Kalkulator Pencairan Sel - Alat Pencairan Makmal yang Tepat

Kalkulator Pencairan Sel

Kalkulator pencairan sel menentukan jumlah suspensi sel dan jumlah bahan pencair yang perlu dicampurkan untuk mencapai kepekatan sel sasaran dalam isi padu akhir yang dipilih. Kalkulator ini digunakan dalam kultur sel, mikrobiologi dan kerja makmal lain apabila sampel perlu dibawa kepada kepekatan tepat sebelum digunakan.

Maksud pencairan sel

Mencairkan ampaian sel tidak mengubah bilangan sel yang terkandung di dalamnya. Ia hanya mengubah isipadu tempat sel berada, lalu menurunkan kepekatan. Ampaian yang dikira pada 1,000,000 sel per mililiter (sel/mL) masih mengandungi jumlah sel yang sama selepas pencairan. Jumlah itu hanya tersebar dalam lebih banyak cecair.

Makmal mencairkan sel sebelum banyak langkah rutin: membahagikan kultur yang sedang membesar ke dalam kelalang baharu, menyemai bilangan sel tetap ke dalam setiap telaga plat, membekukan sel untuk penyimpanan, atau menyediakan sampel untuk alat pengira sel atau sitometer aliran.

Formula pencairan sel

Pengiraan ini berasaskan satu peraturan. Bilangan sel yang diambil daripada ampaian stok, didarabkan dengan kepekatannya, mestilah sama dengan bilangan sel dalam isipadu akhir, didarabkan dengan kepekatan sasaran:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — kepekatan permulaan (stok), dalam sel/mL
• V₁ — isipadu ampaian stok yang perlu digunakan, dalam mL
• C₂ — kepekatan sasaran, dalam sel/mL
• V₂ — jumlah isipadu akhir yang diperlukan, dalam mL

Penyelesaian untuk V₁ memberikan isipadu ampaian stok yang perlu dipipet:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Baki isipadu akhir ialah bahan pencair, biasanya medium kultur sel, larutan garam berpenimbal fosfat (PBS) atau penimbal lain:

Isipadu bahan pencair = V₂ − V₁

Kepekatan sasaran (C₂) tidak boleh lebih tinggi daripada kepekatan stok (C₁). Pencairan hanya menurunkan kepekatan. Untuk menaikkannya, sel perlu disentrifugasi untuk dimendapkan dan disuspensikan semula dalam cecair yang lebih sedikit.

Cara mengira pencairan sel

1. Kira ampaian stok menggunakan hemositometer atau pengira sel automatik untuk mendapatkan C₁.
2. Catat kepekatan sasaran, C₂, yang diperlukan oleh protokol.
3. Tentukan jumlah isipadu akhir, V₂, yang diperlukan.
4. Kira V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Kira isipadu bahan pencair sebagai V₂ − V₁.
6. Pipet V₁ ampaian stok ke dalam tiub, kemudian tambahkan isipadu bahan pencair yang terdiri daripada medium atau penimbal.

Contoh pengiraan

Ampaian stok dikira pada 1,000,000 sel/mL. Satu protokol memerlukan 100,000 sel/mL dalam isipadu akhir 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100,000 × 10) ÷ 1,000,000 = 1,000,000 ÷ 1,000,000 = 1 mL

Isipadu bahan pencair = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Mengambil 1 mL ampaian stok dan menambahkan 9 mL medium menghasilkan 10 mL ampaian pada 100,000 sel/mL.

Contoh kedua

Ujian pada plat yang mempunyai 96 telaga memerlukan 10,000 sel bagi setiap telaga dalam 200 mikroliter (μL) medium bagi setiap telaga. Ini bersamaan kepekatan sasaran 50,000 sel/mL, kerana 10,000 sel dibahagikan dengan 0.2 mL bersamaan 50,000 sel/mL. Stok dikira pada 2,000,000 sel/mL, dan jumlah 20 mL diperlukan untuk memenuhi plat dengan sedikit lebihan bagi mengatasi kehilangan semasa pemipetan.

V₁ = (50,000 × 20) ÷ 2,000,000 = 1,000,000 ÷ 2,000,000 = 0.5 mL

Isipadu bahan pencair = 20 − 0.5 = 19.5 mL

Mencampurkan 0.5 mL ampaian stok dengan 19.5 mL medium menghasilkan 20 mL pada 50,000 sel/mL, iaitu pencairan 1 dalam 40.

