qPCR Tehokkuuslaskin: Analysoi Standardikäyriä & Amplifikaatio
Laske PCR-tehokkuus Ct-arvoista ja laimennustekijöistä. Analysoi standardikäyriä, määritä amplifikaatiotehokkuus ja validoi kvantitatiiviset PCR-kokeesi.
qPCR Tehokkuuslaskuri
Syöttöparametrit
Ct-arvot
Arvon on oltava positiivinen
Arvon on oltava positiivinen
Arvon on oltava positiivinen
Arvon on oltava positiivinen
Arvon on oltava positiivinen
Tulokset
Vakiokäyrä
Syötä kelvollisia tietoja kaavion luomiseksi
Tietoa
qPCR-tehokkuus on mittari siitä, kuinka hyvin PCR-reaktio toimii. 100 %:n tehokkuus tarkoittaa, että PCR-tuotteen määrä kaksinkertaistuu jokaisella kierroksella eksponentiaalivaiheessa.
Tehokkuus lasketaan vakiokäyrän kaltevuudesta, joka saadaan piirtämällä Ct-arvot alkuperäisen mallin konsentraation (laimennussarjan) logaritmin mukaan.
Tehokkuus (E) lasketaan seuraavalla kaavalla:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentaatio
qPCR Tehokkuuslaskin: Optimoi Kvantitatiiviset PCR-kokeesi
Johdanto qPCR Tehokkuuteen
Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) -tehokkuus on kriittinen parametri, joka vaikuttaa suoraan qPCR-kokeidesi tarkkuuteen ja luotettavuuteen. qPCR-tehokkuuslaskin auttaa tutkijoita määrittämään, kuinka tehokkaasti PCR-reaktiot vahvistavat kohde-DNA-sekvenssejä jokaisessa lämpötilasyklissä. Ihanteelliset qPCR-reaktiot tulisi olla tehokkuudeltaan 90-110 %, mikä osoittaa, että PCR-tuotteen määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä eksponentiaalisessa vaiheessa.
Huono amplifikaatiotehokkuus voi johtaa epätarkkaan kvantifiointiin, epäluotettaviin tuloksiin ja virheellisiin kokeellisiin johtopäätöksiin. Laskemalla ja seuraamalla qPCR-tehokkuuttasi voit optimoida reaktiotilat, validoida primereiden suunnittelua ja varmistaa kvantitatiivisen PCR-datan laadun.
Tämä laskin käyttää standardikäyrämenetelmää, joka piirtää sykli-kynnysarvojen (Ct) arvot kohteen konsentraation logaritmin (esitetty sarjassa laimennuksia) suhteen, määrittääkseen qPCR-kokeesi tehokkuuden. Tämän standardikäyrän saatu kaltevuus käytetään sitten amplifikaatiotehokkuuden laskemiseen yksinkertaisella matemaattisella kaavalla.
qPCR Tehokkuuskaava ja Laskenta
qPCR-reaktion tehokkuus lasketaan standardikäyrän kaltevuuden perusteella seuraavalla kaavalla:
Missä:
- E on tehokkuus (ilmaistuna desimaalina)
- Kaltevuus on standardikäyrän kaltevuus (Ct-arvojen ja log-laimennuksen piirtäminen)
Ihanteellisessa PCR-reaktiossa, jonka tehokkuus on 100 % (täydellinen kaksinkertaistuminen ampliconeista jokaisessa syklissä), kaltevuuden tulisi olla -3.32. Tämä johtuu siitä, että:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (tai 100 %)}
Tehokkuusprosentti lasketaan kertomalla desimaalitehokkuus 100:lla:
\text{Tehokkuus (%)} = E \times 100\%
Ymmärtäminen Standardikäyrästä
Standardikäyrä luodaan piirtämällä Ct-arvot (y-akseli) logaritmin alkuperäisestä konsentraatiosta tai laimennustekijästä (x-akseli) vastaan. Näiden muuttujien välinen suhde tulisi olla lineaarinen, ja tämän lineaarisen suhteen laatua arvioidaan määrällä määritys (R²).
