qPCR Effektivitetsberegner: Analyser Standardkurver & Amplifikation
Beregn PCR-effektivitet ud fra Ct-værdier og fortyndingsfaktorer. Analyser standardkurver, bestem amplifikationseffektivitet, og valider dine kvantitative PCR-eksperimenter.
qPCR Effektivitet Beregner
Indtastningsparametre
Ct Værdier
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Resultater
Standardkurve
Indtast gyldige data for at generere diagram
Information
qPCR effektivitet er et mål for, hvor godt PCR reaktionen fungerer. En effektivitet på 100% betyder, at mængden af PCR produkt fordobles med hver cyklus under den eksponentielle fase.
Effektiviteten beregnes ud fra hældningen af standardkurven, som opnås ved at plotte Ct værdierne mod logaritmen af den indledende skabelon koncentration (fortyndingsserie).
Effektiviteten (E) beregnes ved hjælp af formlen:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentation
qPCR Effektivitetsberegner: Optimer Dine Kvantitative PCR Eksperimenter
Introduktion til qPCR Effektivitet
Kvantitativ Polymerase Kædereaktion (qPCR) effektivitet er en kritisk parameter, der direkte påvirker nøjagtigheden og pålideligheden af dine qPCR eksperimenter. qPCR effektivitetsberegneren hjælper forskere med at bestemme, hvor effektivt deres PCR reaktioner forstærker mål-DNA sekvenser med hver termisk cyklus. Ideelle qPCR reaktioner bør have en effektivitet mellem 90-110%, hvilket indikerer, at mængden af PCR-produkt omtrent fordobles med hver cyklus under den eksponentielle fase.
Dårlig forstærknings effektivitet kan føre til unøjagtig kvantificering, upålidelige resultater og fejlagtige eksperimentelle konklusioner. Ved at beregne og overvåge din qPCR effektivitet kan du optimere reaktionsbetingelser, validere primerdesign og sikre kvaliteten af dine kvantitative PCR data.
Denne beregner bruger standardkurvemetoden, som plottet cyklustærskel (Ct) værdier mod logaritmen af skabelonkoncentration (repræsenteret ved serielle fortyndinger), til at bestemme effektiviteten af din qPCR assay. Den resulterende hældning af denne standardkurve bruges derefter til at beregne forstærknings effektiviteten ved hjælp af en ligetil matematisk formel.
qPCR Effektivitetsformel og Beregning
Effektiviteten af en qPCR reaktion beregnes fra hældningen af standardkurven ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
- E er effektiviteten (udtrykt som en decimal)
- Hældning er hældningen af standardkurven (plotting Ct værdier mod log fortynding)
For en ideel PCR reaktion med 100% effektivitet (perfekt fordobling af ampliconer med hver cyklus) ville hældningen være -3.32. Dette skyldes:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (eller 100%)}
Effektiviteten procent beregnes ved at multiplicere decimal effektiviteten med 100:
\text{Effektivitet (%)} = E \times 100\%
Forståelse af Standardkurven
Standardkurven oprettes ved at plotte Ct værdierne (y-akse) mod logaritmen af den indledende skabelonkoncentration eller fortyndingsfaktor (x-akse). Forholdet mellem disse variabler bør være lineært, og kvaliteten af dette lineære forhold vurderes ved hjælp af determinationskoefficienten (R²).
For pålidelige qPCR effektivitetsberegninger:
- R² værdien bør være ≥ 0.98
- Hældningen bør typisk være mellem -3.1 og -3.6
- Mindst 3-5 fortyndingspunkter bør bruges til at oprette standardkurven
Trin-for-trin Beregningsproces
-
Dataforberedelse: Beregneren tager dine Ct værdier for hvert fortyndingspunkt og fortyndingsfaktoren som input.
-
Log transformation: Fortyndingsserien transformeres til en logaritmisk skala (log base 10).
