BCA サンプル体積計算ツール | タンパク質定量ツール

BCAサンプル量計算機とは

BCAサンプル量計算機は、BCAタンパク質アッセイの吸光度測定値を、目標量のタンパク質をロードするために必要なサンプル量（マイクロリットル（μL））に換算します。これは、ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイを実施した後に使用します。BCAタンパク質アッセイは、サンプルが生成する紫色の光吸収性物質の量を測定して、溶液中のタンパク質量を調べる一般的な実験室検査です。

BCAアッセイによるタンパク質の測定方法

BCAアッセイは二段階で進みます。第一に、サンプル中のタンパク質が、アルカリ性の溶液中で銅イオン（Cu²⁺）を別の状態（Cu¹⁺）に還元します。還元の量は、存在するタンパク質の量に応じて決まります。第二に、ビシンコニン酸が還元された銅と結合して紫色の化合物を生成し、この化合物は波長562ナノメートル（nm）で光を強く吸収します。

分光光度計は、サンプルが562 nmで吸収する光の量を測定します。この値を吸光度と呼びます。紫色が濃いほど吸光度が高く、タンパク質量も多くなります。実験室では、各サンプルの吸光度を標準曲線と比較します。標準曲線は、通常はウシ血清アルブミン（BSA）である基準タンパク質の既知濃度を測定して作成します。

BCAは、サンプルに界面活性剤が含まれていても使えるため、広く使われています。界面活性剤は、細胞溶解バッファーによく含まれる化学物質です。たとえば、マイクロBCAキットでは、SDSとTriton X-100が5%まで適合すると記載されています。一方、より古い色素結合法であるブラッドフォード法は、ほとんどの界面活性剤の影響を受けます。

BCA吸光度からサンプル量への換算式

BCA標準曲線は、吸光度を濃度に対してプロットし、直線を当てはめたものです。

$\text{吸光度} = \text{傾き} \times \text{濃度} + \text{切片}$

逆に、測定した吸光度からタンパク質濃度を求めるには、式を変形します。

$\text{タンパク質濃度（μg/μL）} = \frac{\text{吸光度} - \text{切片}}{\text{傾き}}$

濃度が分かれば、目標質量のタンパク質を含むサンプル量は次の式で求められます。

$\text{サンプル量（μL）} = \frac{\text{サンプル質量（μg）}}{\text{タンパク質濃度（μg/μL）}}$

この計算機には4種類の曲線があらかじめ設定されており、それぞれに固有の傾きと切片があります。すべてのプリセットで切片は0です。これは、測定値がブランク補正されているためです（最初にタンパク質を含まない対照の吸光度を差し引きます）。傾きは、各プロトコルの測定範囲がプレートの吸光度範囲をどの程度カバーするかを表します。

標準と高感度の範囲はPierce BCAキットガイドに基づきます。マイクロの範囲はマイクロBCAキットガイドに基づきます。

希釈サンプル用に設計された、より高感度なプロトコルでは、タンパク質のマイクログラム当たりの吸光度が大きくなるため、傾きも大きくなります。高感度BCAとマイクロBCAは、標準プロトコルでは正確に測定できないほど希薄なサンプルを対象としています。

BCA吸光度からサンプル量を計算する方法

1. BCAアッセイを実施し、各サンプルの吸光度を562 nmで測定します。
2. 使用したプロトコルに合う曲線の種類（標準、高感度、またはMicro）を選ぶか、その日に作成した曲線から得たカスタムの傾きと切片を入力します。
3. 各サンプルについて、吸光度の測定値と、マイクログラム単位の目標タンパク質質量を入力します。
4. 計算機は吸光度をタンパク質濃度に換算し、その濃度で目標質量を割って、ピペットで分取する量を求めます。

例：BCA吸光度からサンプル量を計算する

ウェスタンブロットを準備する研究者が、レーン当たり20 μgのタンパク質を必要としており、標準BCA曲線（傾き1.0、切片0）を使用しています。

サンプルAの吸光度は0.75です。

• タンパク質濃度 = (0.75 − 0) / 1.0 = 0.75 μg/μL
• サンプル量 = 20 μg ÷ 0.75 μg/μL = 26.67 μL

サンプルBの吸光度は1.2です。

• タンパク質濃度 = (1.2 − 0) / 1.0 = 1.2 μg/μL
• サンプル量 = 20 μg ÷ 1.2 μg/μL = 16.67 μL

サンプルAはより希薄なため、同じ20 μgの目標量に達するには、より多くの量が必要です。

計算機の結果を理解する

計算機は各サンプルについて、μg/μL単位のタンパク質濃度と、μL単位のサンプル量という2つの値を示します。また、問題を引き起こす可能性が高い結果には警告を表示します。