Luotettavien qPCR-tehokkuuden laskentojen vuoksi:
- R²-arvon tulisi olla ≥ 0.98
- Kaltevuuden tulisi tyypillisesti olla -3.1 ja -3.6 välillä
- Vähintään 3-5 laimennuspistettä tulisi käyttää standardikäyrän luomiseen
Askel Askeleelta Laskentaprosessi
-
Datan valmistelu: Laskin ottaa Ct-arvosi jokaiselle laimennuspisteelle ja laimennustekijän syötteeksi.
-
Logaritminen muunnos: Laimennussarja muunnetaan logaritmiselle asteikolle (logaritmi kymmenestä).
-
Lineaarinen regressio: Laskin suorittaa lineaarisen regressioanalyysin logaritmi-muunnetuista tiedoista määrittääkseen kaltevuuden, y-leikkauksen ja R²-arvon.
-
Tehokkuuden laskenta: Kaltevuusarvon avulla tehokkuus lasketaan kaavalla E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Tulosten tulkinta: Laskin näyttää tehokkuuden prosentteina, yhdessä kaltevuuden ja R²-arvon kanssa, auttaakseen sinua arvioimaan qPCR-kokeesi luotettavuutta.
Kuinka Käyttää qPCR Tehokkuuslaskinta
Seuraa näitä vaiheita laskiaksesi qPCR-tehokkuutesi:
-
Aseta laimennusten määrä: Valitse, kuinka monta laimennuspistettä sinulla on standardikäyrässä (3-7 pistettä suositellaan).
-
Syötä laimennustekijä: Syötä laimennustekijä, jota käytettiin peräkkäisten näytteiden välillä (esim. 10 kymmenen kertaiselle laimennussarjalle, 5 viiden kertaiselle laimennussarjalle).
-
Syötä Ct-arvot: Syötä Ct-arvot jokaiselle laimennuspisteelle. Tyypillisesti ensimmäinen laimennus (Laimennus 1) sisältää korkeimman konsentraation mallia, mikä johtaa alimpaan Ct-arvoon.
-
Näe tulokset: Laskin laskee automaattisesti ja näyttää:
- PCR-tehokkuus (%)
- Standardikäyrän kaltevuus
- Y-leikkaus
- R²-arvo (määritys)
- Visuaalinen esitys standardikäyrästä
-
Tulkitse tulokset: Arvioi, onko qPCR-tehokkuutesi hyväksyttävällä alueella (90-110 %) ja osoittaako R²-arvo luotettavaa standardikäyrää (≥ 0.98).
-
Kopioi tulokset: Käytä "Kopioi tulokset" -painiketta kopioidaksesi kaikki lasketut arvot tallennettavaksi tai julkaistavaksi.
Esimerkkilaskenta
Käydään läpi esimerkki:
- Laimennustekijä: 10 (10-kertainen sarjallinen laimennus)
- Laimennusten määrä: 5
- Ct-arvot:
- Laimennus 1 (korkein konsentraatio): 15.0
- Laimennus 2: 18.5
- Laimennus 3: 22.0
- Laimennus 4: 25.5
- Laimennus 5 (alin konsentraatio): 29.0
Kun ne piirretään standardikäyrälle:
- X-akseli edustaa log(laimennusta): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-akseli edustaa Ct-arvoja: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Laskin suorittaa lineaarisen regression ja määrittää:
- Kaltevuus: -3.5
- Y-leikkaus: 15.0
- R²: 1.0 (täydellinen lineaarinen suhde tässä esimerkissä)
Tehokkuuskaavan avulla:
Tämä osoittaa hyvää qPCR-tehokkuutta 93 %, joka on hyväksyttävällä alueella 90-110 %.
