מחשבון ריכוז DNA

מבוא

מחשבון ריכוז ה-DNA הוא כלי חיוני עבור ביולוגים מולקולריים, גנטיקאים וטכנאי מעבדה הזקוקים לקבוע במדויק את ריכוז ה-DNA בדגימותיהם. מדידת ריכוז ה-DNA היא הליך יסודי במעבדות ביולוגיה מולקולרית, המשמש כשלב בקרת איכות קריטי לפני המשך עם יישומים נוספים כמו PCR, ריצוף, קלונינג וטכניקות מולקולריות אחרות. מחשבון זה משתמש בעקרונות ספקטרופוטומטריים כדי לחשב את ריכוז ה-DNA בהתבסס על ספיגת UV ב-260nm (A260), תוך שימוש בגורם ההמרה הסטנדרטי והתחשבות בכל דילול של הדגימה המקורית.

המחשבון הידידותי למשתמש שלנו מפשט את התהליך של קביעת ריכוז (ng/μL) וכמות כללית של DNA בדגימה שלך, ומבטל את הצורך בחישובים ידניים ומפחית את הסיכון לטעויות מתמטיות. בין אם אתה מכין דגימות לריצוף בדור הבא, כמותן הכנות פלסמיד או מעריך את התשואות של הוצאת DNA גנומי, כלי זה מספק תוצאות מהירות ואמינות כדי לתמוך במחקר ובזרימות העבודה האבחנתיות שלך.

כיצד מחושב ריכוז ה-DNA

העיקרון הבסיסי

חישוב ריכוז ה-DNA מתבסס על חוק ביר-לאמברט, הקובע שספיגת פתרון היא פרופורציונלית ישירות לריכוז של המין הסופג בפתרון ולאורך הדרך של האור דרך הפתרון. עבור DNA דו-גדילי, ספיגה של 1.0 ב-260nm (A260) בקוביית אורך 1 ס"מ מתאימה לריכוז של כ-50 ng/μL.

הנוסחה

ריכוז ה-DNA מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:

$\text{ריכוז DNA (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{גורם דילול}$

איפה:

• A260 הוא קריאת הספיגה ב-260nm
• 50 הוא גורם ההמרה הסטנדרטי עבור DNA דו-גדילי (50 ng/μL עבור A260 = 1.0)
• גורם דילול הוא הגורם שבו הדגימה המקורית דוללה למדידה

כמות ה-DNA הכוללת בדגימה יכולה להיחשב אז על ידי:

$\text{סה"כ DNA (μg)} = \frac{\text{ריכוז (ng/μL)} \times \text{נפח (μL)}}{1000}$

הבנת המשתנים

1. ספיגה ב-260nm (A260):

   • זו המדידה של כמה אור UV ב-260nm נספג על ידי דגימת ה-DNA
   • נוקלאוטידים של DNA (בעיקר הבסיסים החנקניים) סופגים אור UV עם ספיגה מקסימלית ב-260nm
   • ככל שהספיגה גבוהה יותר, כך יותר DNA נוכח בפתרון

2. גורם ההמרה (50):

   • גורם ההמרה הסטנדרטי של 50 ng/μL הוא ספציפי עבור DNA דו-גדילי
   • עבור DNA חד-גדילי, הגורם הוא 33 ng/μL
   • עבור RNA, הגורם הוא 40 ng/μL
   • עבור אוליגונוקלאוטידים, הגורם משתנה בהתאם לרצף

3. גורם דילול:

   • אם הדגימה דוללה לפני המדידה (למשל, 1 חלק דגימה ל-9 חלקי דילול = גורם דילול של 10)
   • מחושב כ: (נפח הדגימה + נפח הדילול) ÷ נפח הדגימה
   • משמש לקביעת הריכוז בדגימה המקורית, הלא מדוללת

4. נפח:

   • הנפח הכולל של פתרון ה-DNA שלך במיקרוליטרים (μL)
   • משמש לחישוב כמות ה-DNA הכוללת בדגימה

