Sejt Hígítási Kalkulátor - Pontos Laboratóriumi Hígítási Eszköz

Sejthígítás-kalkulátor

A sejthígítás-kalkulátor kiszámítja, hogy mennyi sejtszuszpenziót és hígítóoldatot kell összekeverni a kívánt sejtkoncentráció eléréséhez egy megadott végső térfogatban. Sejttenyésztésben, mikrobiológiában és más laboratóriumi munkákban használják, amikor egy mintát felhasználás előtt pontos koncentrációra kell beállítani.

Mit jelent a sejthígítás?

A sejtszuszpenzió hígítása nem változtatja meg a benne lévő sejtek számát. Csak azt a térfogatot változtatja meg, amelyben a sejtek elhelyezkednek, így csökkenti a koncentrációt. Az 1 000 000 sejt/milliliter (sejt/ml) koncentrációjú szuszpenzió hígítás után is ugyanannyi sejtet tartalmaz összesen. Ez a szám egyszerűen nagyobb folyadéktérfogatban oszlik el.

A laboratóriumok számos rutinlépés előtt hígítják a sejteket: a növekvő tenyészet új lombikokba osztásakor, rögzített számú sejt lemez minden egyes üregébe történő beoltásakor, a sejtek tárolás céljából történő fagyasztásakor, illetve sejtszámlálóhoz vagy áramlási citométerhez való minta előkészítésekor.

A sejthígítás képlete

A számítás egy szabályon alapul. A kiindulási szuszpenzióból vett sejtek száma a koncentrációval megszorozva egyenlő a végső térfogatban lévő sejtek számával, a célkoncentrációval megszorozva:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — kiindulási (törzs-)koncentráció, sejt/ml-ben
• V₁ — a felhasználandó törzsszuszpenzió térfogata, ml-ben
• C₂ — célkoncentráció, sejt/ml-ben
• V₂ — szükséges teljes végső térfogat, ml-ben

Az V₁-et kifejezve megkapjuk a pipettázandó törzsszuszpenzió térfogatát:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

A végső térfogat fennmaradó része hígítóoldat, általában sejttenyésztő közeg, foszfátpufferelt sóoldat (PBS) vagy más puffer:

Hígítóoldat térfogata = V₂ − V₁

A célkoncentráció (C₂) soha nem lehet magasabb a törzskoncentrációnál (C₁). A hígítás csak csökkenti a koncentrációt. A növeléséhez a sejteket le kell centrifugálni, majd kisebb folyadéktérfogatban újra fel kell szuszpendálni.

Sejthígítás számítása

1. Számolja meg a törzsszuszpenzió sejtjeit hemocitométerrel vagy automatikus sejtszámlálóval az C₁ meghatározásához.
2. Jegyezze fel a protokoll által előírt célkoncentrációt, az C₂ értékét.
3. Határozza meg a szükséges teljes végső térfogatot, az V₂ értékét.
4. Számítsa ki: V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Számítsa ki a hígítóoldat térfogatát: V₂ − V₁.
6. Pipettázzon V₁ térfogatú törzsszuszpenziót egy csőbe, majd adja hozzá a közeg vagy puffer hígítóoldatként szükséges térfogatát.

Megoldott példa

Egy törzsszuszpenzió koncentrációja 1 000 000 sejt/ml. A protokoll 100 000 sejt/ml koncentrációt ír elő 10 mL végső térfogatban.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Hígítóoldat térfogata = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

1 mL törzsszuszpenzió és 9 mL közeg hozzáadásával 10 mL, 100 000 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót kapunk.

Egy második példa

Egy 96-üreges lemezen végzett vizsgálathoz üregen­ként 10 000 sejt szükséges 200 mikroliter (μL) közegben. Ez 50 000 sejt/ml célkoncentrációt jelent, mivel 10 000 sejt osztva 0,2 mL-rel 50 000 sejt/ml. A törzsszuszpenzió koncentrációja 2 000 000 sejt/ml, és a lemez feltöltéséhez, a pipettázási veszteség miatt némi többlettel, összesen 20 mL szükséges.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Hígítóoldat térfogata = 20 − 0,5 = 19,5 mL

0,5 mL törzsszuszpenzió és 19,5 mL közeg összekeverésével 20 mL, 50 000 sejt/ml koncentrációjú oldatot kapunk, ami 1-40 arányú hígítás.

