qPCR efektiivsuse kalkulaator: analüüsi standardkõveraid ja amplifikatsiooni
Arvutage PCR efektiivsus Ct väärtustest ja lahjendusfaktoritest. Analüüsige standardkõveraid, määrake amplifikatsiooni efektiivsus ja valideerige oma kvantitatiivseid PCR katseid.
qPCR efekti kalkulaator
Sisendparameetrid
Ct väärtused
Väärtus peab olema positiivne
Väärtus peab olema positiivne
Väärtus peab olema positiivne
Väärtus peab olema positiivne
Väärtus peab olema positiivne
Tulemused
Standardsuurus
Sisestage kehtivad andmed diagrammi genereerimiseks
Teave
qPCR efektiivsus on mõõt, kui hästi PCR reaktsioon töötab. 100% efektiivsus tähendab, et PCR toote hulk kahekordistub iga tsükli jooksul eksponentsiaalses faasis.
Efektiivsus arvutatakse standardsuuruse kallaku põhjal, mis saadakse Ct väärtuste joonistamisel algse malli kontsentratsiooni logaritmi (lahjendusseeria) vastu.
Efektiivsus (E) arvutatakse järgmise valemi abil:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentatsioon
qPCR Efekti Kalkulaator: Optimeeri Oma Kvantitatiivseid PCR Katseid
Sissejuhatus qPCR Efekti
Kvantitatiivne Polümeraasi Ahelreaktsioon (qPCR) efektiivsus on kriitiline parameeter, mis mõjutab otseselt teie qPCR katsete täpsust ja usaldusväärsust. qPCR efekti kalkulaator aitab teadlastel määrata, kui tõhusalt nende PCR reaktsioonid amplifitseerivad siht-DNA järjestusi igas termilises tsüklis. Ideaalsetes qPCR reaktsioonides peaks efektiivsus olema vahemikus 90-110%, mis näitab, et PCR toote hulk kahekordistub igas tsüklis eksponentsiaalses faasis.
Halb amplifitseerimise efektiivsus võib viia ebatäpsete kvantifitseerimise, usaldusväärsete tulemuste ja vale eksperimentaalsete järeldusteni. qPCR efektiivsuse arvutamise ja jälgimise kaudu saate optimeerida reaktsioonitingimusi, valideerida primerite disainid ja tagada oma kvantitatiivse PCR andmete kvaliteet.
See kalkulaator kasutab standardkõvera meetodit, mis joonistab tsükli läve (Ct) väärtused sihtmõõtme kontsentratsiooni logaritmi (esindatud seeriadilutsioonide kaudu) vastu, et määrata teie qPCR katse efektiivsus. Tulemuseks olev kalde väärtus seda standardkõverat kasutatakse seejärel amplifitseerimise efektiivsuse arvutamiseks lihtsa matemaatilise valemi abil.
qPCR Efektiivsus Valem ja Arvutamine
qPCR reaktsiooni efektiivsus arvutatakse standardkõvera kalde väärtusest järgmise valemi abil:
Kus:
- E on efektiivsus (avaldatud kümnendmurduna)
- Kalle on standardkõvera kalle (Ct väärtuste joonistamine logaritmilise lahjenduse vastu)
Ideaalse PCR reaktsiooni puhul, mille efektiivsus on 100% (täiuslik kahekordistumine ampliconide hulk igas tsüklis), oleks kalle -3.32. See on tingitud:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (või 100%)}
Efektiivsuse protsent arvutatakse, korrutades kümnendmurdude efektiivsuse 100-ga:
\text{Efektiivsus (%)} = E \times 100\%
Standardkõvera Mõistmine
Standardkõver luuakse, joonistades Ct väärtused (y-telg) logaritmi algse sihtmõõtme kontsentratsiooni või lahjendusteguri (x-telg) vastu. Nende muutujate vaheline suhe peaks olema lineaarne ning selle lineaarse suhte kvaliteeti hinnatakse määramiskoefitsiendi (R²) abil.
