Υπολογιστής Αραίωσης Κυττάρων

Ένας υπολογιστής αραίωσης κυττάρων βρίσκει πόσο κυτταρικό εναιώρημα και πόσο αραιωτικό πρέπει να αναμειχθούν, ώστε να επιτευχθεί η επιθυμητή συγκέντρωση κυττάρων σε επιλεγμένο τελικό όγκο. Χρησιμοποιείται σε κυτταροκαλλιέργειες, στη μικροβιολογία και σε άλλες εργαστηριακές διαδικασίες, όταν ένα δείγμα πρέπει να προσαρμοστεί σε ακριβή συγκέντρωση πριν από τη χρήση του.

Τι σημαίνει αραίωση κυττάρων

Η αραίωση ενός κυτταρικού εναιωρήματος δεν αλλάζει πόσα κύτταρα περιέχει. Αλλάζει μόνο τον όγκο μέσα στον οποίο βρίσκονται τα κύτταρα, μειώνοντας έτσι τη συγκέντρωση. Ένα εναιώρημα που μετρήθηκε ως 1.000.000 κύτταρα ανά χιλιοστόλιτρο (κύτταρα/mL) εξακολουθεί να περιέχει τον ίδιο συνολικό αριθμό κυττάρων μετά την αραίωση. Ο αριθμός αυτός απλώς κατανέμεται σε μεγαλύτερη ποσότητα υγρού.

Τα εργαστήρια αραιώνουν κύτταρα πριν από πολλά συνήθη στάδια: τη μεταφορά μιας αναπτυσσόμενης καλλιέργειας σε νέες φιάλες, την τοποθέτηση προκαθορισμένου αριθμού κυττάρων σε κάθε κοιλότητα μιας πλάκας, την κατάψυξη κυττάρων για αποθήκευση ή την προετοιμασία δείγματος για μετρητή κυττάρων ή κυτταρόμετρο ροής.

Τύπος αραίωσης κυττάρων

Ο υπολογισμός βασίζεται σε έναν κανόνα. Ο αριθμός των κυττάρων που λαμβάνονται από το αρχικό εναιώρημα, πολλαπλασιασμένος με τη συγκέντρωσή του, πρέπει να ισούται με τον αριθμό των κυττάρων στον τελικό όγκο, πολλαπλασιασμένο με την επιθυμητή συγκέντρωση:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — αρχική συγκέντρωση, σε κύτταρα/mL
V₁ — όγκος του αρχικού εναιωρήματος που θα χρησιμοποιηθεί, σε mL
C₂ — επιθυμητή συγκέντρωση, σε κύτταρα/mL
V₂ — απαιτούμενος συνολικός τελικός όγκος, σε mL

Λύνοντας ως προς V₁ προκύπτει ο όγκος του αρχικού εναιωρήματος που πρέπει να ληφθεί με πιπέτα:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Το υπόλοιπο του τελικού όγκου είναι αραιωτικό, συνήθως θρεπτικό μέσο κυτταροκαλλιέργειας, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) ή άλλο ρυθμιστικό διάλυμα:

Όγκος αραιωτικού = V₂ − V₁

Η επιθυμητή συγκέντρωση (C₂) δεν μπορεί να είναι ποτέ υψηλότερη από την αρχική συγκέντρωση (C₁). Η αραίωση μειώνει μόνο τη συγκέντρωση. Για την αύξησή της απαιτείται φυγοκέντρηση των κυττάρων και επαναιώρησή τους σε μικρότερη ποσότητα υγρού.

Πώς υπολογίζεται η αραίωση κυττάρων

Μετρήστε το αρχικό εναιώρημα με αιμοκυτταρόμετρο ή αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων, για να βρείτε το C₁.
Σημειώστε την απαιτούμενη από το πρωτόκολλο επιθυμητή συγκέντρωση, C₂.
Καθορίστε τον απαιτούμενο συνολικό τελικό όγκο, V₂.
Υπολογίστε το V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Υπολογίστε τον όγκο του αραιωτικού ως V₂ − V₁.
Μεταφέρετε με πιπέτα V₁ από το αρχικό εναιώρημα σε σωληνάριο και στη συνέχεια προσθέστε τον όγκο του αραιωτικού, δηλαδή μέσο ή ρυθμιστικό διάλυμα.

