BCA サンプル体積計算ツール | タンパク質定量ツール

BCAサンプル量計算機とは

BCAサンプル量計算機は、BCAタンパク質アッセイの吸光度測定値を、目標量のタンパク質をロードするために必要なサンプル量（マイクロリットル（μL））に換算します。これは、ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイを実施した後に使用します。BCAタンパク質アッセイは、サンプルが生成する紫色の光吸収性物質の量を測定して、溶液中のタンパク質量を調べる一般的な実験室検査です。

BCAアッセイによるタンパク質の測定方法

BCAアッセイは2段階で機能します。まず、サンプル中のタンパク質がアルカリ性溶液中で銅イオン（Cu²⁺）を別の形態（Cu¹⁺）に還元します。還元量は、存在するタンパク質量によって決まります。次に、ビシンコニン酸が還元された銅と結合し、562ナノメートル（nm）の波長で光を強く吸収する紫色の化合物を形成します。

分光光度計は、サンプルが562 nmで吸収する光の量を測定します。この値を吸光度と呼びます。紫色が濃いほど吸光度が高く、タンパク質量も多くなります。実験室では、各サンプルの吸光度を標準曲線と比較します。標準曲線は、通常はウシ血清アルブミン（BSA）である基準タンパク質の既知濃度を測定して作成します。

BCAが広く使われるのは、SDSやTriton X-100などの界面活性剤をサンプルが含んでいても機能するためです。これらは細胞溶解バッファーで一般的に使われる化学物質ですが、Bradford法やLowry法という従来の2つのアッセイでは測定を妨げます。

BCA吸光度からサンプル量への換算式

BCA標準曲線は、吸光度を濃度に対してプロットし、直線を当てはめたものです。

$\text{吸光度} = \text{傾き} \times \text{濃度} + \text{切片}$

逆に、測定した吸光度からタンパク質濃度を求めるには、式を変形します。

$\text{タンパク質濃度（μg/μL）} = \frac{\text{吸光度} - \text{切片}}{\text{傾き}}$

濃度が分かれば、目標質量のタンパク質を含むサンプル量は次の式で求められます。

$\text{サンプル量（μL）} = \frac{\text{サンプル質量（μg）}}{\text{タンパク質濃度（μg/μL）}}$

この計算機には4種類の曲線があらかじめ設定されており、それぞれに固有の傾きと切片があります。すべてのプリセットで切片は0です。これは、測定値がブランク補正されているためです（最初にタンパク質を含まない対照の吸光度を差し引きます）。傾きは、各プロトコルの測定範囲がプレートの吸光度範囲をどの程度カバーするかを表します。

希釈サンプル用に設計された、より高感度なプロトコルでは、タンパク質1マイクログラム当たりの吸光度が大きくなるため、傾きも大きくなります。高感度BCAとMicro BCAは、標準プロトコルでは正確に測定できないほど希薄なサンプルを対象としています。

BCA吸光度からサンプル量を計算する方法

1. BCAアッセイを実施し、各サンプルの吸光度を562 nmで測定します。
2. 使用したプロトコルに合う曲線の種類（標準、高感度、またはMicro）を選ぶか、その日に作成した曲線から得たカスタムの傾きと切片を入力します。
3. 各サンプルについて、吸光度の測定値と、マイクログラム単位の目標タンパク質質量を入力します。
4. 計算機は吸光度をタンパク質濃度に換算し、その濃度で目標質量を割って、ピペットで分取する量を求めます。

例：BCA吸光度からサンプル量を計算する

ウェスタンブロットを準備する研究者が、レーン当たり20 μgのタンパク質を必要としており、標準BCA曲線（傾き1.0、切片0）を使用しています。

サンプルAの吸光度は0.75です。

• タンパク質濃度 = (0.75 − 0) / 1.0 = 0.75 μg/μL
• サンプル量 = 20 μg ÷ 0.75 μg/μL = 26.67 μL

サンプルBの吸光度は1.2です。

• タンパク質濃度 = (1.2 − 0) / 1.0 = 1.2 μg/μL
• サンプル量 = 20 μg ÷ 1.2 μg/μL = 16.67 μL

サンプルAはより希薄なため、同じ20 μgの目標量に達するには、より多くの量が必要です。

計算機の結果を理解する

計算機は各サンプルについて、μg/μL単位のタンパク質濃度と、μL単位のサンプル量という2つの値を示します。また、問題を引き起こす可能性が高い結果には警告を表示します。