Usaldusväärsete qPCR efektiivsuse arvutuste jaoks:
- R² väärtus peaks olema ≥ 0.98
- Kalle peaks olema tavaliselt vahemikus -3.1 kuni -3.6
- Tuleb kasutada vähemalt 3-5 lahjenduspunkte standardkõvera loomiseks
Samm-sammuline Arvutamisprotsess
-
Andmete ettevalmistamine: Kalkulaator võtab teie Ct väärtused iga lahjenduse punkti jaoks ja lahjendusteguri sisendina.
-
Logaritmiline transformatsioon: Lahjendusjärjestus muudetakse logaritmilisse skaala (logaritm alusel 10).
-
Lineaarne regressioon: Kalkulaator viib läbi lineaarse regressioonianalüüsi log-transformeeritud andmetel, et määrata kalle, y-intercept ja R² väärtus.
-
Efektiivsuse arvutamine: Kasutades kalle väärtust, arvutatakse efektiivsus valemi E = 10^(-1/slope) - 1 abil.
-
Tulemuste tõlgendamine: Kalkulaator kuvab efektiivsuse protsendina koos kalle ja R² väärtusega, et aidata teil hinnata oma qPCR katse usaldusväärsust.
Kuidas Kasutada qPCR Efekti Kalkulaatorit
Järgige neid samme, et arvutada oma qPCR efektiivsus:
-
Määrake lahjenduste arv: Valige, kui palju lahjenduspunkte teil on oma standardkõveras (soovitatav 3-7 punkti).
-
Sisestage lahjendustegur: Sisestage lahjendustegur, mida kasutati järjestikuste proovide vahel (nt 10 10-kordse lahjenduse seeria jaoks, 5 5-kordse lahjenduse seeria jaoks).
-
Sisestage Ct väärtused: Sisestage Ct väärtused iga lahjenduspunkte jaoks. Tavaliselt sisaldab esimene lahjendus (Lahjendus 1) kõige kõrgemat kontsentratsiooni sihtmõõtme, mis toob kaasa madalaima Ct väärtuse.
-
Vaadake tulemusi: Kalkulaator arvutab automaatselt ja kuvab:
- PCR efektiivsus (%)
- Standardkõvera kalle
- Y-intercept
- R² väärtus (määramiskoefitsient)
- Visuaalne esitus standardkõverast
-
Tõlgendage tulemusi: Hinnake, kas teie qPCR efektiivsus jääb vastuvõetavasse vahemikku (90-110%) ja kas R² väärtus näitab usaldusväärset standardkõverat (≥ 0.98).
-
Kopeerige tulemused: Kasutage nuppu "Kopeeri tulemused", et kopeerida kõik arvutatud väärtused oma dokumentide või publikatsioonide jaoks.
Näide Arvutamisest
Vaatame näidet:
- Lahjendustegur: 10 (10-kordne seeriline lahjendus)
- Lahjenduste arv: 5
- Ct väärtused:
- Lahjendus 1 (kõrgeim kontsentratsioon): 15.0
- Lahjendus 2: 18.5
- Lahjendus 3: 22.0
- Lahjendus 4: 25.5
- Lahjendus 5 (madalaim kontsentratsioon): 29.0
Kui joonistada standardkõver:
- X-telg esindab log(lahjendus): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-telg esindab Ct väärtusi: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulaator viib läbi lineaarse regressiooni ja määrab:
- Kalle: -3.5
- Y-intercept: 15.0
- R²: 1.0 (täiuslik lineaarne suhe selle näite puhul)
Kasutades efektiivsuse valemit:
See näitab head qPCR efektiivsust 93%, mis jääb vastuvõetavasse vahemikku 90-110%.