Käyttötapaukset qPCR Tehokkuuden Laskentaan
1. Primerin Vahvistaminen ja Optimointi
Ennen kuin käytät uutta primeriparia kvantitatiivisissa kokeissa, on tärkeää validoida sen suorituskyky. qPCR-tehokkuuden laskeminen auttaa:
- Arvioimaan primerin spesifisyyttä ja suorituskykyä
- Optimoi primerin konsentraatiot
- Määrittämään optimaalisen annealing-lämpötilan
- Vahvistamaan primeripareja eri konsentraatioiden yli
2. Kokeen Kehittäminen ja Vahvistaminen
Uuden qPCR-kokeen kehittämisessä tehokkuuden laskenta on kriittistä:
- Varmistaen luotettavan kvantifioinnin koko dynaamisella alueella
- Vahvistamalla havaitsemisen alaraja
- Vahvistamalla kokeen toistettavuutta
- Vertailtaessa erilaisia havaitsemistekniikoita (SYBR Green vs. TaqMan-probit)
3. Geeniekspressiotutkimukset
Suhteellisissa kvantifiointikokeissa PCR-tehokkuuden tunteminen on olennaista:
- Käyttämällä asianmukaisia kvantifiointimalleja (ΔΔCt vs. tehokkuuskorjatut mallit)
- Normalisoimalla kohdegeenit viitegeenejä vastaan, joilla on erilaiset tehokkuudet
- Varmistaen tarkat käänteiset muutokset
- Vahvistamalla tuloksia eri kokeellisten olosuhteiden mukaan
4. Diagnostiset ja Klinikkasovellukset
Kliinisissä ja diagnostisissa ympäristöissä qPCR-tehokkuus on tärkeä:
- Vahvistaen diagnostisia kokeita ennen kliinistä käyttöä
- Varmistaen johdonmukaisen suorituskyvyn eri näytetyypeissä
- Täyttäen sääntelyvaatimukset kokeen vahvistamiseksi
- Seuraamalla laadunvalvontaa rutiinitestauksessa
5. Ympäristö- ja Elintarviketestaus
Ympäristö- ja elintarviketurvallisuussovelluksissa tehokkuuden laskenta auttaa:
- Vahvistamaan havaitsemismenetelmiä patogeeneille tai GMO:ille
- Varmistaen johdonmukaisen suorituskyvyn monimutkaisissa näytteissä
- Määrittämään havaitsemisrajat haastavissa näytteissä
- Noudattamaan testausstandardeja ja sääntöjä
Vaihtoehdot Standardikäyrämenetelmälle
Vaikka standardikäyrämenetelmä on yleisin lähestymistapa qPCR-tehokkuuden laskemiseen, on olemassa vaihtoehtoisia menetelmiä:
1. Yksittäisen Ampliconin Tehokkuusanalyysi
Tämä menetelmä laskee tehokkuuden yhdestä fluoresenssidatasta yksittäisessä amplifikaatiokäyrässä ilman laimennussarjaa. Ohjelmisto, kuten LinRegPCR, analysoi yksittäisten reaktioiden eksponentiaalista vaihetta tehokkuuden määrittämiseksi.
Edut:
- Ei tarvita laimennussarjaa
- Voidaan laskea tehokkuus jokaiselle yksittäiselle reaktiolle
- Hyödyllinen, kun näytemateriaali on rajallista
Haitat:
- Voi olla vähemmän tarkka kuin standardikäyrämenetelmä
- Vaatii erikoisohjelmistoa analyysiin
- Herkempi taustafluoresenssin ongelmille
2. Absoluuttinen Kvantifiointi Digitaalisen PCR:n Kanssa
Digitaalinen PCR (dPCR) tarjoaa absoluuttisen kvantifioinnin ilman tarvetta standardikäyrälle tai tehokkuuden laskennalle.
Edut:
- Ei tarvitse tehokkuuden laskentaa
- Korkeampi tarkkuus alhaisen runsauden kohteille
- Vähemmän herkkä estäjille
Haitat:
- Vaatii erikoislaitteita
- Korkeampi kustannus näytettä kohden
- Rajoitettu dynaaminen alue verrattuna qPCR:ään
3. Vertailukvantifiointimenetelmät
Jotkin qPCR-analyysiohjelmistot tarjoavat vertailukvantifiointimenetelmiä, jotka arvioivat tehokkuutta ilman täydellistä standardikäyrää.