• 3.0を超える吸光度では警告が表示されます。通常のBCA測定値は0から2.0の範囲に入るためです。
• 吸光度が0.05未満（ただし0より大きい）の場合、結果の精度が低い可能性があるという警告が表示されます。信号が低いと測定ノイズの影響を受けやすくなるためです。
• 計算されたサンプル量が1000 μL以上の場合、より濃縮したサンプルを使用するよう警告が表示されます。
• 計算されたサンプル量が0.5 μL未満の場合、正確なピペッティングが難しい可能性があるという警告が表示されます。
• 負の吸光度または負のサンプル質量は、そのままでは受け付けられません。

実験室での実用例

タンパク質を一定量ロードすることは、ウェスタンブロットで最もよくある失敗要因の一つです。レーン間でバンド強度が不均一になるのは、発現量の実際の違いではなく、タンパク質ロード量の違いを反映していることが多くあります。各サンプルの吸光度測定値に基づいて正確な量を計算すれば、ゲル全体でロード量を一定に保てます。

同じ計算は酵素アッセイにも適用できます。条件間で活性を比較するには、総タンパク質量をそろえて開始する必要があるためです。免疫沈降でも、例えば一方のチューブが800 μg、別のチューブが1200 μgのように投入タンパク質量が不均一だと、結果の比較が難しくなります。タンパク質精製では、各画分にどれだけのタンパク質が残っているかを追跡するため、各段階で同じ式を使います。

他のタンパク質アッセイとの比較

そのほかの方法には、銅を利用する古いアッセイであるローリー法や、280 nmでの直接紫外吸光度測定があります。後者は試薬が不要ですが、核酸を含まない純粋なサンプルが必要です。

タンパク質定量の短い歴史

BCAアッセイは、アルカリ性の溶液中でタンパク質が銅イオンを還元するビウレット反応を土台にしています。マリオン・ブラッドフォードは、より速い色素結合法を1976年に発表しましたが、ほとんどの界面活性剤がこの方法を妨害します。ポール・スミスらは、1985年にBCA法を報告しました。この方法はビウレット反応とビシンコニン酸を組み合わせたもので、還元された銅を高感度で検出でき、一般的な細胞ライセートに含まれる界面活性剤にも耐えられます。

コード例

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

よくある質問

BCAアッセイは何に使われますか？ 溶液中の総タンパク質濃度を測定するために使われます。多くの場合、ウェスタンブロットでタンパク質を等量ロードする前、酵素活性アッセイを標準化する前、またはタンパク質精製中に収量を追跡する際に使用されます。

BCAアッセイの精度はどのくらいですか。 精度は、サンプルと並行して測定した良好な標準曲線と、サンプルに妨害物質が含まれていないことに左右されます。タンパク質の種類によって発色が異なるため、キットガイドは、正確な結果が必要な場合には、未知サンプルに近い標準タンパク質を選ぶよう勧めています。

BCAアッセイの結果を妨げるものは何ですか。 DTTやβ-メルカプトエタノールなどの還元剤は、それ自体が銅を還元するため、ブランクを含むすべてのチューブが濃い紫色になります。EDTAなどのキレート剤は銅と結合し、まったく発色しなくなることがあります。透析、脱塩、または希釈でこれらを取り除けます。

BCAアッセイとブラッドフォードアッセイの違いは何ですか。 ブラッドフォード法は、タンパク質に結合する色素を使い、約10分後に595 nmで読み取りますが、ほとんどの界面活性剤が妨害します。標準のBCAプロトコルは37 °Cで30分かかり、多くの界面活性剤に耐えるため、細胞ライセートによく選ばれます。

計算されたサンプル量が異常に大きいのはなぜですか？ 量が大きいということは、測定されたタンパク質濃度が予想より低いことを意味します。よくある原因には、細胞溶解が不完全であること、サンプルを希釈しすぎたこと、アッセイの検出下限付近の吸光度測定値などがあります。遠心フィルターでサンプルを濃縮するか、高感度BCAまたはマイクロBCAプロトコルに切り替えると、通常は解決します。

吸光度が直線範囲の外に出た場合はどうすればよいですか。 サンプルを希釈して測定し直します。標準曲線が表すのは、標準物質がカバーする範囲だけなので、最も高い標準物質を超える測定値は、確実には換算できません。

参考文献

1. Thermo Fisher Scientific。Pierce BCA Protein Assay Kit User Guide（MAN0011430）。Pierce BCAキットガイド — 銅の還元と562 nmの発色、標準の20–2000 μg/mLと高感度の5–250 μg/mLの範囲、37 °Cで30分、方法の参照文献としてのSmith et al.（1985）。
2. Thermo Fisher Scientific。Micro BCA Protein Assay Kit Instructions（MAN0011237）。マイクロBCAキットガイド — 0.5–20 μg/mLの範囲、SDSとTriton X-100が5%まで適合すること、還元剤とキレート剤の影響。
3. Thermo Fisher Scientific。Bradford Plus Protein Assay Kit User Guide（MAN0011203）。Bradford Plusキットガイド — 595 nmでの読み取り、10分のインキュベーション、測定範囲、界面活性剤の妨害、方法の参照文献としてのBradford（1976）。