• 3.0を超える吸光度では警告が表示されます。通常のBCA測定値は0から2.0の範囲に入るためです。
• 吸光度が0.05未満（ただし0より大きい）の場合、結果の精度が低い可能性があるという警告が表示されます。信号が低いと測定ノイズの影響を受けやすくなるためです。
• 計算されたサンプル量が1000 μL以上の場合、より濃縮したサンプルを使用するよう警告が表示されます。
• 計算されたサンプル量が0.5 μL未満の場合、正確なピペッティングが難しい可能性があるという警告が表示されます。
• 負の吸光度または負のサンプル質量は、そのままでは受け付けられません。

実験室での実用例

タンパク質を一定量ロードすることは、ウェスタンブロットで最もよくある失敗要因の一つです。レーン間でバンド強度が不均一になるのは、発現量の実際の違いではなく、タンパク質ロード量の違いを反映していることが多くあります。各サンプルの吸光度測定値に基づいて正確な量を計算すれば、ゲル全体でロード量を一定に保てます。

同じ計算は酵素アッセイにも適用できます。条件間で活性を比較するには、総タンパク質量をそろえて開始する必要があるためです。免疫沈降でも、例えば一方のチューブが800 μg、別のチューブが1200 μgのように投入タンパク質量が不均一だと、結果の比較が難しくなります。タンパク質精製では、各画分にどれだけのタンパク質が残っているかを追跡するため、各段階で同じ式を使います。

他のタンパク質アッセイとの比較

タンパク質定量の短い歴史

初期のタンパク質測定はケルダール法（1883）に依存していました。この方法では、サンプルを酸で分解した後の窒素含量を測定します。1900年代初頭に開発されたビウレット試験は、ペプチド結合と銅イオンの発色反応を利用しましたが、感度はあまり高くありませんでした。Oliver Lowryは1951年にビウレット反応と追加試薬を組み合わせてLowry法を開発し、界面活性剤やEDTAなど一般的な実験室用化学物質の影響を受けるにもかかわらず、数十年にわたってタンパク質測定の主流となりました。Marion Bradfordは1976年に、より高速な色素結合法を発表しましたが、この方法も界面活性剤の存在下では機能せず、タンパク質のアミノ酸組成によって結果が変動しました。Pierce Chemical CompanyのPaul Smithらは1985年にBCA法を発表しました。これはビウレット反応と、銅に対してより高い感度を持つビシンコニン酸を組み合わせたもので、一般的な細胞溶解液に含まれる界面活性剤に耐えるアッセイを実現しました。

コード例

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

よくある質問

BCAアッセイは何に使われますか？ 溶液中の総タンパク質濃度を測定するために使われます。多くの場合、ウェスタンブロットでタンパク質を等量ロードする前、酵素活性アッセイを標準化する前、またはタンパク質精製中に収量を追跡する際に使用されます。

BCAアッセイの精度はどの程度ですか？ 良好な条件では、標準曲線に少なくとも5点または6点があり、サンプルに妨害物質が高濃度で含まれていなければ、通常は5–10%以内の精度です。

BCAアッセイの結果に影響するものは何ですか？ DTTやβ-メルカプトエタノールなどの還元剤は、タンパク質とは無関係に自ら銅を還元するため、吸光度を人為的に高くします。EDTAなどのキレート剤は、銅が反応する前に結合することで吸光度を低下させます。

BCAアッセイとBradfordアッセイの違いは何ですか？ Bradford法は約5分で結果が得られますが、界面活性剤の影響を受け、タンパク質のアミノ酸組成によって反応が異なります。BCA法は約30分かかりますが、界面活性剤に耐性があり、異なるタンパク質間でもより一貫した測定値が得られるため、細胞溶解液にはより適しています。

計算されたサンプル量が異常に大きいのはなぜですか？ 量が大きいということは、測定されたタンパク質濃度が予想より低いことを意味します。よくある原因には、細胞溶解が不完全であること、サンプルを希釈しすぎたこと、アッセイの低い検出限界付近の吸光度測定値などがあります。遠心フィルターでサンプルを濃縮するか、高感度BCAまたはMicro BCAプロトコルに切り替えると、通常は解決します。

吸光度が直線範囲外の場合はどうすればよいですか？ サンプルを希釈して再測定します。吸光度と濃度の関係はおよそ2.0を超えると成り立たなくなるため、標準曲線を超えて外挿すると真の濃度を過小評価します。

参考文献

1. Smith PK、Krohn RI、Hermanson GTほか。「ビシンコニン酸を用いたタンパク質の測定」Analytical Biochemistry。1985;150(1):76-85。
2. Thermo Fisher Scientific。「Pierce BCA Protein Assay Kit」ユーザーガイド（MAN0011430）。
3. Bradford MM。「マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度な方法」Analytical Biochemistry。1976;72(1-2):248-254。