Edut:
- Vaatii vähemmän näytteitä kuin täydellinen standardikäyrä
- Voidaan suorittaa kokeellisten näytteiden rinnalla
- Hyödyllinen rutiinianalyysissä
Haitat:
- Voi olla vähemmän tarkka kuin täydellinen standardikäyrä
- Rajoitettu lineaarisen dynaamisen alueen vahvistaminen
- Ei välttämättä havaitse estäjäongelmia
qPCR:n ja Tehokkuuden Laskennan Historia
qPCR:n ja tehokkuuden laskentojen kehitys on kehittynyt merkittävästi viimeisten vuosikymmenten aikana:
Varhainen Kehitys (1980-luku - 1990-luku)
Polymeraasiketjureaktio (PCR) keksittiin Kary Mullisin toimesta vuonna 1983, mikä mullisti molekyylibiologian. Kuitenkin perinteinen PCR oli vain kvalitatiivinen tai puolikvantitatiivinen. Ensimmäinen reaaliaikainen PCR-järjestelmä kehitettiin 1990-luvun alussa Russell Higuchin ja kollegoiden toimesta, jotka osoittivat, että PCR-tuotteiden seuraaminen niiden kertyessä (käyttäen etidiumbromidifluoresenssia) voisi tarjota kvantitatiivista tietoa.
qPCR-standardeiden Vakiinnuttaminen (1990-luku - 2000-luku)
Kun qPCR-teknologia kehittyi, tutkijat tunnistivat standardoinnin ja vahvistamisen tärkeyden. PCR-tehokkuuden käsite tuli keskeiseksi luotettavassa kvantifioinnissa:
- Vuonna 1998 Pfaffl esitteli tehokkuuskorjatut kvantifiointimallit
- Standardikäyrämenetelmä tehokkuuden laskemiseksi tuli laajalti hyväksytyksi
- Kaupalliset qPCR-järjestelmät, joissa oli parannettuja havaitsemistekniikoita, ilmestyivät
Nykyiset Kehitykset (2000-luku - Nykyhetki)
Alue on jatkanut kehittymistä:
- MIQE-ohjeiden (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) julkaisu vuonna 2009, jossa korostettiin PCR-tehokkuuden raportoinnin tärkeyttä
- Kehittyneiden analyysiohjelmistojen kehittäminen tehokkuuden laskentaa varten
- Tehokkuuden laskentamenetelmien integrointi qPCR-laitteisiin ja ohjelmistoihin
- Digitaalisen PCR:n syntyminen täydentävänä teknologiana
Nykyään qPCR-tehokkuuden laskeminen ja raportointi katsotaan olennaiseksi luotettavan qPCR-datan julkaisemiseksi, ja tällaiset laskimet auttavat tutkijoita noudattamaan alan parhaita käytäntöjä.
Koodiesimerkit qPCR Tehokkuuden Laskemiseen
Excel
1' Excel-kaava qPCR-tehokkuuden laskemiseksi kaltevuudesta
2' Aseta soluun B2, jos kaltevuus on solussa A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel-kaava tehokkuuden muuntamiseksi prosentiksi
6' Aseta soluun C2, jos tehokkuus desimaalina on solussa B2
7=B2*100
8
9' Funktio tehokkuuden laskemiseksi Ct-arvoista ja laimennustekijästä
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Laske lineaarinen regressio
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Laske kaltevuus
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Laske tehokkuus
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R-funktio qPCR-tehokkuuden laskemiseksi Ct-arvoista ja laimennustekijästä
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Luo log laimennusarvot
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Suorita lineaarinen regressio
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Ota kaltevuus ja R-neliö
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Laske tehokkuus
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Palauta tulokset
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Esimerkin käyttö
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Tehokkuus: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Kaltevuus: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-neliö: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Laske qPCR-tehokkuus Ct-arvoista ja laimennustekijästä.
