Kalkulator Konsentrasi Protein | A280 ke mg/mL

Kalkulator konsentrasi protein

Kalkulator konsentrasi protein mengubah pembacaan absorbansi cahaya dari spektrofotometer menjadi jumlah protein yang terlarut dalam larutan. Hasilnya biasanya dinyatakan dalam miligram per mililiter (mg/mL) atau mikrogram per mililiter (μg/mL). Perhitungan ini didasarkan pada hukum Beer-Lambert, yaitu hubungan dalam kimia yang mengaitkan banyaknya cahaya yang diserap sampel dengan jumlah zat yang dikandungnya.

Cara mengukur konsentrasi protein

Sebagian besar protein menyerap cahaya ultraviolet dengan kuat pada panjang gelombang 280 nanometer (nm). Penyerapan ini terutama berasal dari dua asam amino, triptofan dan tirosin, yang terdapat dalam struktur protein. Spektrofotometer memancarkan cahaya melalui sampel dan mengukur banyaknya cahaya yang diserap sampel. Pembacaan ini disebut absorbansi, atau A280 jika diukur pada 280 nm.

Pengukuran absorbansi pada 280 nm berlangsung cepat dan tidak merusak sampel. Hal ini membedakannya dari metode kimia seperti uji Bradford atau BCA yang dijelaskan di bawah. Metode ini paling baik digunakan pada protein murni dalam larutan, dengan pembacaan absorbansi antara sekitar 0,1 dan 1,0. Pembacaan di luar rentang tersebut kurang andal, sehingga sampel sering kali perlu diencerkan sebelum pengukuran.

Rumus konsentrasi protein

Kalkulator menyusun ulang hukum Beer-Lambert untuk menghitung konsentrasi:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — konsentrasi protein, dalam mg/mL
• A — absorbansi pada 280 nm (angka biasa, tanpa satuan)
• DF — faktor pengenceran, berapa kali sampel awal diencerkan sebelum diukur
• ε — koefisien ekstingsi, konstanta khusus untuk protein tersebut, dalam L/(g·cm)
• l — panjang lintasan optik, jarak yang ditempuh cahaya melalui sampel, dalam cm (biasanya 1 cm dalam kuvet standar, yaitu wadah kaca atau plastik kecil yang digunakan dalam spektrofotometer)

Untuk mengubah hasil menjadi mikrogram per mililiter, kalikan nilai mg/mL dengan 1.000. Untuk mencari massa total protein dalam sampel, kalikan konsentrasi dengan volume sampel dalam mililiter.

Contoh perhitungan

Sampel memberikan pembacaan absorbansi sebesar 0,5 pada 280 nm. Sampel tersebut tidak diencerkan, sehingga faktor pengencerannya adalah 1, dan diukur dalam kuvet standar berukuran 1 cm. Proteinnya adalah albumin serum sapi (BSA), yang memiliki koefisien ekstingsi sebesar 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Dalam sampel sebanyak 1 mL, jumlah tersebut setara dengan sekitar 0,75 mg protein total, atau 750 μg/mL.

Koefisien ekstingsi untuk protein umum

Setiap protein menyerap cahaya secara berbeda karena masing-masing memiliki jumlah residu triptofan dan tirosin yang berbeda. Koefisien ekstingsi menjelaskan hal ini untuk protein tertentu pada 280 nm, dalam satuan L/(g·cm). Nilai yang umum digunakan meliputi:

Kalkulator juga dapat menerima koefisien ekstingsi khusus untuk protein yang tidak tercantum dalam daftar ini. Untuk protein dengan urutan asam amino yang diketahui, nilai ini dapat diperkirakan dengan rumus yang diterbitkan oleh Gill dan von Hippel pada 1989: ε₂₈₀ = (residu triptofan × 5.500) + (residu tirosin × 1.490) + (residu sistin × 125). Rumus tersebut menghasilkan nilai dalam M⁻¹cm⁻¹, yaitu satuan molar yang berbeda dari nilai berbasis massa L/(g·cm) di atas. Alat gratis seperti ProtParam, yang dihosting oleh server ExPASy, menghitung nilai ini langsung dari urutan protein.

