Solujen Laimentamisen Laskuri - Tarkka Laboratorion Laimennustyökalu

Solulaimennuslaskuri

Solulaimennuslaskuri määrittää, kuinka paljon solususpensiota ja laimenninta sekoitetaan, jotta valitussa lopullisessa tilavuudessa saavutetaan haluttu solupitoisuus. Sitä käytetään soluviljelyssä, mikrobiologiassa ja muussa laboratoriotyössä, jossa näyte on saatettava täsmälliseen pitoisuuteen ennen käyttöä.

Mitä solujen laimentaminen tarkoittaa

Solususpension laimentaminen ei muuta sen sisältämien solujen määrää. Se muuttaa vain tilavuutta, jossa solut ovat, jolloin pitoisuus pienenee. Suspensio, jonka pitoisuudeksi on laskettu 1 000 000 solua millilitrassa, sisältää laimentamisen jälkeen edelleen saman kokonaismäärän soluja. Solut ovat vain jakautuneet suurempaan nestemäärään.

Laboratorioissa soluja laimennetaan ennen monia tavanomaisia työvaiheita: kasvavan viljelmän jakamista uusiin viljelypulloihin, tietyn solumäärän siementämistä levyn kuhunkin kuoppaan, solujen pakastamista säilytystä varten tai näytteen valmistamista solulaskuria tai virtaussytometriä varten.

Solujen laimennuskaava

Laskenta perustuu yhteen sääntöön. Varastosuspensiosta otetun solumäärän, kun se kerrotaan sen pitoisuudella, on oltava yhtä suuri kuin lopullisessa tilavuudessa oleva solumäärä kerrottuna tavoitepitoisuudella:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — lähtö- eli varastopitoisuus, solua/ml
• V₁ — käytettävän varastosuspension tilavuus, ml
• C₂ — tavoitepitoisuus, solua/ml
• V₂ — tarvittava lopullinen kokonaistilavuus, ml

Kun yhtälö ratkaistaan V₁:n suhteen, saadaan pipetoitavan varastosuspension tilavuus:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Lopullisen tilavuuden loppuosa on laimenninta, yleensä soluviljelymediumia, fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) tai muuta puskuria:

Laimennusaineen tilavuus = V₂ − V₁

Tavoitepitoisuus (C₂) ei voi koskaan olla suurempi kuin varastopitoisuus (C₁). Laimentaminen pienentää pitoisuutta. Sen suurentaminen edellyttää solujen sentrifugointia ja uudelleensuspendointia pienempään nestetilavuuteen.

Solujen laimennuksen laskeminen

1. Laske varastosuspension solut hemocytometrillä tai automaattisella solulaskurilla saadaksesi arvon C₁.
2. Merkitse protokollan edellyttämä tavoitepitoisuus C₂.
3. Päätä tarvittava lopullinen kokonaistilavuus V₂.
4. Laske V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Laske laimennintilavuudeksi V₂ − V₁.
6. Pipetoi V₁ varastosuspensiota putkeen ja lisää sitten mediumin tai puskurin laimennintilavuus.

Laskuesimerkki

Varastosuspension pitoisuudeksi on laskettu 1 000 000 solua/ml. Protokolla edellyttää pitoisuutta 100 000 solua/ml lopullisessa tilavuudessa 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Laimennintilavuus = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Kun 1 mL varastosuspensiota sekoitetaan 9 mL:aan mediumia, saadaan 10 mL suspensiota, jonka pitoisuus on 100 000 solua/ml.

Toinen esimerkki

96-kuoppalevyllä tehtävä määritys tarvitsee 10 000 solua kuoppaa kohden, ja kussakin kuopassa on 200 mikrolitraa (μL) mediumia. Tavoitepitoisuus on siis 50 000 solua/ml, koska 10 000 solua jaettuna tilavuudella 0,2 mL on 50 000 solua/ml. Varastosuspension pitoisuudeksi on laskettu 2 000 000 solua/ml, ja levyä varten tarvitaan yhteensä 20 mL, jotta pipetointihävikille jää hieman varaa.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Laimennintilavuus = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Kun 0,5 mL varastosuspensiota sekoitetaan 19,5 mL:aan mediumia, saadaan 20 mL suspensiota, jonka pitoisuus on 50 000 solua/ml ja laimennossuhde 1:40.

Virhelähteet

Kaava itsessään on täsmällinen. Virheet johtuvat siihen syötetyistä luvuista.

