DNA-konsentraatiolaskuri

Johdanto

DNA-konsentraatiolaskuri on olennainen työkalu molekyylibiologeille, genetiikoille ja laboratoriohenkilöstölle, jotka tarvitsevat tarkkaa tietoa DNA:n konsentraatiosta näytteissään. DNA:n konsentraation mittaaminen on perustavanlaatuinen menettely molekyylibiologian laboratorioissa, ja se palvelee kriittisenä laadunvalvontavaiheena ennen siirtymistä alaspäin suuntautuville sovelluksille, kuten PCR:lle, sekvensoinnille, kloonaukselle ja muille molekyylitekniikoille. Tämä laskuri käyttää spektrofotometrisiä periaatteita DNA:n konsentraation laskemiseen UV-absorptioiden perusteella 260nm:ssa (A260), soveltaen standardimuunnoskerrointa ja ottaen huomioon alkuperäisen näytteen laimennuksen.

Käyttäjäystävällinen laskurimme yksinkertaistaa prosessia, jolla voidaan määrittää sekä konsentraatio (ng/μL) että DNA:n kokonaismäärä näytteessäsi, eliminoiden manuaalisten laskelmien tarpeen ja vähentäen matemaattisten virheiden riskiä. Olitpa sitten valmistamassa näytteitä seuraavan sukupolven sekvensointia varten, kvantifioimassa plasmidivalmisteita tai arvioimassa genomin DNA-erityksen tuottoja, tämä työkalu tarjoaa nopeita ja luotettavia tuloksia tukemaan tutkimus- ja diagnostiikkaprosessejasi.

Kuinka DNA-konsentraatio lasketaan

Perusperiaate

DNA:n konsentraation laskeminen perustuu Beer-Lambertin lakiin, joka toteaa, että liuoksen absorptio on suoraan verrannollinen liuoksessa olevan absorboivan aineen konsentraatioon ja valon kulkuetäisyyteen liuoksen läpi. Kaksoisketjuiselle DNA:lle absorptio 1.0:lla 260nm:ssa (A260) 1 cm:n kuvetissa vastaa noin 50 ng/μL:n konsentraatiota.

Kaava

DNA:n konsentraatio lasketaan seuraavalla kaavalla:

$\text{DNA-konsentraatio (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{Laimennuskerroin}$

Missä:

• A260 on absorptioluku 260nm:ssa
• 50 on kaksoisketjuisen DNA:n standardimuunnoskerroin (50 ng/μL A260 = 1.0)
• Laimennuskerroin on kerroin, jolla alkuperäistä näytettä on laimennettu mittausta varten

DNA:n kokonaismäärä näytteessä voidaan sitten laskea seuraavasti:

$\text{Kokonais-DNA (μg)} = \frac{\text{Konsentraatio (ng/μL)} \times \text{Tilavuus (μL)}}{1000}$

Muuttujien ymmärtäminen

1. Absorptio 260nm:ssa (A260):

   • Tämä on mittaus siitä, kuinka paljon UV-valoa 260nm:n aallonpituudella DNA-näyte absorboi
   • DNA-nukleotidit (erityisesti typpipohjat) absorboivat UV-valoa huippuabsorptiolla 260nm:ssa
   • Mitä korkeampi absorptio, sitä enemmän DNA:ta on liuoksessa

2. Muunnoskerroin (50):

   • Kaksoisketjuisen DNA:n standardimuunnoskerroin 50 ng/μL on erityisesti A260:ssa
   • Yksinketjuiselle DNA:lle kerroin on 33 ng/μL
   • RNA:lle kerroin on 40 ng/μL
   • Oligonukleotideille kerroin vaihtelee sekvenssin mukaan

3. Laimennuskerroin:

   • Jos näyte on laimennettu ennen mittausta (esim. 1 osa näytettä 9 osaa puskuria = laimennuskerroin 10)
   • Lasketaan seuraavasti: (Näytteen tilavuus + Laimennusainetilavuus) ÷ Näytteen tilavuus
   • Käytetään alkuperäisen, laimentamattoman näytteen konsentraation määrittämiseen

4. Tilavuus:

   • DNA-liuoksesi kokonaisvolyymi mikrolitreinä (μL)
   • Käytetään DNA:n kokonaismäärän laskemiseen näytteessä