Λυμένο παράδειγμα

Ένα αρχικό εναιώρημα μετράται ως 1.000.000 κύτταρα/mL. Ένα πρωτόκολλο απαιτεί 100.000 κύτταρα/mL σε τελικό όγκο 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Όγκος αραιωτικού = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Η λήψη 1 mL από το αρχικό εναιώρημα και η προσθήκη 9 mL μέσου δίνουν 10 mL εναιωρήματος με 100.000 κύτταρα/mL.

Δεύτερο παράδειγμα

Μια δοκιμασία σε πλάκα 96 κοιλοτήτων χρειάζεται 10.000 κύτταρα ανά κοιλότητα σε 200 μικρολίτρα (μL) μέσου ανά κοιλότητα. Αυτό αντιστοιχεί σε επιθυμητή συγκέντρωση 50.000 κύτταρα/mL, επειδή 10.000 κύτταρα διαιρεμένα με 0,2 mL ισούνται με 50.000 κύτταρα/mL. Το αρχικό εναιώρημα έχει μετρηθεί ως 2.000.000 κύτταρα/mL και χρειάζονται συνολικά 20 mL για να καλυφθεί η πλάκα, με κάποια επιπλέον ποσότητα για απώλειες κατά τη μεταφορά με πιπέτα.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Όγκος αραιωτικού = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Η ανάμειξη 0,5 mL από το αρχικό εναιώρημα με 19,5 mL μέσου δίνει 20 mL με 50.000 κύτταρα/mL, δηλαδή αραίωση 1 προς 40.

Πηγές σφάλματος

Ο ίδιος ο τύπος είναι ακριβής. Τα σφάλματα προέρχονται από τους αριθμούς που εισάγονται σε αυτόν.

Σφάλμα καταμέτρησης. Μια λανθασμένη καταμέτρηση κυττάρων οδηγεί άμεσα σε λανθασμένη αραίωση. Η καταμέτρηση και των τεσσάρων γωνιακών τετραγώνων του πλέγματος του αιμοκυτταρομέτρου και ο υπολογισμός του μέσου όρου μειώνουν αυτόν τον κίνδυνο.
Συσσωματωμένα κύτταρα. Μια συστάδα κυττάρων φαίνεται ως ένα κύτταρο στο μικροσκόπιο, ενώ στην πραγματικότητα αποτελείται από πολλά, με αποτέλεσμα να μειώνει τη φαινομενική συγκέντρωση.
Εύρος πιπέτας. Μια πιπέτα που χρησιμοποιείται εκτός του ονομαστικού εύρους όγκου της δίνει ανακριβή αποτελέσματα. Μια πιπέτα 1000 μL ρυθμισμένη να διανείμει 5 μL δεν είναι αξιόπιστη· πρέπει να χρησιμοποιηθεί μικρότερη πιπέτα.
Σύγχυση μονάδων. Η ανάμειξη των μονάδων κύτταρα/mL και κύτταρα/μL προκαλεί σφάλμα χίλιες φορές μεγαλύτερο ή μικρότερο από το σωστό.
Νεκρά κύτταρα. Η ακατέργαστη καταμέτρηση κυττάρων περιλαμβάνει και τα νεκρά κύτταρα, εκτός αν χρησιμοποιήθηκε χρώση βιωσιμότητας, όπως το κυανούν της τρυπάνης. Αυτό μπορεί να υπερεκτιμήσει τον πραγματικό αριθμό των ζωντανών κυττάρων.

Περιορισμοί αυτού του υπολογιστή

Ο υπολογιστής απορρίπτει αριθμούς για τους οποίους δεν μπορεί να δώσει χρήσιμο αποτέλεσμα:

Κάθε τιμή πρέπει να είναι μεγαλύτερη από το μηδέν.
Η επιθυμητή συγκέντρωση δεν μπορεί να είναι υψηλότερη από την αρχική συγκέντρωση.
Η αρχική συγκέντρωση πρέπει να είναι ίση ή μικρότερη από 1 τρισεκατομμύριο κύτταρα/mL (1 × 10¹²).
Ο όγκος αρχικού εναιωρήματος που υπολογίζεται πρέπει να είναι τουλάχιστον 0,001 mL, δηλαδή 1 μικρολίτρο. Μικρότερη ποσότητα δεν μπορεί να ληφθεί με ακρίβεια με πιπέτα, οπότε ο υπολογιστής ζητά διαφορετικές τιμές. Η αύξηση του συνολικού όγκου συνήθως διορθώνει το πρόβλημα.