Kasutuskohad qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks
1. Primerite Valideerimine ja Optimeerimine
Enne uue primeripaari kasutamist kvantitatiivsetes katsetes on oluline selle jõudluse valideerimine. qPCR efektiivsuse arvutamine aitab:
- Hinnata primerite spetsiifilisust ja jõudlust
- Optimeerida primerite kontsentratsioone
- Määrata optimaalne annealing temperatuur
- Valideerida primeripaare erinevates sihtmõõtme kontsentratsioonides
2. Katse Arendamine ja Valideerimine
Uute qPCR katsete väljatöötamisel on efektiivsuse arvutamine kriitilise tähtsusega:
- Tagada usaldusväärne kvantifitseerimine kogu dünaamilises vahemikus
- Valideerida avastamise alumine piirmäär
- Kinnitada katse reprodutseeritavust
- Võrrelda erinevaid avastamiskeemiaid (SYBR Green vs. TaqMan proovid)
3. Geenide Ekspressiooni Uuringud
Suhteliste kvantifitseerimise katsetes on PCR efektiivsuse teadmine hädavajalik:
- Rakendada sobivaid kvantifitseerimise mudeleid (ΔΔCt vs. efektiivsuse korrektsiooniga mudelid)
- Normaliseerida sihtgeenid viidetegeenide suhtes, mille efektiivsus on erinev
- Tagada täpsed korduvuse arvutused
- Valideerida tulemusi erinevates eksperimentaalsetes tingimustes
4. Diagnostika ja Kliinilised Rakendused
Kliinilistes ja diagnostilistes seadmetes on qPCR efektiivsus oluline:
- Valideerida diagnostikakatseid enne kliinilist rakendamist
- Tagada järjepidev jõudlus erinevate proovide tüüpide vahel
- Täita regulatiivseid nõudeid katse valideerimise osas
- Jälgida kvaliteedikontrolli rutiinsel testimisel
5. Keskkonna- ja Toidutestimine
Keskkonna- ja toiduohutuse rakendustes aitavad efektiivsuse arvutused:
- Valideerida patogeenide või GMOde avastamismeetodeid
- Tagada järjepidev jõudlus keerulistes proovimatriksites
- Määrata avastamise piirmäärad keerulistes proovides
- Vastata testimise standarditele ja regulatsioonidele
Alternatiivid Standardkõvera Meetodile
Kuigi standardkõvera meetod on kõige levinum lähenemine qPCR efektiivsuse arvutamiseks, on olemas ka alternatiivsed meetodid:
1. Ühe Ampliconi Efektiivsuse Analüüs
See meetod arvutab efektiivsuse ühe amplifikatsiooni kõvera fluoresentsandmete põhjal, ilma et oleks vaja lahjendusseeriat. Sellised tarkvarad nagu LinRegPCR analüüsivad individuaalsete reaktsioonide eksponentsiaalset faasi, et määrata efektiivsus.
Eelised:
- Pole vaja lahjendusseeriat
- Saab arvutada efektiivsuse iga individuaalse reaktsiooni jaoks
- Kasulik, kui proovimaterjal on piiratud
Puudused:
- Võib olla vähem täpne kui standardkõvera meetod
- Nõuab analüüsimiseks spetsiaalset tarkvara
- Tundlikum taustfluorestsentsi probleemide suhtes
2. Absoluutne Kvantifitseerimine Digitaalsete PCR-idega
Digitaalne PCR (dPCR) pakub absoluutset kvantifitseerimist ilma, et oleks vaja standardkõverat või efektiivsuse arvutamist.
Eelised:
- Pole vaja efektiivsuse arvutamist
- Suurem täpsus madala kontsentratsiooniga sihtmõõtmete jaoks
- Vähem mõjutatud inhibiitoritest
Puudused:
- Nõuab spetsiaalset varustust
- Kõrgem kulu proovi kohta
- Piiratud dünaamiline vahemik võrreldes qPCR-iga
3. Suhtelised Kvantifitseerimise Meetodid
Mõned qPCR analüüsi tarkvarad pakuvad suhtelise kvantifitseerimise meetodeid, mis hindavad efektiivsust ilma täieliku standardkõverata.