Panjang lintasan optik dan faktor pengenceran

Panjang lintasan optik adalah lebar kuvet yang menampung sampel, diukur dalam sentimeter. Kuvet standar memiliki lebar 1 cm. Spektrofotometer mikrovolume, yang mengukur sampel sangat kecil, dapat menggunakan lintasan yang jauh lebih pendek, misalnya 0,1 cm.

Faktor pengenceran memperhitungkan pengenceran yang dilakukan sebelum pengukuran. Jika sampel pekat akan menghasilkan absorbansi di atas 1,0, sampel tersebut biasanya diencerkan terlebih dahulu dengan buffer. Faktor pengenceran sama dengan volume total setelah pengenceran dibagi volume sampel awal. Misalnya, mencampurkan 10 μL sampel dengan 990 μL buffer menghasilkan volume total 1.000 μL dan faktor pengenceran 100.

Cara lain untuk mengukur konsentrasi protein

Absorbansi pada 280 nm adalah salah satu dari beberapa metode umum yang digunakan di laboratorium.

• Uji Bradford: menggunakan pewarna yang berubah warna ketika berikatan dengan protein. Metode ini bekerja baik pada sampel yang belum dimurnikan, tetapi perubahan warnanya dapat berbeda-beda pada protein yang berbeda.
• Uji BCA: mengandalkan perubahan warna yang disebabkan oleh ikatan peptida protein. Metode ini kompatibel dengan banyak detergen, tetapi memerlukan waktu lebih lama daripada pembacaan absorbansi langsung.
• Metode Lowry: metode yang lebih lama dan sangat sensitif, tetapi bereaksi kurang baik dengan beberapa bahan umum dalam buffer.

Ketiga metode tersebut merusak sampel. Pengukuran A280 langsung tidak merusak sampel, sehingga sampel yang sama dapat dipulihkan dan digunakan kembali.

Pertanyaan yang sering diajukan

Berapa rentang absorbansi ideal untuk metode ini?

Antara 0,1 dan 1,0. Di bawah 0,1, pembacaan tidak presisi. Di atas 1,0, hubungan antara absorbansi dan konsentrasi mungkin tidak lagi berupa garis lurus, sehingga sampel harus diencerkan terlebih dahulu.

Mengapa mengukur pada 280 nm, bukan 260 nm?

Asam nukleat, seperti DNA dan RNA, menyerap kuat pada 260 nm. Protein menyerap lebih banyak pada 280 nm karena kandungan triptofan dan tirosinnya. Pengukuran pada 280 nm mengurangi gangguan dari asam nukleat yang mungkin terdapat dalam sampel.

Bagaimana koefisien ekstingsi ditentukan untuk protein yang tidak tercantum?

Untuk protein dengan urutan yang diketahui, alat seperti ProtParam menghitungnya dari jumlah residu triptofan, tirosin, dan sistin. Koefisien tersebut juga dapat diukur secara langsung dengan membandingkan absorbansi sampel dengan larutan yang konsentrasinya diketahui.

Apakah metode ini dapat digunakan untuk campuran protein?

Metode ini paling baik digunakan untuk satu protein murni dengan koefisien ekstingsi yang diketahui. Campuran protein yang tidak diketahui, seperti lisat sel, biasanya diukur dengan uji Bradford atau BCA karena metode tersebut memberikan perkiraan protein total yang lebih konsisten.

Apakah detergen dapat mengganggu pembacaan?

Ya. Banyak detergen menyerap cahaya di dekat 280 nm, yang dapat mengubah hasil. Penggunaan sampel blanko yang mengandung konsentrasi detergen yang sama membantu menghilangkan absorbansi latar belakang tersebut. Konsentrasi detergen yang sangat tinggi mungkin memerlukan uji yang kompatibel dengan detergen, seperti BCA.