Οι όγκοι εμφανίζονται με δύο δεκαδικά ψηφία ή με τρία όταν ο όγκος του αρχικού εναιωρήματος είναι μικρότερος από 0,01 mL, ώστε ένας μικρός όγκος να μην εμφανίζεται ως 0,00 mL.

Συχνές ερωτήσεις

Ποιος είναι ο τύπος για την αραίωση κυττάρων;

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, όπου τα C₁ και C₂ είναι η αρχική και η επιθυμητή συγκέντρωση, ενώ τα V₁ και V₂ είναι ο όγκος που λαμβάνεται από το αρχικό εναιώρημα και ο συνολικός τελικός όγκος.

Μπορεί η επιθυμητή συγκέντρωση να είναι υψηλότερη από την αρχική;

Όχι. Η αραίωση μειώνει μόνο τη συγκέντρωση. Για την επίτευξη υψηλότερης συγκέντρωσης απαιτείται φυγοκέντρηση των κυττάρων και επαναιώρησή τους σε μικρότερο όγκο.

Ποιο υγρό πρέπει να χρησιμοποιείται για την αραίωση κυττάρων;

Χρησιμοποιείται πλήρες θρεπτικό μέσο καλλιέργειας όταν τα κύτταρα πρέπει να παραμείνουν υγιή για ώρες ή ημέρες, όπως πριν από τη σπορά σε πλάκα. Το PBS ή παρόμοιο ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα είναι κατάλληλο για σύντομες αραιώσεις, διάρκειας μικρότερης από περίπου 30 λεπτά, πριν από την περαιτέρω επεξεργασία των κυττάρων. Χρησιμοποιείται μέσο χωρίς ορό όταν οι πρωτεΐνες του ορού θα παρεμπόδιζαν μια επακόλουθη δοκιμασία.

Ισχύει αυτός ο τύπος για βακτήρια ή ζύμες;

Ναι. Η σχέση C₁V₁ = C₂V₂ ισχύει για κάθε εναιώρημα σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων που μετρώνται σε μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά χιλιοστόλιτρο (CFU/mL), των ζυμών και των ιικών σωματιδίων που μετρώνται σε μονάδες σχηματισμού πλακών ανά χιλιοστόλιτρο (PFU/mL), αρκεί να χρησιμοποιούνται οι ίδιες μονάδες και στις δύο πλευρές της εξίσωσης.

Πρέπει να υπολογίζονται τα νεκρά κύτταρα στην αραίωση;

Για τη σπορά ζωντανής καλλιέργειας πρέπει να υπολογίζονται μόνο τα βιώσιμα κύτταρα. Αν ένα εναιώρημα έχει 80% βιωσιμότητα, η βιώσιμη συγκέντρωσή του είναι 0,8 φορές ο συνολικός αριθμός κυττάρων και αυτή η βιώσιμη συγκέντρωση πρέπει να χρησιμοποιείται ως C₁.

Πώς μπορούν να πραγματοποιηθούν με ακρίβεια πολύ μεγάλες αραιώσεις;

Οι μεγάλες αραιώσεις, όπως 1 προς 1000, συνήθως γίνονται ως σειρά μικρότερων βημάτων που ονομάζονται διαδοχικές αραιώσεις. Τρεις διαδοχικές αραιώσεις 1 προς 10 επιτυγχάνουν συνολικά αραίωση 1 προς 1000, ενώ διατηρούν κάθε βήμα λήψης με πιπέτα εντός ακριβούς εύρους όγκου.

Υπολογιστής Αραίωσης Κυττάρων - Ακριβές Εργαλείο Εργαστηριακής Αραίωσης