Eelised:
- Nõuab vähem proove kui täielik standardkõver
- Saab teostada koos eksperimentaalsete proovidega
- Kasulik rutiinse analüüsi jaoks
Puudused:
- Võib olla vähem täpne kui täielik standardkõver
- Piiratud lineaarse dünaamilise vahemiku valideerimine
- Ei pruugi tuvastada inhibeerimise probleeme
qPCR ja Efektiivsuse Arvutamise Ajalugu
qPCR ja efektiivsuse arvutamise areng on viimase paarikümne aasta jooksul oluliselt arenenud:
Varajane Areng (1980ndad-1990ndad)
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) leiutas Kary Mullis 1983. aastal, revolutsioneerides molekulaarbioloogiat. Siiski oli traditsiooniline PCR ainult kvalitatiivne või poolkvantitatiivne. Esimene reaalajas PCR süsteem töötati välja 1990ndate alguses Russell Higuchi ja tema kolleegide poolt, kes näitasid, et PCR toodete jälgimine nende akumuleerumise ajal (kasutades etidiiumbromiidi fluorescentsust) võiks anda kvantitatiivset teavet.
qPCR Standardite Kehtestamine (1990ndad-2000ndad)
Kuna qPCR tehnoloogia arenes, tunnustasid teadlased standardiseerimise ja valideerimise tähtsust. PCR efektiivsuse kontseptsioonist sai usaldusväärse kvantifitseerimise keskne element:
-
- aastal tutvustas Pfaffl efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid
- Standardkõvera meetod efektiivsuse arvutamiseks sai laialdaselt kasutusele
- Ilmusid kaubanduslikud qPCR süsteemid, millel on paranenud avastamiskeemiad
Kaasaegsed Arengud (2000ndad-Käesolev)
Valdkond on jätkuvalt arenenud:
- MIQE juhiste (Minimaalsed Teabe Nõuded Kvantitatiivsete Reaalajas PCR Katsete Avaldamiseks) avaldamine 2009. aastal, rõhutades PCR efektiivsuse aruandmise tähtsust
- Arendatud on täiustatud analüüsitarkvara efektiivsuse arvutamiseks
- Efektiivsuse arvutamine on integreeritud qPCR seadmete ja tarkvara
- Digitaalne PCR on tekkinud täiendava tehnoloogiana
Täna peetakse qPCR efektiivsuse arvutamist ja aruandlust hädavajalikuks usaldusväärsete qPCR andmete avaldamiseks ning sellised tööriistad nagu see kalkulaator aitavad teadlastel järgida parimaid praktikaid valdkonnas.
Koodinäited qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks
Excel
1' Exceli valem qPCR efektiivsuse arvutamiseks kalde põhjal
2' Asetage rakkude B2, kui kalle on rakus A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Exceli valem efektiivsuse protsendiks muutmiseks
6' Asetage rakkude C2, kui efektiivsuse kümnendmurd on rakus B2
7=B2*100
8
9' Funktsioon efektiivsuse arvutamiseks Ct väärtustest ja lahjendustegurist
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Arvutage lineaarne regressioon
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Arvutage kalle
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Arvutage efektiivsus
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R funktsioon qPCR efektiivsuse arvutamiseks Ct väärtustest ja lahjendustegurist
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Looge log lahjenduse väärtused
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Viige läbi lineaarne regressioon
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Tõmmake kalle ja R-ruut
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Arvutage efektiivsus
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Tagastage tulemused
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Näide kasutamisest
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektiivsus: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Kalle: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-ruut: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Arvutage qPCR efektiivsus Ct väärtustest ja lahjendustegurist.