כיצד להשתמש במחשבון זה

עקוב אחרי הצעדים האלה כדי לקבוע במדויק את ריכוז ה-DNA שלך:

1. הכן את הדגימה שלך:

   • ודא שדגימת ה-DNA שלך מומסת ומעורבת כראוי
   • אם הריכוז הצפוי גבוה, הכין דילול כדי לוודא שהקריאה נמצאת בטווח הליניארי (בדרך כלל A260 בין 0.1 ל-1.0)

2. מדוד ספיגה:

   • השתמש בספקטרופוטומטר או מכשיר ננו-דרופ כדי למדוד את הספיגה ב-260nm
   • מדוד גם את הספיגה ב-280nm כדי להעריך טוהר (יחס A260/A280)
   • השתמש באותו דילול שבו מומס/דולל ה-DNA כבלנקה

3. הכנס ערכים במחשבון:

   • הזן את ערך A260 שנמדד בשדה "ספיגה ב-260nm"
   • הזן את הנפח הכולל של פתרון ה-DNA שלך במיקרוליטרים
   • הזן את גורם הדילול (השתמש ב-1 אם לא בוצע דילול)

4. פרש את התוצאות:

   • המחשבון יציג את ריכוז ה-DNA ב-ng/μL
   • כמות ה-DNA הכוללת בדגימה תוצג ב-μg
   • השתמש בערכים אלו כדי לקבוע את הנפח המתאים הנדרש ליישומים נוספים

5. העריך את טוהר ה-DNA (אם נמדד A280):

   • יחס A260/A280 של ~1.8 מצביע על DNA טהור
   • יחסים נמוכים יותר עשויים להעיד על זיהום חלבוני
   • יחסים גבוהים יותר עשויים להצביע על זיהום RNA

מקרים לשימוש

מדידת ריכוז ה-DNA היא קריטית במספר יישומים בביולוגיה מולקולרית ובביוטכנולוגיה:

קלונינג מולקולרי

לפני הליגציה של קטעי DNA לתוך וקטורים, ידיעת הריכוז המדויק מאפשרת לחוקרים לחשב את יחס הקטע לוקטור האופטימלי, מה שממקסם את היעילות של ההעברה. לדוגמה, יחס של 3:1 של קטע לוקטור לרוב מספק את התוצאות הטובות ביותר, מה שדורש מדידות ריכוז מדויקות של שני המרכיבים.

PCR ו-qPCR

תגובות PCR דורשות בדרך כלל 1-10 ng של DNA תבנית להAmplification אופטימלית. מעט מדי DNA עשוי להוביל לכישלון בהAmplification, בעוד שיותר מדי עשוי להפריע לתגובה. עבור PCR כמותי (qPCR), נדרשת מדידה מדויקת עוד יותר של DNA כדי להבטיח עקומות סטנדרטיות מדויקות וכימות מהימן.

ריצוף בדור הבא (NGS)

פרוטוקולי הכנת ספריות NGS מציינים כמויות קלט מדויקות של DNA, לעיתים בטווח של 1-500 ng בהתאם לפלטפורמה וליישום. מדידת ריכוז מדויקת היא חיונית להכנת ספריות מוצלחות ולייצוג מאוזן של דגימות בריצופים מרובי-מקטעים.

ניסויי העברה

בעת הכנסת DNA לתוך תאי eukaryotic, כמות ה-DNA האופטימלית משתנה לפי סוג התא ושיטת ההעברה. בדרך כלל, משתמשים ב-0.5-5 μg של DNA פלסמיד לכל שקע בפורמט של לוח 6-שקעים, מה שדורש מדידת ריכוז מדויקת כדי לסטנדרטיזציה של ניסויים.

ניתוח DNA פורנזי

ביישומים פורנזיים, דגימות DNA לעיתים קרובות מוגבלות ויקרות. כימות מדויק מאפשר למדעני פורנזיה לקבוע אם יש מספיק DNA נוכח לפרופילינג ולסטנדרטיזציה של כמות ה-DNA בשימוש בניתוחים נוספים.