-
Lineær regression: Beregneren udfører lineær regressionsanalyse på de log-transformerede data for at bestemme hældningen, y-aksens skæring og R² værdi.
-
Effektivitetsberegning: Ved hjælp af hældningsværdien beregnes effektiviteten ved hjælp af formelen E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Resultatfortolkning: Beregneren viser effektiviteten som en procentdel, sammen med hældningen og R² værdien for at hjælpe dig med at vurdere pålideligheden af din qPCR assay.
Sådan Bruger Du qPCR Effektivitetsberegneren
Følg disse trin for at beregne din qPCR effektivitet:
-
Indstil antallet af fortyndinger: Vælg, hvor mange fortyndingspunkter du har i din standardkurve (mellem 3-7 punkter anbefales).
-
Indtast fortyndingsfaktoren: Indtast den fortyndingsfaktor, der blev brugt mellem de på hinanden følgende prøver (f.eks. 10 for en 10-fold fortyndingsserie, 5 for en 5-fold fortyndingsserie).
-
Indtast Ct værdier: Indtast Ct værdierne for hvert fortyndingspunkt. Typisk indeholder den første fortynding (Fortynding 1) den højeste koncentration af skabelon, hvilket resulterer i den laveste Ct værdi.
-
Vis resultater: Beregneren beregner automatisk og viser:
- PCR effektivitet (%)
- Hældning af standardkurven
- Y-aksens skæring
- R² værdi (determinationskoefficient)
- En visuel repræsentation af standardkurven
-
Fortolk resultater: Vurder, om din qPCR effektivitet ligger inden for det acceptable område (90-110%) og om R² værdien indikerer en pålidelig standardkurve (≥ 0.98).
-
Kopier resultater: Brug knappen "Kopier Resultater" til at kopiere alle beregnede værdier til dine optegnelser eller publikationer.
Eksempelberegning
Lad os gennemgå et eksempel:
- Fortyndingsfaktor: 10 (10-fold seriel fortynding)
- Antal fortyndinger: 5
- Ct værdier:
- Fortynding 1 (højeste koncentration): 15.0
- Fortynding 2: 18.5
- Fortynding 3: 22.0
- Fortynding 4: 25.5
- Fortynding 5 (laveste koncentration): 29.0
Når det plottes på en standardkurve:
- X-aksen repræsenterer log(fortynding): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-aksen repræsenterer Ct værdier: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Beregningsprogrammet udfører lineær regression og bestemmer:
- Hældning: -3.5
- Y-aksens skæring: 15.0
- R²: 1.0 (perfekt lineært forhold i dette eksempel)
Ved hjælp af effektivitetsformlen:
Dette indikerer en god qPCR effektivitet på 93%, som ligger inden for det acceptable område på 90-110%.
Anvendelsesområder for qPCR Effektivitetsberegninger
1. Primer Validering og Optimering
Før du bruger et nyt primerpar til kvantitative eksperimenter, er det vigtigt at validere dets ydeevne. Beregning af qPCR effektivitet hjælper med at:
- Vurdere primer specifikhed og ydeevne
- Optimere primer koncentrationer
- Bestemme den optimale annealing temperatur
- Validere primerpar på tværs af forskellige skabelonkoncentrationer
2. Assay Udvikling og Validering
Når der udvikles nye qPCR assays, er effektivitetsberegninger afgørende for:
- At sikre pålidelig kvantificering på tværs af det dynamiske område
- At validere den nedre grænse for påvisning
- At bekræfte assay reproducerbarhed
- At sammenligne forskellige detektionskemier (SYBR Green vs. TaqMan prober)
3. Gen Expressionsstudier
