Kalkulator Konsentrasi DNA

Kalkulator konsentrasi DNA mengubah pembacaan absorbansi UV pada 260 nanometer, yang disebut A260, menjadi konsentrasi DNA dalam nanogram per mikroliter (ng/µL). Kalkulator ini juga melaporkan jumlah total DNA dalam sampel, dalam mikrogram (µg).

Apa yang dimaksud dengan absorbansi A260?

A260 adalah jumlah sinar ultraviolet yang diserap larutan pada panjang gelombang 260 nanometer. DNA paling kuat menyerap sinar UV di sekitar panjang gelombang ini karena basa nukleotidanya. Spektrofotometer mengukur A260 setelah pembacaan blanko, dengan menggunakan dapar yang sama seperti pada sampel untuk menghilangkan absorbansi latar belakang. Semakin banyak DNA dalam larutan, semakin tinggi pembacaan A260.

Rumus konsentrasi DNA

DNA untai ganda menyerap sinar UV sebanding dengan konsentrasinya, suatu hubungan yang dikenal sebagai hukum Beer-Lambert. Pada lintasan cahaya standar sepanjang 1 sentimeter, larutan dengan pembacaan A260 sebesar 1,0 mengandung sekitar 50 ng/µL DNA untai ganda. Angka ini, yang disebut faktor konversi, mengubah pembacaan A260 apa pun menjadi konsentrasi:

Konsentrasi DNA (ng/µL) = A260 × 50 × faktor pengenceran

Faktor pengenceran memperhitungkan setiap pengenceran yang dilakukan sebelum sampel diukur. Sampel yang diukur tanpa pengenceran memiliki faktor pengenceran 1.

Cara menghitung jumlah total DNA

Setelah konsentrasi diketahui, massa total DNA dalam sampel dapat ditentukan dari volumenya:

Total DNA (µg) = konsentrasi (ng/µL) × volume (µL) ÷ 1000

Cara menghitung konsentrasi DNA: langkah demi langkah

Campur sampel hingga merata sebelum pengukuran. DNA dapat menempel pada dinding tabung atau mengendap secara tidak merata.
Encerkan sampel jika konsentrasinya sangat tinggi, dengan menargetkan pembacaan A260 antara 0,1 dan 1,0. Pembacaan spektrofotometer paling tidak andal di luar rentang tersebut.
Lakukan blanko pada spektrofotometer menggunakan dapar yang sama dengan yang digunakan untuk pengenceran, lalu ukur sampel pada 260 nm.
Masukkan pembacaan A260, volume sampel, dan faktor pengenceran ke dalam kalkulator untuk memperoleh konsentrasi dan jumlah total. Ketiga kotak harus diisi, dan volume harus lebih besar dari nol, sebelum hasil ditampilkan.

Contoh perhitungan

Contoh 1: sampel tanpa pengenceran

Pembacaan A260 sebesar 0,5, tanpa pengenceran (faktor pengenceran 1), dan volume sampel 100 µL.

Konsentrasi = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Total DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Contoh 2: sampel yang diencerkan

Sebuah tabung berisi 50 µL DNA murni. Sebagian kecil DNA tersebut diencerkan 10 kali, dan bagian yang telah diencerkan menghasilkan pembacaan A260 sebesar 0,75. Faktor pengenceran mengubah pembacaan tersebut kembali menjadi konsentrasi dalam tabung awal, sedangkan volume 50 µL dimasukkan untuk langkah penghitungan jumlah total.

Konsentrasi = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Total DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Menghitung faktor pengenceran

Faktor pengenceran = volume total setelah pengenceran ÷ volume sampel awal.

Penambahan 5 µL larutan DNA ke 45 µL dapar menghasilkan volume total 50 µL, sehingga faktor pengencerannya adalah 50 ÷ 5 = 10. Sampel yang tidak diencerkan memiliki faktor pengenceran 1.

Rentang konsentrasi DNA yang umum

Konsentrasi bergantung pada jenis sampel dan metode ekstraksi. Ekstraksi DNA genom umumnya menghasilkan konsentrasi sekitar 10 hingga 100 ng/µL. Preparasi DNA plasmid sering menghasilkan konsentrasi yang lebih tinggi, kadang-kadang beberapa ratus ng/µL. Hasil yang jauh di luar rentang yang diharapkan untuk metode tertentu dapat menunjukkan masalah pada ekstraksi atau pengukuran itu sendiri.

Keterbatasan pengukuran absorbansi UV

Pengukuran A260 berlangsung cepat, tetapi bukan metode yang paling sensitif atau spesifik untuk DNA. Protein, RNA, dan beberapa komponen dapar juga menyerap cahaya di dekat 260 nm dan dapat meningkatkan pembacaan. Ilmuwan sering memeriksa rasio A260/A280 bersama konsentrasi untuk menyaring kontaminasi protein; rasio mendekati 1,8 biasanya menunjukkan sampel DNA murni. Metode berbasis pewarna fluoresen, seperti uji Qubit, hanya berikatan dengan DNA untai ganda dan memberikan pembacaan yang lebih akurat untuk sampel encer atau tidak murni, meskipun memerlukan pereaksi tambahan dan fluorometer.

Pertanyaan yang sering diajukan

Bagaimana cara menghitung konsentrasi DNA dari A260?

Kalikan pembacaan A260 dengan 50, yaitu faktor konversi standar untuk DNA untai ganda, lalu kalikan dengan faktor pengenceran. Jika sampel tidak diencerkan, gunakan faktor pengenceran 1.

Berapa rasio A260/A280 yang baik?

Rasio mendekati 1,8 biasanya menunjukkan sampel DNA murni. Rasio yang lebih rendah menunjukkan kontaminasi protein. Rasio di atas 2,0 dapat menunjukkan kontaminasi RNA.

Apakah kalkulator ini dapat digunakan untuk RNA?

Tidak secara langsung, karena RNA menggunakan faktor konversi 40 ng/µL, bukan 50. Untuk memperkirakan konsentrasi RNA, kalikan hasil kalkulator dengan 0,8 (40 ÷ 50), atau gunakan A260 × 40 × faktor pengenceran secara langsung.

Mengapa pembacaan A260 harus berada antara 0,1 dan 1,0?

Absorbansi tetap kira-kira sebanding dengan konsentrasi, sebagaimana dijelaskan oleh hukum Beer-Lambert, terutama dalam rentang ini. Di luar rentang tersebut, pembacaan menjadi kurang andal, sehingga sampel yang terlalu pekat atau terlalu encer harus diencerkan atau dipekatkan sebelum diukur kembali.

Apa perbedaan antara konsentrasi dan kemurnian?

Konsentrasi mengukur jumlah DNA yang ada, dalam ng/µL. Kemurnian mengukur seberapa bersih sampel tersebut, terutama berdasarkan rasio absorbansi seperti A260/A280. Sampel dapat memiliki konsentrasi tinggi tetapi tetap tidak murni, atau konsentrasi rendah dan sangat murni.

Bagaimana cara mengonversi ng/µL menjadi µg/mL?

Kedua satuan tersebut secara numerik sama. 1 ng/µL sama dengan 1 µg/mL, karena satuan massa dan satuan volume masing-masing berubah dengan faktor 1000.

Referensi

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edisi ke-3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Kuantifikasi DNA dan RNA dengan spektroskopi absorpsi dan fluoresensi. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Nilai rasio A260/A280 untuk pengukuran kemurnian asam nukleat. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Kalkulator Konsentrasi DNA | Konverter A260 ke ng/μL