עיכול אנזימי רסטריקציה

אנזימי רסטריקציה יש יחידות פעילות ספציפיות המוגדרות לכל μg של DNA. ידיעת הריכוז המדויק של ה-DNA מאפשרת יחס נכון של אנזים ל-DNA, מה שמבטיח עיכול מלא ללא פעילות כוכבית (חתכים לא ספציפיים).

חלופות למדידת DNA בספקטרופוטומטריה

בעוד שספקטרופוטומטריה UV היא השיטה הנפוצה ביותר לכימות DNA, קיימות מספר חלופות:

1. שיטות פלואורומטריות:

   • צבעי פלורסנט כמו PicoGreen, Qubit ו-SYBR Green נקשרים ספציפית ל-DNA דו-גדילי
   • רגישות יותר מאשר ספקטרופוטומטריה (יכולה לזהות עד 25 pg/mL)
   • פחות מושפעות מזיהומים כמו חלבונים, RNA או נוקלאוטידים חופשיים
   • דורשות פלואורומטר ותגובות ספציפיות

2. אלקטרופורזה בג'ל אגרוז:

   • ניתן לכמת DNA על ידי השוואת אינטנסיביות של רצועות לסטנדרטים של ריכוז ידוע
   • מספקת מידע על גודל והגינות ה-DNA בו זמנית
   • פחות מדויקת משיטות ספקטרופוטומטריות או פלואורומטריות
   • לוקחת יותר זמן אך שימושית לאישור חזותי

3. PCR בזמן אמת:

   • שיטה רגישה מאוד לכימות רצפי DNA ספציפיים
   • יכולה לזהות ריכוזים נמוכים מאוד (עד כמה עותקים)
   • דורשת פרימרים ספציפיים וציוד מורכב יותר
   • משמשת כאשר נדרשת כימות ספציפית לרצף

4. PCR דיגיטלי:

   • כימות מוחלט ללא עקומות סטנדרטיות
   • מדויק מאוד עבור מטרות נדירות
   • יקר ודורש ציוד מיוחד
   • משמש לזיהוי מוטציות נדירות ולניתוח וריאציות במספר העותקים

היסטוריה של מדידת ריכוז DNA

היכולת למדוד במדויק את ריכוז ה-DNA התפתחה באופן משמעותי במקביל להתקדמות הביולוגיה המולקולרית:

שיטות מוקדמות (1950s-1960s)

לאחר גילוי מבנה ה-DNA על ידי ווטסון וקריק בשנת 1953, התחילו מדענים לפתח שיטות לבודד ולכמת DNA. הגישות המוקדמות התבססו על ניסויים צבעוניים כמו תגובת דיפנילאמין, שהפיקה צבע כחול כאשר הגיבה עם סוכרים דיאוקסיריבוזים ב-DNA. שיטות אלו היו יחסית לא רגישות ופגיעות להפרעות.

עידן הספקטרופוטומטריה (1970s)

היישום של ספקטרופוטומטריה UV לכימות חומצות גרעין הפך לנפוץ בשנות ה-70. מדענים גילו ש-DNA סופג אור UV עם מקסימום ב-260nm, ושהקשר בין ספיגה לריכוז היה ליניארי בטווח מסוים. גורם ההמרה של 50 ng/μL עבור DNA דו-גדילי ב-A260=1.0 הוקם בתקופה זו.

מהפכת הפלואורומטריה (1980s-1990s)

פיתוח צבעי פלורסנט ספציפיים ל-DNA בשנות ה-80 וה-90 שינה את כימות ה-DNA, במיוחד עבור דגימות מדוללות. צבעי הוֹאֶקְשְׁט ו-PicoGreen אפשרו זיהוי רגיש הרבה יותר ממה שהיה אפשרי עם ספקטרופוטומטריה. שיטות אלו הפכו לחשובות במיוחד עם הופעת ה-PCR, שדרשה לעיתים קרובות כימות מדויק של כמויות מינימליות של DNA.