8
9 Parameetrid:
10 ct_values (list): Ct väärtuste loend
11 dilution_factor (float): Lahjendustegur järjestikuste proovide vahel
12
13 Tagastab:
14 dict: Sõnastik, mis sisaldab efektiivsust, kalde, r_squared ja y-intercept
15 """
16 # Looge log lahjenduse väärtused
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Viige läbi lineaarne regressioon
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Arvutage efektiivsus
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Joonistage standardkõver koos regressioonijoontega.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Looge punktid regressioonijoonte jaoks
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Lahjendus')
48 plt.ylabel('Ct Väärtus')
49 plt.title('qPCR Standardkõver')
50
51 # Lisage võrrand ja R² ploti
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektiivsus = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Näide kasutamisest
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektiivsus: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Kalle: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-ruut: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Joonistage standardkõver
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Arvutage qPCR efektiivsus Ct väärtustest ja lahjendustegurist
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct väärtuste massiiv
4 * @param {number} dilutionFactor - Lahjendustegur järjestikuste proovide vahel
5 * @returns {Object} Objekt, mis sisaldab efektiivsust, kalde, rSquared ja y-intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Looge log lahjenduse väärtused
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Arvutage lineaarse regressiooni keskmised
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Arvutage kalle ja y-intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Arvutage R-ruut
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Arvutage efektiivsus
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Näide kasutamisest
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektiivsus: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Kalle: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-ruut: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Korduma Kippuvad Küsimused (KKK)
Mis on hea qPCR efektiivsuse protsent?
Hea qPCR efektiivsus jääb tavaliselt vahemikku 90% kuni 110% (0.9-1.1). Efektiivsus 100% esindab täiuslikku kahekordistumist PCR tootest igas tsüklis. Efektiivsused väljaspool seda vahemikku võivad viidata probleemidele primerite disainis, reaktsioonitingimustes või inhibiitorite olemasolus.
Miks on minu qPCR efektiivsus suurem kui 100%?
Efektiivsused, mis ületavad 100%, võivad tekkida:
- Lahjendusseeria pipeteerimise vigade tõttu
- PCR inhibiitorite olemasolu, mis mõjutavad kõrgemaid kontsentratsioone rohkem kui madalamaid
- Mittespetsiifiline amplifitseerimine või primer-dimerid, mis aitavad signaalile
- Probleemid baasilise korrektsiooniga qPCR analüüsis
Mida madal R² väärtus minu standardkõveras näitab?
Madala R² väärtuse (alla 0.98) puhul viitab see halvale lineaarusele teie standardkõveras, mis võib olla põhjustatud:
- Lahjendusseeria ettevalmistamise pipeteerimise vigadest
- Kontsentratsiooni vahemikus ebaühtlasest amplifitseerimisest
- Tuvastamise piiride saavutamisest väga madalate või kõrgete kontsentratsioonide korral
- PCR inhibeerimisest, mis mõjutab mõningaid lahjenduspunkte rohkem kui teisi
- Halvast primerite jõudlusest või mittespetsiifilisest amplifitseerimisest
Kui palju lahjenduspunkte peaksin ma qPCR efektiivsuse arvutamiseks kasutama?
Usaldusväärsete efektiivsuse arvutuste jaoks on vajalik vähemalt 3 lahjenduspunkte, kuid 5-6 punkti on soovitatavad täpsemate tulemuste saamiseks. Need punktid peaksid katma kogu oodatava sihtmõõtme kontsentratsiooni dünaamilise vahemiku teie eksperimentaalsetes proovides.
Kuidas qPCR efektiivsus mõjutab suhtelisi kvantifitseerimise arvutusi?
Suhteliste kvantifitseerimise katsetes, kasutades ΔΔCt meetodit, eeldatakse, et siht- ja viidetegeenide vahel on võrdsed efektiivsused (ideaalis 100%). Kui efektiivsused erinevad oluliselt:
- Tavaline ΔΔCt meetod võib viia märkimisväärsete kvantifitseerimise vigadeni
- Tuleb kasutada efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid (nt Pfaffli meetod)
- Veateade suureneb suuremate Ct erinevuste korral proovide vahel
Kas ma saan kasutada sama efektiivsuse väärtust kõigi oma qPCR katsete jaoks?