8
9 Parametrit:
10 ct_values (lista): Lista Ct-arvoista
11 dilution_factor (float): Laimennustekijä peräkkäisten näytteiden välillä
12
13 Palauttaa:
14 dict: Sanakirja, joka sisältää tehokkuuden, kaltevuuden, r_squaredin ja y-leikkauksen
15 """
16 # Luo log laimennusarvot
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Suorita lineaarinen regressio
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Laske tehokkuus
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Piirrä standardikäyrä regressioviivalla.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generoi pisteet regressioviivalle
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Laimennus')
48 plt.ylabel('Ct Arvo')
49 plt.title('qPCR Standardikäyrä')
50
51 # Lisää kaava ja R² kaavioon
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Tehokkuus = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Esimerkin käyttö
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Tehokkuus: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Kaltevuus: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-neliö: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-leikkaus: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Piirrä standardikäyrä
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Laske qPCR-tehokkuus Ct-arvoista ja laimennustekijästä
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct-arvojen taulukko
4 * @param {number} dilutionFactor - Laimennustekijä peräkkäisten näytteiden välillä
5 * @returns {Object} Objekti, joka sisältää tehokkuuden, kaltevuuden, rSquaredin ja y-leikkauksen
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Luo log laimennusarvot
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Laske keskiarvot lineaarista regressiota varten
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Laske kaltevuus ja y-leikkaus
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Laske R-neliö
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Laske tehokkuus
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Esimerkin käyttö
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Tehokkuus: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Kaltevuus: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-neliö: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-leikkaus: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Usein Kysytyt Kysymykset (UKK)
Mikä on hyvä qPCR-tehokkuusprosentti?
Hyvä qPCR-tehokkuus on tyypillisesti 90-110 % (0.9-1.1). Tehokkuus 100 % tarkoittaa täydellistä kaksinkertaistumista PCR-tuotteessa jokaisessa syklissä. Tehokkuudet, jotka ovat tämän alueen ulkopuolella, voivat viitata ongelmiin primerin suunnittelussa, reaktiotiloissa tai estäjien läsnäolossa.
Miksi qPCR-tehokkuuteni on suurempi kuin 100 %?
Tehokkuudet, jotka ovat suurempia kuin 100 %, voivat johtua:
- Pipetointivirheistä laimennussarjassa
- PCR-estäjien läsnäolosta, jotka vaikuttavat korkeampiin konsentraatioihin enemmän kuin alhaisiin
- Epäspesifisestä amplifikaatiosta tai primeridimeistä, jotka vaikuttavat signaaliin
- Ongelmat taustakorjauksessa qPCR-analyysissä
Mitä matala R²-arvo tarkoittaa standardikäyrässäni?
Matala R²-arvo (alle 0.98) viittaa huonoon lineaarisuuteen standardikäyrässäsi, mikä voi johtua:
- Pipetointivirheistä laimennussarjan valmistelussa
- Konsentraatioalueen yli vaihtelevasta amplifikaatiosta
- Havaitsemisrajojen saavuttamisesta hyvin alhaisissa tai korkeissa konsentraatioissa
- PCR-estäjistä, jotka vaikuttavat joihinkin laimennuspisteisiin enemmän kuin muihin
- Huonosta primerin suorituskyvystä tai epäspesifisestä amplifikaatiosta
Kuinka monta laimennuspistettä minun tulisi käyttää qPCR-tehokkuuden laskemiseen?
Luotettavien tehokkuuden laskentojen vuoksi vähintään 3 laimennuspistettä on tarpeen, mutta 5-6 pistettä on suositeltavaa tarkempien tulosten saamiseksi. Näiden pisteiden tulisi kattaa koko odotettujen mallikonsentraatioiden dynaaminen alue kokeissasi.
Kuinka qPCR-tehokkuus vaikuttaa suhteellisiin kvantifiointilaskelmiin?
Suhteellisessa kvantifioinnissa ΔΔCt-menetelmällä oletetaan, että kohde- ja viitegeenien tehokkuudet ovat samat (ihanteellisesti 100 %). Kun tehokkuudet poikkeavat merkittävästi:
- Standardi ΔΔCt-menetelmä voi johtaa merkittäviin kvantifiointivirheisiin
- Tehokkuuskorjattuja laskentamalleja (kuten Pfafflin menetelmä) tulisi käyttää
- Virheen suuruus kasvaa suuremmilla Ct-eroilla näytteiden välillä
Voinko käyttää samaa tehokkuusarvoa kaikissa qPCR-kokeissani?