Kuinka käyttää tätä laskuria

Noudata näitä vaiheita määrittääksesi tarkasti DNA-konsentraatiosi:

1. Valmistele näytteesi:

   • Varmista, että DNA-näytteesi on kunnolla liuotettu ja sekoitettu
   • Jos odotettu konsentraatio on korkea, valmistele laimennus varmistaaksesi, että lukema on lineaarisen alueen sisällä (tyypillisesti A260 välillä 0.1 ja 1.0)

2. Mittaa absorptio:

   • Käytä spektrofotometriä tai nanodroppilaitetta mitataksesi absorptio 260nm:ssa
   • Mittaa myös absorptio 280nm:ssa puhtauden arvioimiseksi (A260/A280-suhde)
   • Käytä samaa puskuria, jota käytettiin DNA:n liuottamiseen/laimentamiseen, tyhjennysreferenssinä

3. Syötä arvot laskuriin:

   • Syötä mitattu A260-arvo "Absorptio 260nm:ssa" kenttään
   • Syötä DNA-liuoksesi kokonaisvolyymi mikrolitreinä
   • Syötä laimennuskerroin (käytä 1, jos laimennusta ei ole tehty)

4. Tulkitse tulokset:

   • Laskuri näyttää DNA-konsentraation ng/μL:ssa
   • Kokonais-DNA:n määrä näytteessä näkyy μg:ssa
   • Käytä näitä arvoja määrittääksesi tarvittava tilavuus alaspäin suuntautuville sovelluksille

5. Arvioi DNA:n puhtaus (jos A280 mitattiin):

   • A260/A280-suhde ~1.8 osoittaa puhdasta DNA:ta
   • Alhaisemmat suhdeluvut voivat viitata proteiinisaastumiseen
   • Korkeammat suhdeluvut voivat viitata RNA-saastumiseen

Käyttötapaukset

DNA:n konsentraation mittaaminen on ratkaisevan tärkeää monissa molekyylibiologian ja bioteknologian sovelluksissa:

Molekyylikloonaus

Ennen DNA-fragmenttien ligaatioita vektoreihin tarkan konsentraation tunteminen mahdollistaa tutkijoiden laskea optimaalisen insertti-vektorisuhteen, mikä maksimoi transformaatiotehokkuuden. Esimerkiksi 3:1 moolisuhde inserttiin ja vektoriin tuottaa usein parhaat tulokset, mikä vaatii tarkkoja konsentraatiomittauksia molemmista komponenteista.

PCR ja qPCR

PCR-reaktiot vaativat tyypillisesti 1-10 ng mallidna:ta optimaaliseen amplifikaatioon. Liian vähän DNA:ta voi johtaa amplifikaation epäonnistumiseen, kun taas liian paljon voi estää reaktion. Kvantitatiivisessa PCR:ssä (qPCR) tarvitaan vielä tarkempaa DNA:n kvantifiointia, jotta varmistetaan tarkat standardikäyrät ja luotettava kvantifiointi.

Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS)

NGS-kirjaston valmistusprotokollat määrittävät tarkat DNA:n syöttömäärät, usein 1-500 ng riippuen alustasta ja sovelluksesta. Tarkka konsentraatiomittaus on välttämätöntä onnistuneelle kirjaston valmistukselle ja näytteiden tasapainoisen edustuksen varmistamiselle moninkertaisissa sekvensointikokeissa.

Transfektiokokeet

Kun DNA:ta tuodaan eukaryoottisoluihin, optimaalinen DNA-määrä vaihtelee solutyypin ja transfektiomenetelmän mukaan. Tyypillisesti 0.5-5 μg plasmididna:ta käytetään per hyvin 6-hyvässä levyssä, mikä vaatii tarkkaa konsentraatiomittausta kokeiden standardoimiseksi.

Oikeuslääketieteellinen DNA-analyysi

Oikeuslääketieteellisissä sovelluksissa DNA-näytteet ovat usein rajallisia ja arvokkaita. Tarkka kvantifiointi mahdollistaa oikeuslääketieteen asiantuntijoiden määrittää, onko riittävästi DNA:ta profiilointia varten ja standardoida käytettävän DNA:n määrä seuraavissa analyyseissä.