I relative kvantificerings eksperimenter er det vigtigt at kende PCR effektiviteten for:
- At anvende passende kvantificeringsmodeller (ΔΔCt vs. effektivitet-korrigerede modeller)
- At normalisere mål gener mod reference gener med forskellige effektivitet
- At sikre nøjagtige fold-ændringsberegninger
- At validere resultater på tværs af forskellige eksperimentelle betingelser
4. Diagnostiske og Kliniske Anvendelser
I kliniske og diagnostiske indstillinger er qPCR effektivitet vigtig for:
- At validere diagnostiske assays før klinisk implementering
- At sikre ensartet ydeevne på tværs af forskellige prøvetyper
- At opfylde regulatoriske krav til assay validering
- At overvåge kvalitetskontrol i rutinetestning
5. Miljø- og Fødevaretest
For miljø- og fødevaresikkerhedsapplikationer hjælper effektivitetsberegninger med:
- At validere detektionsmetoder for patogener eller GMO'er
- At sikre ensartet ydeevne på tværs af komplekse prøvematricer
- At bestemme detektionsgrænser i udfordrende prøver
- At overholde teststandarder og regler
Alternativer til Standardkurvemetoden
Mens standardkurvemetoden er den mest almindelige tilgang til at beregne qPCR effektivitet, er der alternative metoder:
1. Enkelt Amplicon Effektivitetsanalyse
Denne metode beregner effektivitet ud fra fluorescensdata fra en enkelt amplifikationskurve, uden at der kræves en fortyndingsserie. Software som LinRegPCR analyserer den eksponentielle fase af individuelle reaktioner for at bestemme effektivitet.
Fordele:
- Ingen behov for fortyndingsserie
- Kan beregne effektivitet for hver enkelt reaktion
- Nyttig når prøvemateriale er begrænset
Ulemper:
- Kan være mindre præcis end standardkurvemetoden
- Kræver specialiseret software til analyse
- Mere følsom over for baggrundsfluorescensproblemer
2. Absolut Kvantificering med Digital PCR
Digital PCR (dPCR) giver absolut kvantificering uden at kræve en standardkurve eller effektivitetsberegninger.
Fordele:
- Ingen behov for effektivitetsberegninger
- Højere præcision for lav-abundance mål
- Mindre påvirket af hæmmere
Ulemper:
- Kræver specialiseret udstyr
- Højere omkostninger pr. prøve
- Begrænset dynamisk område sammenlignet med qPCR
3. Sammenlignende Kvantificeringsmetoder
Nogle qPCR analyse software tilbyder sammenlignende kvantificeringsmetoder, der estimerer effektivitet uden en fuld standardkurve.
Fordele:
- Kræver færre prøver end en komplet standardkurve
- Kan udføres sammen med eksperimentelle prøver
- Nyttig til rutinemæssig analyse
Ulemper:
- Kan være mindre præcis end en komplet standardkurve
- Begrænset validering af det lineære dynamiske område
- Kan muligvis ikke opdage hæmningsproblemer
Historie om qPCR og Effektivitetsberegninger
Udviklingen af qPCR og effektivitetsberegninger er udviklet betydeligt i løbet af de sidste par årtier:
Tidlig Udvikling (1980'erne-1990'erne)
Polymerase Kædereaktion (PCR) blev opfundet af Kary Mullis i 1983, hvilket revolutionerede molekylærbiologi. Dog var traditionel PCR kun kvalitativ eller semi-kvantitativ. Det første realtids PCR-system blev udviklet i begyndelsen af 1990'erne af Russell Higuchi og kolleger, der demonstrerede, at overvågning af PCR produkter, mens de akkumulerede (ved hjælp af ethidiumbromid fluorescens), kunne give kvantitative oplysninger.