Punca ralat

Formula itu sendiri tepat. Ralat berpunca daripada nombor yang dimasukkan ke dalamnya.

• Ralat pengiraan. Bilangan sel yang salah akan terus menghasilkan pencairan yang salah. Mengira keempat-empat petak penjuru pada grid hemositometer dan mempuratakan hasil kiraan mengurangkan risiko ini.
• Sel bergumpal. Gumpalan sel kelihatan seperti satu sel di bawah mikroskop tetapi sebenarnya terdiri daripada beberapa sel, lalu merendahkan kepekatan ketara.
• Julat pipet. Pipet yang digunakan di luar julat isipadu terkadarnya memberikan hasil yang tidak tepat. Pipet 1000 μL yang ditetapkan untuk mengeluarkan 5 μL tidak boleh dipercayai; pipet yang lebih kecil patut digunakan.
• Kesilapan unit. Mencampurkan sel/mL dengan sel/μL menghasilkan ralat yang seribu kali terlalu besar atau terlalu kecil.
• Sel mati. Kiraan sel mentah termasuk sel mati melainkan pewarna daya hidup, seperti biru tripan, digunakan. Hal ini boleh melebihkan bilangan sel hidup yang sebenarnya ada.

Had kalkulator ini

Kalkulator menolak nombor yang tidak dapat menghasilkan jawapan yang berguna:

• Setiap nilai mestilah lebih besar daripada sifar.
• Kepekatan sasaran tidak boleh lebih tinggi daripada kepekatan permulaan.
• Kepekatan permulaan mestilah 1 trilion sel/mL (1 × 10¹²) atau kurang.
• Isipadu stok yang dikira mestilah sekurang-kurangnya 0.001 mL, iaitu 1 mikroliter. Isipadu yang lebih kecil tidak dapat dipipet dengan tepat, jadi kalkulator meminta nombor yang berbeza. Menaikkan jumlah isipadu biasanya menyelesaikan masalah ini.

Isipadu dipaparkan hingga dua tempat perpuluhan, atau hingga tiga tempat apabila isipadu stok kurang daripada 0.01 mL, supaya isipadu kecil tidak pernah dipaparkan sebagai 0.00 mL.

Soalan lazim

Apakah formula untuk pencairan sel?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, dengan C₁ dan C₂ ialah kepekatan permulaan dan sasaran, manakala V₁ dan V₂ ialah isipadu yang diambil daripada stok dan jumlah isipadu akhir.

Bolehkah kepekatan sasaran lebih tinggi daripada kepekatan permulaan?

Tidak. Pencairan hanya menurunkan kepekatan. Untuk mencapai kepekatan yang lebih tinggi, sel perlu diemparkan dan digantung semula dalam isipadu yang lebih kecil.

Apakah cecair yang patut digunakan untuk mencairkan sel?

Medium kultur lengkap digunakan apabila sel perlu kekal sihat selama beberapa jam atau hari, seperti sebelum penyemaian ke dalam plat. PBS atau salin berpenimbal yang serupa sesuai untuk pencairan singkat, kurang daripada kira-kira 30 minit, sebelum sel diproses selanjutnya. Medium tanpa serum digunakan apabila protein serum akan mengganggu ujian hiliran.

Adakah formula ini berfungsi untuk bakteria atau yis?

Ya. C₁V₁ = C₂V₂ terpakai pada sebarang ampaian zarah, termasuk bakteria yang diukur dalam unit pembentuk koloni per mililiter (CFU/mL), yis dan zarah virus yang diukur dalam unit pembentuk plak per mililiter (PFU/mL), selagi unit yang sama digunakan pada kedua-dua belah persamaan.

Perlukah sel mati dikira dalam pencairan?

Untuk menyemai kultur hidup, hanya sel berdaya hidup yang patut dikira. Jika sesuatu ampaian mempunyai daya hidup 80%, kepekatan berdaya hidupnya ialah 0.8 kali ganda kiraan jumlah sel, dan kepekatan berdaya hidup itu patut digunakan sebagai C₁.

Bagaimanakah pencairan yang sangat besar boleh dibuat dengan tepat?

Pencairan besar, seperti 1 dalam 1000, biasanya dilakukan sebagai siri langkah yang lebih kecil yang dipanggil pencairan bersiri. Tiga pencairan berturut-turut 1 dalam 10 mencapai pencairan keseluruhan 1 dalam 1000, sambil memastikan setiap langkah pemipetan berada dalam julat isipadu yang tepat.