Rajoitusentsyymihajoitus

Rajoitusentsyymit määrittelevät erityiset aktiivisuusunit, jotka on määritelty per μg DNA:ta. Tarkan DNA:n konsentraation tunteminen mahdollistaa oikeat entsyymi-DNA-suhteet, varmistaen täydellisen hajoamisen ilman tähdellistä toimintaa (epäspesifistä leikkaamista).

Vaihtoehdot spektrofotometriselle mittaukselle

Vaikka UV-spektrofotometria on yleisin menetelmä DNA:n kvantifioinnille, useita vaihtoehtoja on olemassa:

1. Fluorometriset menetelmät:

   • Fluoresoivat väriaineet, kuten PicoGreen, Qubit ja SYBR Green, sitoutuvat erityisesti kaksoisketjuisen DNA:n kanssa
   • Herkempi kuin spektrofotometria (voi havaita jopa 25 pg/mL)
   • Vähemmän altis saastuttajille, kuten proteiineille, RNA:lle tai vapaille nukleotideille
   • Vaatii fluorometrin ja erityisiä reagensseja

2. Agaroosigeelielektroforeesi:

   • DNA:ta voidaan kvantifioida vertaamalla kaistojen intensiivisyyttä tunnetun konsentraation standardeihin
   • Tarjoaa tietoa DNA:n koosta ja eheyden samanaikaisesti
   • Vähemmän tarkka kuin spektrofotometriset tai fluorometriset menetelmät
   • Aikaa vievä, mutta hyödyllinen visuaalisen vahvistuksen saamiseksi

3. Reaalimaailman PCR:

   • Erittäin herkkä menetelmä spesifisten DNA-sekvenssien kvantifioimiseksi
   • Voi havaita äärimmäisen alhaisia konsentraatioita (jopa muutamia kopioita)
   • Vaatii erityisiä primaareja ja monimutkaisempaa laitteistoa
   • Käytetään, kun tarvitaan sekvenssikohtaista kvantifiointia

4. Digitaalinen PCR:

   • Absoluuttinen kvantifiointi ilman standardikäyriä
   • Erittäin tarkka alhaisen runsauden kohteille
   • Kallis ja vaatii erikoislaitteita
   • Käytetään harvinaisten mutaatioiden havaitsemiseen ja kopiolukumäärän vaihtelun analysoimiseen

DNA-konsentraation mittauksen historia

Kyky mitata DNA:n konsentraatio tarkasti on kehittynyt merkittävästi yhdessä molekyylibiologian edistymisen kanssa:

Varhaiset menetelmät (1950-luku - 1960-luku)

Watsonin ja Crickin DNA:n rakenteen löytämisen jälkeen vuonna 1953 tutkijat alkoivat kehittää menetelmiä DNA:n eristämiseksi ja kvantifioimiseksi. Varhaiset lähestymistavat perustuivat värireaktioihin, kuten diphenylamine-reaktioon, joka tuotti sinisen värin reagoidessaan DNA:n deoksiriboosihappojen kanssa. Nämä menetelmät olivat suhteellisen herkkiä ja alttiita häiriöille.

Spektrofotometrinen aikakausi (1970-luku)

UV-spektrofotometrian soveltaminen nukleiinihappojen kvantifiointiin yleistyi 1970-luvulla. Tutkijat huomasivat, että DNA absorboi UV-valoa huippupisteessä 260nm, ja että absorptio ja konsentraatio olivat lineaarisesti verrannollisia tietyllä alueella. 50 ng/μL:n muunnoskerroin kaksoisketjuiselle DNA:lle A260=1.0:lla vakiintui tänä aikana.

Fluorometrinen vallankumous (1980-luku - 1990-luku)

DNA:ta sitovien fluoresoivien väriaineiden kehitys 1980- ja 1990-luvuilla mullisti DNA:n kvantifioinnin, erityisesti laimeissa näytteissä. Hoechst-värit ja myöhemmin PicoGreen mahdollistivat paljon herkemmän havaitsemisen kuin spektrofotometria. Nämä menetelmät tulivat erityisen tärkeiksi PCR:n myötä, joka usein vaati tarkkaa kvantifiointia vähäisistä DNA-määristä.

Nykyinen aikakausi (2000-luku - nykyhetki)

Microvolume-spektrofotometrien, kuten NanoDropin, käyttöönotto 2000-luvun alussa muutti rutiininomaista DNA:n kvantifiointia, sillä se vaati vain 0.5-2 μL:n näytteen. Tämä teknologia poisti laimennusten ja kuvetin tarpeen, mikä teki prosessista nopeamman ja kätevämmän.