Ei, efektiivsust tuleks määrata iga primeripaari jaoks ja tuleks uuesti valideerida:
- Uute primerite partiide kasutamisel
- Reaktsioonitingimuste või master mixi muutmisel
- Erinevate proovide tüüpide või ekstraktsioonimeetodite kasutamisel
- Aeg-ajalt kvaliteedikontrolli osana
Kuidas PCR inhibiitorid mõjutavad efektiivsuse arvutusi?
PCR inhibiitorid võivad:
- Vähendada üldist efektiivsust
- Mõjutada kõrgemaid kontsentratsiooniproove tõsisemalt
- Luua mittelineaarsust standardkõveras
- Viia sihtmõõtme alahindamiseni
- Põhjustada ebaühtlust amplifitseerimises replikatsioonide vahel
Mis vahe on qPCR efektiivsusel ja PCR efektiivsusel?
Termineid kasutatakse sageli vaheldumisi, kuid:
- qPCR efektiivsus viitab konkreetselt reaalajas kvantitatiivse PCR-i mõõdetud efektiivsusele
- PCR efektiivsus võib viidata üldisele kontseptsioonile mis tahes PCR reaktsioonis
- qPCR efektiivsust mõõdetakse kvantitatiivselt kasutades standardkõveraid või muid meetodeid
- Traditsioonilise PCR efektiivsust hinnatakse sageli kvalitatiivselt geelelektroforeesi abil
Kuidas ma saan parandada oma qPCR efektiivsust?
qPCR efektiivsuse parandamiseks:
- Optimeerige primerite disain (18-22 bp pikkus, 50-60% GC sisu, Tm umbes 60°C)
- Testige erinevaid annealing temperatuure
- Optimeerige primerite kontsentratsioone
- Kasutage kvaliteetset DNA/RNA sihtmõõtme
- Kaaluge PCR tugevdajate kasutamist keeruliste sihtmõõtmete jaoks
- Tagage õige proovide ettevalmistamine, et eemaldada potentsiaalsed inhibiitorid
- Testige erinevaid kaubanduslikke master mix'e
Kas ma saan võrrelda proove, millel on erinevad efektiivsused?
Erineva efektiivsusega proovide võrdlemine ei ole soovitatav, kuna:
- See võib viia märkimisväärsete kvantifitseerimise vigadeni
- Veateade suureneb suuremate Ct erinevuste korral
- Kui vältimatu, tuleb kasutada efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid
- Tulemusi tuleks tõlgendada ettevaatlikult ja lisavalideerimisega
Viidatud Allikad
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE juhised: minimaalsed teabe nõuded kvantitatiivsete reaalajas PCR katsete avaldamiseks. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Uus matemaatiline mudel suhteliseks kvantifitseerimiseks reaalajas RT-PCR-is. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kui hea on PCR efektiivsuse hinnang: soovitused täpsete ja usaldusväärsete qPCR efektiivsuse hindamiste jaoks. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Lõplik qPCR katse: avaldamiskvaliteediga, reprodutseeritavate andmete tootmine esimesel korral. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifitseerimise efektiivsus: seostamine baasilise ja kallutatuse vahel kvantitatiivsete PCR andmete analüüsimisel. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kineetiline PCR analüüs: reaalajas DNA amplifikatsiooni reaktsioonide jälgimine. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Reaalajas PCR Rakenduste Juhend. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Reaalajas PCR Käsiraamat. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Meie qPCR Efekti Kalkulaator pakub teadlastele lihtsat, kuid võimsat tööriista oma kvantitatiivsete PCR katsete valideerimiseks ja optimeerimiseks. Arvutades täpselt efektiivsuse standardkõverate põhjal, saate tagada usaldusväärse kvantifitseerimise, lahendada probleemseid katseid ja järgida parimaid praktikaid qPCR katsetes.
Proovige meie kalkulaatorit juba täna, et parandada oma qPCR andmete kvaliteeti ja usaldusväärsust!
Tagasiside
Klõpsake tagasiside teatele, et alustada tagasiside andmist selle tööriista kohta
Seotud tööriistad
Avasta rohkem tööriistu, mis võivad olla kasulikud teie töövoos