• Laskentavirhe. Virheellinen solulasku johtaa suoraan virheelliseen laimennokseen. Riskiä pienentää hemocytometrin ruudukon kaikkien neljän kulmaruudun laskeminen ja niiden keskiarvon käyttäminen.
• Solukertymät. Solukertymä näyttää mikroskoopissa yhdeltä solulta, vaikka siinä on todellisuudessa useita soluja, joten se pienentää näennäistä pitoisuutta.
• Pipetin käyttöalue. Nimellistilavuusalueen ulkopuolella käytetty pipetti antaa epätarkkoja tuloksia. 1000 μL:n pipetti, joka on säädetty annostelemaan 5 μL, ei ole luotettava; sen sijaan on käytettävä pienempää pipettiä.
• Yksiköiden sekoittuminen. Yksiköiden solua/ml ja solua/μl sekoittaminen aiheuttaa virheen, joka on tuhat kertaa liian suuri tai pieni.
• Kuolleet solut. Raakalaskenta sisältää kuolleet solut, ellei käytetty elinkelpoisuutta osoittavaa väriainetta, kuten Trypan-sinistä. Tällöin elävien solujen todellinen määrä voi näyttää liian suurelta.

Tämän laskurin rajoitukset

Laskuri hylkää luvut, joiden perusteella ei voida antaa hyödyllistä vastausta:

• Jokaisen arvon on oltava nollaa suurempi.
• Tavoitepitoisuus ei voi olla suurempi kuin lähtöpitoisuus.
• Lähtöpitoisuuden on oltava enintään 1 biljoonaa solua/ml (1 × 10¹²).
• Sen laskeman varastosuspension tilavuuden on oltava vähintään 0,001 mL eli 1 mikrolitra. Tätä pienempää määrää ei voi pipetoida tarkasti, joten laskuri pyytää käyttämään muita lukuja. Kokonaistilavuuden suurentaminen yleensä ratkaisee ongelman.

Tilavuudet näytetään kahden desimaalin tarkkuudella tai kolmen desimaalin tarkkuudella, jos varastotilavuus on alle 0,01 mL, jotta pieni tilavuus ei koskaan näy muodossa 0,00 mL.

Usein kysyttyä

Mikä on solujen laimennuksen kaava?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, jossa C₁ ja C₂ ovat lähtö- ja tavoitepitoisuudet ja V₁ ja V₂ ovat varastosuspensiosta otettu tilavuus ja lopullinen kokonaistilavuus.

Voiko tavoitepitoisuus olla suurempi kuin lähtöpitoisuus?

Ei. Laimentaminen pienentää pitoisuutta. Suuremman pitoisuuden saavuttaminen edellyttää solujen sentrifugointia ja uudelleensuspendointia pienempään tilavuuteen.

Mitä nestettä solujen laimentamiseen pitäisi käyttää?

Täydellistä kasvatusmediumia käytetään, kun solujen on säilyttävä elinkykyisinä tuntien tai päivien ajan, esimerkiksi ennen solujen siementämistä levylle. PBS tai vastaava puskuroitu suolaliuos sopii lyhytaikaiseen, noin 30 minuutin pituiseen laimennukseen ennen solujen jatkokäsittelyä. Seerumitonta mediumia käytetään, kun seerumin proteiinit häiritsisivät myöhempää määritystä.

Toimiiko tämä kaava bakteereille tai hiivalle?

Kyllä. C₁V₁ = C₂V₂ pätee kaikkiin hiukkassuspensioihin, mukaan lukien bakteerit, jotka mitataan pesäkkeitä muodostavina yksikköinä millilitrassa (CFU/ml), hiiva ja plakkia muodostavina yksikköinä millilitrassa (PFU/ml) mitattavat viruspartikkelit, kunhan yhtälön molemmilla puolilla käytetään samoja yksiköitä.

Pitäisikö kuolleet solut laskea mukaan laimennokseen?

Elävän viljelmän siementämisessä mukaan pitäisi laskea vain elinkelpoiset solut. Jos suspension elinkelpoisuus on 80 %, sen elinkelpoinen pitoisuus on 0,8 kertaa solujen kokonaismäärään perustuva pitoisuus, ja tätä elinkelpoista pitoisuutta pitäisi käyttää arvona C₁.

Miten erittäin suuret laimennokset voidaan valmistaa tarkasti?

Suuret laimennokset, kuten 1:1000, tehdään yleensä sarjana pienempiä vaiheita eli sarjalaimennoksina. Kolme peräkkäistä 1:10-laimennosta tuottaa kokonaislaimennokseksi 1:1000, ja jokainen pipetointivaihe pysyy tarkalle pipetoinnille sopivalla tilavuusalueella.