Nykyään edistyneet tekniikat, kuten digitaalinen PCR ja seuraavan sukupolven sekvensointi, ovat työntäneet DNA:n kvantifioinnin rajoja entisestään, mahdollistaen spesifisten sekvenssien absoluuttisen kvantifioinnin ja yksittäisten molekyylien havaitsemisen. Kuitenkin perus-spektrofotometrinen periaate, joka vakiinnutettiin vuosikymmeniä sitten, pysyy rutiininomaisen DNA-konsentraation mittauksen selkärankana laboratorioissa ympäri maailmaa.

Käytännön esimerkit

Käydään läpi joitakin käytännön esimerkkejä DNA-konsentraatiolaskelmista:

Esimerkki 1: Standardiplasmidivalmistus

Tutkijalla on puhdistettu plasmidi ja seuraavat mittaukset:

• A260-luku: 0.75
• Laimennus: 1:10 (laimennuskerroin = 10)
• DNA-liuoksen tilavuus: 50 μL

Laskenta:

• Konsentraatio = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• Kokonais-DNA = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

Esimerkki 2: Genomisen DNA:n eristys

Verestä eristetyn genomisen DNA:n jälkeen:

• A260-luku: 0.15
• Ei laimennusta (laimennuskerroin = 1)
• DNA-liuoksen tilavuus: 200 μL

Laskenta:

• Konsentraatio = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• Kokonais-DNA = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

Esimerkki 3: DNA:n valmistelu sekvensointia varten

Sekvensointiprotokolla vaatii tarkasti 500 ng DNA:ta:

• DNA:n konsentraatio: 125 ng/μL
• Vaadittu määrä: 500 ng

Tarvittava tilavuus = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA-liuosta

Koodiesimerkit

Tässä on esimerkkejä siitä, kuinka laskea DNA:n konsentraatio eri ohjelmointikielissä:

1' Excel-kaava DNA-konsentraatiolle
2=A260*50*Laimennuskerroin
3
4' Excel-kaava kokonais-DNA-määrälle μg:ssa
5=(A260*50*Laimennuskerroin*Tilavuus)/1000
6
7' Esimerkki solussa, jossa A260=0.5, Laimennuskerroin=2, Tilavuus=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Tulos: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Laske DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
4    
5    Parametrit:
6    absorbance (float): Absorptioluku 260nm:ssa
7    dilution_factor (float): Näytteen laimennuskerroin
8    
9    Palauttaa:
10    float: DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Laske kokonais-DNA-määrä μg:ssa
17    
18    Parametrit:
19    concentration (float): DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
20    volume_ul (float): DNA-liuoksen tilavuus μL:ssa
21    
22    Palauttaa:
23    float: Kokonais-DNA-määrä μg:ssa
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Esimerkkikäyttö
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNA-konsentraatio: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Kokonais-DNA: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Palauttaa DNA-konsentraation ng/μL:ssa
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Palauttaa kokonais-DNA-määrän μg:ssa
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Esimerkkikäyttö
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA-konsentraatio: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Kokonais-DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Laske DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
4     * 
5     * @param absorbance Absorptioluku 260nm:ssa
6     * @param dilutionFactor Näytteen laimennuskerroin
7     * @return DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Laske kokonais-DNA-määrä μg:ssa
15     * 
16     * @param concentration DNA-konsentraatio ng/μL:ssa
17     * @param volumeUL DNA-liuoksen tilavuus μL:ssa
18     * @return Kokonais-DNA-määrä μg:ssa
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNA-konsentraatio: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Kokonais-DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# R-funktio DNA-konsentraation laskemiseen
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Palauttaa DNA-konsentraation ng/μL:ssa
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Palauttaa kokonais-DNA-määrän μg:ssa
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Esimerkkikäyttö
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNA-konsentraatio: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Kokonais-DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

Usein kysytyt kysymykset

Mikä on ero DNA:n konsentraation ja DNA:n puhtauden välillä?