Etablering af qPCR Standarder (1990'erne-2000'erne)
Som qPCR teknologi avancerede, anerkendte forskere vigtigheden af standardisering og validering. Begrebet PCR effektivitet blev centralt for pålidelig kvantificering:
- I 1998 introducerede Pfaffl effektivitet-korrigerede kvantificeringsmodeller
- Standardkurvemetoden til beregning af effektivitet blev bredt vedtaget
- Kommercielle qPCR systemer med forbedrede detektionskemier dukkede op
Moderne Udviklinger (2000'erne-Nu)
Feltet er fortsat med at udvikle sig med:
- Udgivelsen af MIQE retningslinjerne (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) i 2009, der understreger vigtigheden af at rapportere PCR effektivitet
- Udviklingen af avanceret analyse software til effektivitetsberegninger
- Integration af effektivitetsberegninger i qPCR instrumenter og software
- Fremkomsten af digital PCR som en komplementær teknologi
I dag betragtes beregning og rapportering af qPCR effektivitet som essentielt for offentliggørelse af pålidelige qPCR data, og værktøjer som denne beregner hjælper forskere med at overholde bedste praksis inden for feltet.
Kodeeksempler til Beregning af qPCR Effektivitet
Excel
1' Excel formel til at beregne qPCR effektivitet fra hældning
2' Placer i celle B2, hvis hældning er i celle A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formel til at konvertere effektivitet til procent
6' Placer i celle C2, hvis effektivitet decimal er i celle B2
7=B2*100
8
9' Funktion til at beregne effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Beregn lineær regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Beregn hældning
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Beregn effektivitet
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R funktion til at beregne qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Opret log fortyndingsværdier
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Udfør lineær regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Udtræk hældning og R-kvadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Beregn effektivitet
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Returner resultater
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Eksempel på brug
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Effektivitet: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Hældning: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Beregn qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor.
8
9 Parametre:
10 ct_values (list): Liste over Ct værdier
11 dilution_factor (float): Fortyndingsfaktor mellem på hinanden følgende prøver
12
13 Returnerer:
14 dict: Ordbog, der indeholder effektivitet, hældning, r_squared og intercept
15 """
16 # Opret log fortyndingsværdier
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Udfør lineær regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Beregn effektivitet
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot standardkurven med regressionslinje.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generer punkter til regressionslinje
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Fortynding')
48 plt.ylabel('Ct Værdi')
49 plt.title('qPCR Standardkurve')
50
51 # Tilføj ligning og R² til plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Effektivitet = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Eksempel på brug
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Effektivitet: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Hældning: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot standardkurven
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Beregn qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array af Ct værdier
4 * @param {number} dilutionFactor - Fortyndingsfaktor mellem på hinanden følgende prøver
5 * @returns {Object} Objekt, der indeholder effektivitet, hældning, rSquared og intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Opret log fortyndingsværdier
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Beregn gennemsnit for lineær regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Beregn hældning og intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Beregn R-kvadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Beregn effektivitet
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Eksempel på brug
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Effektivitet: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Hældning: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Ofte Stillede Spørgsmål (FAQ)
Hvad er en god qPCR effektivitet procent?
En god qPCR effektivitet ligger typisk mellem 90% og 110% (0.9-1.1). En effektivitet på 100% repræsenterer perfekt fordobling af PCR produktet med hver cyklus. Effektiviteter uden for dette interval kan indikere problemer med primerdesign, reaktionsbetingelser eller tilstedeværelsen af hæmmere.
Hvorfor er min qPCR effektivitet større end 100%?
Effektiviteter større end 100% kan forekomme på grund af:
- Pipetteringsfejl i fortyndingsserien
- Tilstedeværelse af PCR hæmmere, der påvirker højere koncentrationer mere end lavere
- Ikke-specifik forstærkning eller primer-dimere, der bidrager til signalet
- Problemer med baseline korrektion i qPCR analysen
Hvad indikerer en lav R² værdi i min standardkurve?
En lav R² værdi (under 0.98) antyder dårlig linearitet i din standardkurve, hvilket kan skyldes:
- Pipetteringsfejl under forberedelsen af fortyndingsserien
- Inkonsistent forstærkning på tværs af koncentrationsområdet
- At nå detektionsgrænser ved meget lave eller høje koncentrationer
- PCR hæmning, der påvirker nogle fortyndingspunkter mere end andre
- Dårlig primer ydeevne eller ikke-specifik forstærkning
Hvor mange fortyndingspunkter skal jeg bruge til at beregne qPCR effektivitet?
