for vector dephosphorylation in my calculations?

การ dephosphorylation ของ vector (การลบกลุ่มฟอสเฟต 5') ป้องกันการ ligation ตัวเอง แต่ไม่เปลี่ยนแปลงการคำนวณปริมาณ อย่างไรก็ตาม สำหรับ vector ที่ dephosphorylated:

1. ใช้ DNA insert ที่สดใหม่พร้อมฟอสเฟต 5' ที่สมบูรณ์
2. พิจารณาใช้อัตราส่วน insert:vector ที่สูงขึ้นเล็กน้อย (4:1 ถึง 6:1)
3. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าใช้เวลาการ ligation ที่นานขึ้น (อย่างน้อย 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือตลอดคืนที่ 16°C)

What's the minimum total reaction volume I should use?

ปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมดที่เหมาะสมที่สุดมักอยู่ที่ประมาณ 10 μL ซึ่งช่วยให้การผสมมีความเพียงพอและป้องกันปัญหาการระเหย หากปริมาณ DNA ที่คำนวณของคุณเกินปริมาณปฏิกิริยาที่ต้องการ คุณมีตัวเลือกหลายประการ:

1. ใช้ตัวอย่าง DNA ที่มีความเข้มข้นสูงขึ้น
2. ลดปริมาณของ vector ที่ใช้ (เช่น 25 ng แทนที่จะเป็น 50 ng)
3. เพิ่มปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด
4. พิจารณาการทำให้เข้มข้นตัวอย่าง DNA ของคุณ

How long should I incubate my ligation reaction?

เวลาการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมแตกต่างกันไปตามประเภทการ ligation:

• การ ligation แบบ sticky-end: 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (22-25°C) หรือ 4-16 ชั่วโมงที่ 16°C
• การ ligation แบบ blunt-end: 2-4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือข้ามคืน (12-16 ชั่วโมง) ที่ 16°C
• การ ligation แบบด่วน (ใช้ ligase ที่มีความเข้มข้นสูง): 5-15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง

Can I reuse leftover ligation reaction for transformation?

ใช่ ส่วนผสมการ ligation สามารถเก็บไว้ที่ -20°C และนำกลับมาใช้ใหม่สำหรับการเปลี่ยนถ่ายได้ อย่างไรก็ตาม การละลายและแช่แข็งแต่ละครั้งอาจลดประสิทธิภาพ สำหรับผลลัพธ์ที่ดีที่สุด:

1. แบ่งปันส่วนผสมการ ligation ก่อนการแช่แข็ง
2. ทำให้ ligase ไม่มีประสิทธิภาพ (65°C เป็นเวลา 10 นาที) ก่อนการเก็บรักษา
3. ใช้ภายใน 1-2 เดือนเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

References

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/