DNA:n konsentraatio viittaa liuoksessa olevan DNA:n määrään, tyypillisesti mitattuna ng/μL:ssa tai μg/mL:ssa. Se kertoo, kuinka paljon DNA:ta sinulla on, mutta ei osoita sen laatua. DNA:n puhtaus arvioi saasteiden läsnäolon DNA-näytteessäsi, jota mitataan yleisesti absorptiosuhteiden, kuten A260/A280 (proteiinisaasteiden arvioimiseksi) ja A260/A230 (orgaanisten yhdisteiden saasteiden arvioimiseksi) avulla. Puhdas DNA:lla on tyypillisesti A260/A280-suhde ~1.8 ja A260/A230-suhde 2.0-2.2.

Miksi muunnoskerroin on erilainen DNA:lle, RNA:lle ja proteiineille?

Muunnoskerrointen ero johtuu siitä, että jokaisella biomolekyylillä on ainutlaatuinen extinction-kerroin (kyky absorboida valoa) kemiallisten koostumustensa vuoksi. Kaksoisketjuiselle DNA:lle on muunnoskerroin 50 ng/μL A260=1.0:ssa, kun taas yksinketjuiselle DNA:lle se on 33 ng/μL, RNA:lle 40 ng/μL ja proteiineille (mitattuna 280nm:ssa) se vaihtelee laajasti, mutta keskimäärin noin 1 mg/mL A280=1.0:ssa. Nämä erot johtuvat nukleotidien tai aminohappojen vaihtelevasta koostumuksesta ja niiden vastaavista absorptiopiirteistä.

Kuinka tarkka on spektrofotometrinen DNA-kvantifiointi?

Spektrofotometrinen DNA-kvantifiointi on yleensä tarkka lineaarisella alueella (tyypillisesti A260 välillä 0.1 ja 1.0), tarkkuuden ollessa noin ±3-5%. Kuitenkin tarkkuus heikkenee erittäin alhaisilla konsentraatioilla (alle 5 ng/μL) ja voi olla altis saasteille, kuten proteiineille, RNA:lle, vapaille nukleotideille tai tietyille puskurille. Erittäin tarkkoja mittauksia laimeista näytteistä tai kun korkea puhtaus on tarpeen, suositellaan fluorometrisia menetelmiä, kuten Qubit tai PicoGreen, koska ne ovat spesifisempiä kaksoisketjuiselle DNA:lle.

Kuinka tulkita A260/A280-suhde?

A260/A280-suhde osoittaa DNA-näytteesi puhtauden proteiinisaasteiden suhteen:

• Suhde ~1.8 on yleisesti hyväksytty "puhdas" DNA:lle
• Alhaisemmat suhdeluvut viittaavat proteiinisaasteisiin
• Korkeammat suhdeluvut voivat viitata RNA-saasteisiin
• Liuoksen pH ja ionivahvuus voivat myös vaikuttaa tähän suhteeseen

Vaikka se on hyödyllinen laatutarkastuksena, A260/A280-suhde ei takaa toimivaa DNA:ta, sillä muut saasteet tai DNA:n hajoaminen eivät välttämättä vaikuta tähän suhteeseen.

Voinko mitata DNA:n konsentraatiota värillisissä liuoksissa?

DNA:n konsentraation mittaaminen värillisissä liuoksissa spektrofotometrisesti voi olla haastavaa, sillä väri voi absorboida 260nm:ssa tai lähellä, häiriten DNA-mittausta. Tällaisissa tapauksissa:

1. Suorita aallonpituusskannaus (220-320nm) tarkistaaksesi epänormaalit absorptiokaaviot
2. Käytä fluorometrista menetelmää, kuten Qubit, joka on vähemmän altis näytteen värille
3. Puhdista DNA:ta edelleen värillisten yhdisteiden poistamiseksi
4. Käytä matemaattisia korjauksia, jos häiritsevän yhdisteen absorptiospektri on tunnettu

Mikä on vähimmäistilavuus DNA-konsentraation mittaamiseksi?

Vähimmäistilavuus riippuu käytetystä laitteistosta:

• Perinteiset spektrofotometrit kuvetilla vaativat tyypillisesti 50-100 μL
• Micro-volume-spektrofotometrit, kuten NanoDrop, tarvitsevat vain 0.5-2 μL
• Fluorometriset menetelmät vaativat yleensä 1-20 μL näytettä plus reagenssin tilavuus
• Mikrolevylukijat käyttävät tyypillisesti 100-200 μL per hyvin

Micro-volume-spektrofotometrit ovat mullistaneet DNA:n kvantifioinnin, sillä ne mahdollistavat arvokkaiden näytteiden mittaamisen minimaalisten tilavuusvaatimusten kanssa.