For pålidelige effektivitetsberegninger kræves et minimum af 3 fortyndingspunkter, men 5-6 punkter anbefales for mere præcise resultater. Disse punkter bør spænde over hele det dynamiske område af forventede skabelonkoncentrationer i dine eksperimentelle prøver.
Hvordan påvirker qPCR effektivitet relative kvantificeringsberegninger?
I relativ kvantificering ved hjælp af ΔΔCt metoden antages det, at mål- og referencegenerne har ens effektivitet (ideelt 100%). Når effektiviteten adskiller sig betydeligt:
- Kan den standard ΔΔCt metode føre til betydelige kvantificeringsfejl
- Effektivitet-korrigerede beregningsmodeller (som Pfaffl metoden) bør anvendes
- Fejlens størrelse stiger med større Ct forskelle mellem prøverne
Kan jeg bruge den samme effektivitet værdi for alle mine qPCR eksperimenter?
Nej, effektivitet bør bestemmes for hvert primerpar og bør re-valideres:
- Når der bruges nye primerpartier
- Når reaktionsbetingelser eller mastermix ændres
- Når der arbejdes med forskellige prøvetyper eller ekstraktionsmetoder
- Periodisk som en del af kvalitetskontrol
Hvordan påvirker PCR hæmmere effektivitet beregninger?
PCR hæmmere kan:
- Reducere den samlede effektivitet
- Påvirke højere koncentrationer mere alvorligt
- Skabe ikke-linearitet i standardkurven
- Føre til undervurdering af mål abundans
- Forårsage inkonsistent forstærkning på tværs af replikater
Hvad er forskellen mellem qPCR effektivitet og PCR effektivitet?
Begreberne bruges ofte om hinanden, men:
- qPCR effektivitet refererer specifikt til effektiviteten målt i realtids kvantitativ PCR
- PCR effektivitet kan referere til det generelle koncept i enhver PCR reaktion
- qPCR effektivitet måles kvantitativt ved hjælp af standardkurver eller andre metoder
- Traditionel PCR effektivitet vurderes ofte kvalitativt ved gel elektroforese
Hvordan kan jeg forbedre min qPCR effektivitet?
For at forbedre qPCR effektivitet:
- Optimere primerdesign (18-22 bp længde, 50-60% GC indhold, Tm omkring 60°C)
- Teste forskellige annealing temperaturer
- Optimere primer koncentrationer
- Bruge høj kvalitet DNA/RNA skabelon
- Overveje at bruge PCR forstærkere til vanskelige skabeloner
- Sikre korrekt prøveforberedelse for at fjerne potentielle hæmmere
- Teste forskellige kommercielle mastermix
Kan jeg sammenligne prøver med forskellige effektivitet?
Det anbefales ikke at sammenligne prøver med betydeligt forskellige effektivitet, fordi:
- Det kan føre til betydelige kvantificeringsfejl
- Fejlens størrelse stiger med større Ct forskelle
- Hvis det er uundgåeligt, skal effektivitet-korrigerede beregningsmodeller anvendes
- Resultaterne skal fortolkes med forsigtighed og yderligere validering
Referencer
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Vores qPCR Effektivitetsberegner giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til forskere til at validere og optimere deres kvantitative PCR eksperimenter. Ved nøjagtigt at beregne effektivitet fra standardkurver kan du sikre pålidelig kvantificering, fejlfinde problematiske assays og overholde bedste praksis i qPCR eksperimentering.
Prøv vores beregner i dag for at forbedre kvaliteten og pålideligheden af dine qPCR data!
Feedback
Klik på feedback-toasten for at begynde at give feedback om dette værktøj.
Relaterede Værktøjer
Opdag flere værktøjer, der måske kan være nyttige for din arbejdsgang.