Hibaforrások

Maga a képlet pontos. A hibákat a képletbe bevitt számok okozzák.

• Számlálási hiba. A hibás sejtszám közvetlenül hibás hígításhoz vezet. A hemocitométer-rács mind a négy saroknégyzetének megszámlálása és az eredmények átlagolása csökkenti ezt a kockázatot.
• Összecsomósodott sejtek. A sejtek csomója mikroszkóp alatt egyetlen sejtnek látszik, valójában azonban több sejtből áll, ezért csökkenti a látszólagos koncentrációt.
• Pipettatartomány. A névleges térfogattartományán kívül használt pipetta pontatlan eredményt ad. Az 1000 μL pipetta, ha 5 μL adagolására állítják be, nem megbízható; helyette kisebb pipettát kell használni.
• Mértékegységek összekeverése. A sejt/ml és a sejt/μl összekeverése ezerszer túl nagy vagy túl kicsi hibát eredményez.
• Elhalt sejtek. A nyers sejtszám az elhalt sejteket is tartalmazza, kivéve, ha életképességi festést, például tripánkéket használtak. Emiatt túlbecsülhető a ténylegesen jelen lévő élő sejtek száma.

A kalkulátor korlátai

A kalkulátor elutasítja azokat a számokat, amelyekből nem adható hasznos válasz:

• Minden értéknek nullánál nagyobbnak kell lennie.
• A célkoncentráció nem lehet magasabb a kiindulási koncentrációnál.
• A kiindulási koncentráció legfeljebb 1 billió sejt/ml (1 × 10¹²) lehet.
• A kiszámított törzsoldat-térfogatnak legalább 0,001 mL-nek, azaz 1 mikroliternek kell lennie. Ennél kisebb térfogat nem pipettázható pontosan, ezért a kalkulátor más számok megadását kéri. Ezt általában a teljes térfogat növelése oldja meg.

A térfogatok két tizedesjeggyel, illetve hárommal jelennek meg, ha a törzsoldat térfogata kisebb 0,01 mL-nél, így a kis térfogat soha nem jelenik meg 0,00 mL értékként.

Gyakran ismételt kérdések

Mi a sejthígítás képlete?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, ahol C₁ és C₂ a kiindulási és a célkoncentráció, V₁ és V₂ pedig a törzsszuszpenzióból vett térfogat és a teljes végső térfogat.

Lehet a célkoncentráció magasabb a kiindulási koncentrációnál?

Nem. A hígítás csak csökkenti a koncentrációt. Magasabb koncentráció eléréséhez a sejteket centrifugálni kell, majd kisebb térfogatban újra fel kell szuszpendálni.

Milyen folyadékot kell használni a sejtek hígításához?

Teljes tenyésztőközeget kell használni, ha a sejteknek órákon vagy napokon át életképesnek kell maradniuk, például egy lemez beoltása előtt. PBS vagy hasonló pufferolt sóoldat rövid, körülbelül 30 percnél rövidebb hígításokhoz megfelelő, mielőtt a sejteket tovább feldolgozzák. Szérummentes közeget kell használni, ha a szérumfehérjék zavarnák a későbbi vizsgálatot.

Működik ez a képlet baktériumokra vagy élesztőre is?

Igen. A C₁V₁ = C₂V₂ összefüggés bármilyen részecskeszuszpenzióra alkalmazható, beleértve a telepképző egység/ml-ben (CFU/ml) mért baktériumokat, az élesztőt és a plakképző egység/ml-ben (PFU/ml) mért vírusrészecskéket is, feltéve, hogy az egyenlet mindkét oldalán azonos mértékegységeket használnak.

Be kell számítani az elhalt sejteket a hígításnál?

Élő tenyészet beoltásakor csak az életképes sejteket kell beszámítani. Ha egy szuszpenzió 80%-ban életképes, akkor életképes koncentrációja a teljes sejtszám 0,8-szorosa, és ezt az életképes koncentrációt kell C₁-ként használni.

Hogyan készíthetők pontosan nagyon nagy hígítások?

A nagy hígításokat, például az 1-1000 arányú hígítást, általában több kisebb, sorozatos hígításnak nevezett lépésben végzik. Három egymást követő 1-10 arányú hígítással összességében 1-1000 arányú hígítás érhető el, miközben minden pipettázási lépés pontos térfogattartományban marad.