עידן המודרני (2000s-נוכחי)

הצגת ספקטרופוטומטרים מיקרו-נפח כמו ה-NanoDrop בתחילת שנות ה-2000 הפכה את כימות ה-DNA השגרתית למהירה ונוחה יותר, על ידי כך שדרשה רק 0.5-2 μL של דגימה. טכנולוגיה זו ביטלה את הצורך בדילולים ובקוביות, מה שהפך את התהליך למהיר ונוח יותר.

היום, טכניקות מתקדמות כמו PCR דיגיטלי וריצוף בדור הבא דחפו את גבולות כימות ה-DNA עוד יותר, ומאפשרות כימות מוחלט של רצפים ספציפיים וזיהוי של מולקולות בודדות. עם זאת, העיקרון הבסיסי של ספקטרופוטומטריה שהוקם לפני עשורים נשאר הבסיס של מדידת ריכוז DNA שגרתית במעבדות ברחבי העולם.

דוגמאות מעשיות

בואו נעבור על כמה דוגמאות מעשיות לחישובי ריכוז DNA:

דוגמה 1: הכנת פלסמיד סטנדרטי

חוקר טיהר פלסמיד וקיבל את המדידות הבאות:

• קריאת A260: 0.75
• דילול: 1:10 (גורם דילול = 10)
• נפח פתרון ה-DNA: 50 μL

חישוב:

• ריכוז = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• סה"כ DNA = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

דוגמה 2: הוצאת DNA גנומי

לאחר הוצאת DNA גנומי מדם:

• קריאת A260: 0.15
• ללא דילול (גורם דילול = 1)
• נפח פתרון ה-DNA: 200 μL

חישוב:

• ריכוז = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• סה"כ DNA = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

דוגמה 3: הכנת DNA לריצוף

פרוטוקול הריצוף דורש בדיוק 500 ng של DNA:

• ריכוז DNA: 125 ng/μL
• כמות נדרשת: 500 ng

נפח נדרש = 500 ÷ 125 = 4 μL של פתרון DNA

דוגמאות קוד

הנה דוגמאות כיצד לחשב ריכוז DNA בשפות תכנות שונות:

1' נוסחת Excel לריכוז DNA
2=A260*50*גורם_דילול
3
4' נוסחת Excel לכמות DNA הכוללת ב-μg
5=(A260*50*גורם_דילול*נפח)/1000
6
7' דוגמה בתא עם A260=0.5, גורם_דילול=2, נפח=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' תוצאה: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    Calculate DNA concentration in ng/μL
4    
5    Parameters:
6    absorbance (float): Absorbance reading at 260nm
7    dilution_factor (float): Dilution factor of the sample
8    
9    Returns:
10    float: DNA concentration in ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    Calculate total DNA amount in μg
17    
18    Parameters:
19    concentration (float): DNA concentration in ng/μL
20    volume_ul (float): Volume of DNA solution in μL
21    
22    Returns:
23    float: Total DNA amount in μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Example usage
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNA Concentration: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Total DNA: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // Returns DNA concentration in ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // Returns total DNA amount in μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Example usage
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA Concentration: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Total DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * Calculate DNA concentration in ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance Absorbance reading at 260nm
6     * @param dilutionFactor Dilution factor of the sample
7     * @return DNA concentration in ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * Calculate total DNA amount in μg
15     * 
16     * @param concentration DNA concentration in ng/μL
17     * @param volumeUL Volume of DNA solution in μL
18     * @return Total DNA amount in μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNA Concentration: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("Total DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# פונקציה ב-R לחישוב ריכוז DNA
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # Returns DNA concentration in ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # Returns total DNA amount in μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# Example usage
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNA Concentration: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("Total DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

שאלות נפוצות

מה ההבדל בין ריכוז DNA לטוהר DNA?

ריכוז DNA מתייחס לכמות ה-DNA הנמצאת בפתרון, בדרך כלל נמדדת ב-ng/μL או μg/mL. זה אומר לך כמה DNA יש לך אך לא מצביע על איכות. טוהר DNA מעריך את נוכחות הזיהומים בדגימת ה-DNA שלך, בדרך כלל נמדד על ידי יחס ספיגה כמו A260/A280 (לזיהום חלבוני) ו-A260/A230 (לזיהום תרכובות אורגניות). DNA טהור בדרך כלל יש יחס A260/A280 של ~1.8 ויחס A260/A230 של 2.0-2.2.