Ei, tehokkuus tulisi määrittää jokaiselle primeriparille ja validoida uudelleen:
- Kun käytetään uusia primerilottoja
- Kun vaihdetaan reaktiotiloja tai master mixiä
- Kun työskennellään eri näytetyyppien tai eristysmenetelmien kanssa
- Säännöllisesti osana laadunvalvontaa
Kuinka PCR-estäjät vaikuttavat tehokkuuden laskentaan?
PCR-estäjät voivat:
- Vähentää kokonaistehokkuutta
- Vaikuttaa korkeampiin konsentraatioihin voimakkaammin
- Luoda epälineaarisuutta standardikäyrässä
- Johtaa kohteen aliarvioimiseen
- Aiheuttaa epäjohdonmukaisuutta amplifikaatiossa replikoissa
Mikä on qPCR-tehokkuuden ja PCR-tehokkuuden ero?
Termit käytetään usein vaihdettavasti, mutta:
- qPCR-tehokkuus viittaa erityisesti tehokkuuteen, joka mitataan reaaliaikaisessa kvantitatiivisessa PCR:ssä
- PCR-tehokkuus voi viitata yleiseen käsitteeseen missä tahansa PCR-reaktiossa
- qPCR-tehokkuus mitataan kvantitatiivisesti käyttäen standardikäyriä tai muita menetelmiä
- Perinteistä PCR-tehokkuutta arvioidaan usein kvalitatiivisesti geeli-elektroforeesilla
Kuinka voin parantaa qPCR-tehokkuuttani?
Tehokkuuden parantamiseksi:
- Optimoi primerin suunnittelu (18-22 bp pituus, 50-60 % GC-sisältö, Tm noin 60 °C)
- Testaa erilaisia annealing-lämpötiloja
- Optimoi primerin konsentraatiot
- Käytä korkealaatuista DNA/RNA-mallia
- Harkitse PCR-kohentajien käyttöä vaikeissa malleissa
- Varmista, että näytteen valmistelu poistaa mahdolliset estäjät
- Testaa erilaisia kaupallisia master mixejä
Voinko verrata näytteitä, joilla on erilaiset tehokkuudet?
Eri tehokkuuksilla varustettujen näytteiden vertaaminen ei ole suositeltavaa, koska:
- Se voi johtaa merkittäviin kvantifiointivirheisiin
- Virheen suuruus kasvaa suuremmilla Ct-eroilla
- Jos vältetään, tehokkuuskorjatut laskentamallit on käytettävä
- Tuloksia tulisi tulkita varovaisesti ja lisävahvistuksia tarvitaan
Viitteet
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, ym. MIQE-ohjeet: vähimmäistiedot kvantitatiivisten reaaliaikaisten PCR-kokeiden julkaisemiseksi. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. Uusi matemaattinen malli suhteelliselle kvantifioinnille reaaliaikaisessa RT-PCR:ssä. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kuinka hyvä on PCR-tehokkuusarvio: Suosituksia tarkkojen ja luotettavien qPCR-tehokkuusarvioiden arvioimiseksi. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Ultimate qPCR -kokeet: Julkaisukelpoisten, toistettavien tietojen tuottaminen ensimmäisellä kerralla. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, ym. Amplifikaatiotehokkuus: yhdistäminen taustaan ja vinoutumiseen kvantitatiivisen PCR-datan analyysissä. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetiikka PCR-analyysissä: reaaliaikainen seuranta DNA-amplifikaatioreaktioissa. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Reaaliaikaisen PCR:n sovellusopas. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Reaaliaikaisen PCR:n käsikirja. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
qPCR Tehokkuuslaskin tarjoaa yksinkertaisen mutta tehokkaan työkalun tutkijoille validoida ja optimoida kvantitatiivisia PCR-kokeitaan. Laskemalla tehokkuuden tarkasti standardikäyristä voit varmistaa luotettavan kvantifioinnin, ratkaista ongelmallisia kokeita ja noudattaa parhaita käytäntöjä qPCR-kokeissa.
Kokeile laskinta tänään parantaaksesi qPCR-datasi laatua ja luotettavuutta!
Palaute
Klikkaa palautetoastia aloittaaksesi palautteen antamisen tästä työkalusta
Liittyvät Työkalut
Löydä lisää työkaluja, jotka saattavat olla hyödyllisiä työnkulullesi