Kuinka lasketaan laimennuskerroin?

Laimennuskerroin lasketaan seuraavasti:

\text{Laimennuskerroin} = \frac{\text{Kokonaisvolyymi (Näyte + Laimennus)}{\text{Näytteen tilavuus}}

Esimerkiksi:

• Jos lisäät 1 μL DNA:ta 99 μL puskuria, laimennuskerroin on 100
• Jos lisäät 5 μL DNA:ta 45 μL puskuria, laimennuskerroin on 10
• Jos käytät laimentamatonta DNA:ta, laimennuskerroin on 1

Käytä aina samaa puskuria laimennukseen kuin mitä käytettiin spektrofotometrin tyhjennykseen.

Kuinka muuntaa eri konsentraatioyksiköiden välillä?

Yleiset DNA-konsentraation yksikkömuunnokset:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM 1000 bp DNA-fragmentille ≈ 660 ng/μL

Muuntaaksesi massakonsentraation (ng/μL) moolikonsentraatioksi (nM) DNA-fragmentille:

$\text{Konsentraatio (nM)} = \frac{\text{Konsentraatio (ng/μL)} \times 10^6}{\text{DNA:n pituus (bp)} \times 660}$

Mitkä tekijät voivat aiheuttaa epätarkkoja DNA-konsentraatiomittauksia?

Useat tekijät voivat johtaa epätarkkoihin DNA-konsentraatiomittauksiin:

1. Saasteet: Proteiinit, fenoli, guanidiini tai muut eristysreagenssit voivat vaikuttaa absorptioon
2. Kuplat: Ilmakuplat valopolulla voivat aiheuttaa virheellisiä lukemia
3. DNA:n hajoaminen: Fragmentoitunut DNA voi muuttaa absorptiopiirteitä
4. Väärä tyhjennys: Eri puskurin käyttäminen tyhjennykseen kuin mitä DNA on liuotettu
5. Ei-homogeeninen liuos: Huonosti sekoitetut DNA-liuokset antavat epätasaisia lukemia
6. Laitteiston kalibrointi: Kalibroimattomat tai likaiset spektrofotometrit tuottavat epäluotettavia tuloksia
7. Mittausten tekeminen lineaarisen alueen ulkopuolella: Erittäin korkeat tai alhaiset absorptioväriarvot eivät ehkä ole tarkkoja

Voinko käyttää tätä laskuria RNA-konsentraation laskemiseen?

Vaikka tämä laskuri on optimoitu kaksoisketjuiselle DNA:lle (käyttäen 50 ng/μL:n muunnoskerrointa), voit mukauttaa sitä RNA:lle:

1. Mittaa A260 kuten tavallisesti
2. Kerro 40:llä 50:n sijasta (RNA:lle spesifinen muunnoskerroin)
3. Käytä asianmukaista laimennuskerrointa

RNA:n kaava olisi: $\text{RNA-konsentraatio (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{Laimennuskerroin}$

Viitteet

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Nukleiinihappojen kvantifiointi absorptio- ja fluoresenssispektroskopialla. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molekyylikloonaus: laboratoriokäsikirja (3. painos). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). A260/A280-suhteen arvo nukleiinihappojen puhtauden mittaamisessa. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). pH:n ja ionivahvuuden vaikutus nukleiinihappojen puhtauden spektrofotometriseen arvioimiseen. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop-mikrotason kvantifiointi nukleiinihapoista. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). DNA:n kvantifioinnin sudenkuopat DNA-sitoutuvien fluoresoivien väriaineiden avulla ja ehdotetut ratkaisut. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Nukleiinihappojen puhtauden arviointi. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Tärkeys mitata nukleiinihappojen absorptio 240 nm:ssä sekä 260 ja 280 nm:ssä. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Eristäminen ja kiteytyminen enolaasista. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Nukleiinihappojen puhtauden valvonnan kelpoisuus A260/A280-suhteiden avulla. BioTechniques, 18(1), 62-63.

Valmis laskemaan DNA-konsentraatiosi? Käytä laskuriamme yllä saadaksesi tarkkoja tuloksia välittömästi. Syötä vain absorptiolukemasi, tilavuus ja laimennuskerroin määrittääksesi sekä konsentraation että kokonaismäärän DNA:ta näytteessäsi.