מדוע גורם ההמרה שונה עבור DNA, RNA וחלבונים?

גורמי ההמרה שונים מכיוון שלכל ביומולקולה יש מקדם הכחדה ייחודי (יכולת לספוג אור) בשל הרכבים הכימיים השונים שלהן. DNA דו-גדילי יש גורם המרה של 50 ng/μL ב-A260=1.0, בעוד ש-DNA חד-גדילי הוא 33 ng/μL, RNA הוא 40 ng/μL, וחלבונים (נמדדים ב-280nm) משתנים במידה רבה אך ממוצעים סביב 1 mg/mL ב-A280=1.0. הבדלים אלו נובעים מהרכבים משתנים של נוקלאוטידים או חומצות אמינו ותכונות הספיגה שלהם.

עד כמה מדויקת מדידת ריכוז DNA בספקטרופוטומטריה?

מדידת ריכוז DNA בספקטרופוטומטריה היא בדרך כלל מדויקת בטווח הליניארי (בדרך כלל A260 בין 0.1 ל-1.0), עם דיוק של כ-±3-5%. עם זאת, הדיוק פוחת בריכוזים מאוד נמוכים (מתחת ל-5 ng/μL) ויכול להיות מושפע מזיהומים כמו חלבונים, RNA, נוקלאוטידים חופשיים או דילולים מסוימים. עבור מדידות מדויקות מאוד של דגימות מדוללות או כאשר נדרשת טוהר גבוהה, מומלץ להשתמש בשיטות פלואורומטריות כמו Qubit או PicoGreen, שהן יותר ספציפיות ל-DNA דו-גדילי.

כיצד לפרש את יחס A260/A280?

יחס A260/A280 מצביע על טוהר דגימת ה-DNA שלך ביחס לזיהום חלבוני:

• יחס של ~1.8 בדרך כלל מתקבל כ"טהור" עבור DNA
• יחסים מתחת ל-1.8 מצביעים על זיהום חלבוני
• יחסים מעל 2.0 עשויים להצביע על זיהום RNA
• pH ועוצמת יונים של הפתרון עשויים גם להשפיע על יחס זה

בעוד שזה שימושי כבדיקת איכות, יחס A260/A280 לא מבטיח DNA פונקציונלי, שכן זיהומים אחרים או הרס DNA עשויים לא להשפיע על יחס זה.

האם אני יכול למדוד ריכוז DNA בפתרונות צבעוניים?

מדידת ריכוז DNA בפתרונות צבעוניים באמצעות ספקטרופוטומטריה עשויה להיות מאתגרת מכיוון שהצבע עשוי לספוג ב-260nm או קרוב, מה שמפריע למדידה של ה-DNA. במקרים כאלה:

1. בצע סריקת אורך גל (220-320nm) כדי לבדוק דפוסי ספיגה לא נורמליים
2. השתמש בשיטה פלואורומטרית כמו Qubit, שהיא פחות מושפעת מצבע הדגימה
3. טהר את ה-DNA עוד יותר כדי להסיר את התרכובות הצבעוניות
4. החל תיקונים מתמטיים אם ספקטרום הספיגה של התרכובת המפריעה ידוע

מהו הנפח המינימלי הנדרש למדידת ריכוז DNA?

הנפח המינימלי תלוי במכשיר שבו משתמשים:

• ספקטרופוטומטרים מסורתיים עם קוביות בדרך כלל דורשים 50-100 μL
• ספקטרופוטומטרים מיקרו-נפח כמו NanoDrop זקוקים רק ל-0.5-2 μL
• שיטות פלואורומטריות בדרך כלל דורשות 1-20 μL של דגימה בנוסף לנפח הריאגנט
• קוראי מיקרופלט בדרך כלל משתמשים ב-100-200 μL לכל שקע

ספקטרופוטומטרים מיקרו-נפח שינו את כימות ה-DNA על ידי כך שהפכו את המדידות של דגימות יקרות לדרוש מינימום של נפח.

כיצד אני מחשב את גורם הדילול?

גורם הדילול מחושב כ:

$\text{גורם דילול} = \frac{\text{נפח כולל (דגימה + דילול)}}{\text{נפח דגימה}}$

לדוגמה:

• אם אתה מוסיף 1 μL של DNA ל-99 μL של דילול, גורם הדילול הוא 100
• אם אתה מוסיף 5 μL של DNA ל-45 μL של דילול, גורם הדילול הוא 10
• אם אתה משתמש ב-DNA לא מדולל, גורם הדילול הוא 1

תמיד השתמש באותו דילול לדילול כמו שהשתמשת כדי לבטל את הספקטרופוטומטר.

כיצד להמיר בין יחידות ריכוז שונות?

המרות יחידות ריכוז DNA נפוצות:

• 1 ng/μL = 1 μg/mL
• 1 μg/mL = 0.001 mg/mL
• 1 ng/μL = 1000 pg/μL
• 1 μM של קטע DNA באורך 1000 bp ≈ 660 ng/μL

כדי להמיר מריכוז מסה (ng/μL) לריכוז מולי (nM) עבור קטע DNA:

$\text{ריכוז (nM)} = \frac{\text{ריכוז (ng/μL)} \times 10^6}{\text{אורך DNA (bp)} \times 660}$

מה יכול לגרום למדידות ריכוז DNA לא מדויקות?

מספר גורמים עשויים להוביל למדידות ריכוז DNA לא מדויקות:

1. זיהום: חלבונים, פנול, גואנידין או ריאגנטים אחרים עשויים להשפיע על הספיגה
2. בועות: בועות אוויר במסלול האור עשויות לגרום לקריאות שגויות
3. הרס DNA: DNA מפורק עשוי להיות בעל תכונות ספיגה שונות
4. ביטול לא נכון: שימוש בדילול שונה מהדילול שבו מומס ה-DNA
5. פתרון לא הומוגני: דגימות DNA שלא מעורבות כראוי נותנות קריאות לא עקביות
6. כיול מכשירים: ספקטרופוטומטרים לא מכוילים או מלוכלכים מייצרים תוצאות לא אמינות
7. מדידות מחוץ לטווח הליניארי: ערכי ספיגה מאוד גבוהים או מאוד נמוכים עשויים לא להיות מדויקים

האם אני יכול להשתמש במחשבון הזה עבור ריכוז RNA?

בעוד שמחשבון זה מותאם עבור DNA דו-גדילי (באמצעות גורם ההמרה של 50 ng/μL), אתה יכול להתאים אותו עבור RNA על ידי:

1. מדידת A260 כרגיל
2. הכפלת ב-40 במקום 50 (הגורם הספציפי ל-RNA)
3. החלת גורם הדילול המתאים

הנוסחה עבור RNA תהיה: $\text{ריכוז RNA (ng/μL)} = A_{260} \times 40 \times \text{גורם דילול}$

מקורות

1. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.

2. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208-210.

4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22(3), 474-481.

5. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.

6. Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). Pitfalls of DNA Quantification Using DNA-Binding Fluorescent Dyes and Suggested Solutions. PLOS ONE, 11(3), e0150528.

7. Thermo Fisher Scientific. (2010). Assessment of Nucleic Acid Purity. T042-Technical Bulletin.

8. Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. BioTechniques, 18(4), 636.

9. Warburg, O., & Christian, W. (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.

10. Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques, 18(1), 62-63.

מוכן לחשב את ריכוז ה-DNA שלך? השתמש במחשבון שלנו למעלה כדי לקבל תוצאות מדויקות מיד. פשוט הכנס את קריאת הספיגה שלך, נפח וגורם דילול כדי לקבוע גם את הריכוז וגם את הכמות הכוללת של DNA בדגימה שלך.