qPCR Effektivitetskalkulator: Analyser Standardkurver & Amplifikasjon
Beregn PCR-effektivitet fra Ct-verdier og fortynningsfaktorer. Analyser standardkurver, bestem amplifikasjonseffektivitet, og valider kvantitative PCR-eksperimenter.
qPCR Effektivitetskalkulator
Inndata Parametre
Ct Verdier
Verdien må være positiv
Verdien må være positiv
Verdien må være positiv
Verdien må være positiv
Verdien må være positiv
Resultater
Standardkurve
Skriv inn gyldige data for å generere diagram
Informasjon
qPCR effektivitet er et mål på hvor godt PCR reaksjonen fungerer. En effektivitet på 100% betyr at mengden PCR-produkt dobles med hver syklus under den eksponentielle fasen.
Effektiviteten beregnes fra hellingen av standardkurven, som oppnås ved å plotte Ct verdiene mot logaritmen av den opprinnelige mal-konsentrasjonen (fortynningsserie).
Effektiviteten (E) beregnes ved hjelp av formelen:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentasjon
qPCR Effektivitetskalkulator: Optimaliser dine kvantitative PCR-experimenter
Introduksjon til qPCR Effektivitet
Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) effektivitet er en kritisk parameter som direkte påvirker nøyaktigheten og påliteligheten til dine qPCR-experimenter. qPCR effektivitet kalkulatoren hjelper forskere med å bestemme hvor effektivt PCR-reaksjonene deres amplifiserer mål-DNA-sekvenser med hver termisk syklus. Ideelle qPCR-reaksjoner bør ha en effektivitet mellom 90-110%, noe som indikerer at mengden PCR-produkt omtrent dobles med hver syklus under den eksponentielle fasen.
Dårlig amplifikasjonseffektivitet kan føre til unøyaktig kvantifisering, upålitelige resultater og feilaktige eksperimentelle konklusjoner. Ved å beregne og overvåke qPCR-effektiviteten kan du optimalisere reaksjonsbetingelsene, validere primerdesignene og sikre kvaliteten på kvantitative PCR-dataene dine.
Denne kalkulatoren bruker standardkurvemetoden, som plottet syklus terskel (Ct) verdier mot logaritmen av malekonsentrasjonen (representert ved serielle fortynninger), for å bestemme effektiviteten til qPCR-analysen din. Den resulterende skråningen av denne standardkurven brukes deretter til å beregne amplifikasjonseffektiviteten ved hjelp av en enkel matematisk formel.
qPCR Effektivitetsformel og Beregning
Effektiviteten til en qPCR-reaksjon beregnes fra skråningen av standardkurven ved hjelp av følgende formel:
Hvor:
- E er effektiviteten (uttrykt som desimal)
- Skråning er skråningen av standardkurven (plottet Ct-verdier mot log fortynning)
For en ideell PCR-reaksjon med 100% effektivitet (perfekt dobling av amplikonene med hver syklus), ville skråningen vært -3.32. Dette er fordi:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (eller 100%)}
Effektiviteten i prosent beregnes ved å multiplisere den desimale effektiviteten med 100:
\text{Effektivitet (%)} = E \times 100\%
Forståelse av Standardkurven
Standardkurven opprettes ved å plotte Ct-verdiene (y-akse) mot logaritmen av den innledende malekonsentrasjonen eller fortynningsfaktoren (x-akse). Forholdet mellom disse variablene bør være lineært, og kvaliteten på dette lineære forholdet vurderes ved hjelp av bestemmelseskoeffisienten (R²).
For pålitelige qPCR-effektivitetsberegninger:
- R²-verdien bør være ≥ 0.98
- Skråningen bør typisk være mellom -3.1 og -3.6
- Minst 3-5 fortynningspunkter bør brukes for å lage standardkurven
Trinn-for-trinn Beregningsprosess
-
Datapreparering: Kalkulatoren tar Ct-verdiene dine for hvert fortynningspunkt og fortynningsfaktoren som innganger.
-
Log-transformasjon: Fortynningsserien transformeres til en logaritmisk skala (log base 10).
-
Lineær regresjon: Kalkulatoren utfører lineær regresjonsanalyse på de log-transformerte dataene for å bestemme skråningen, y-avskjæringen og R²-verdien.
-
Effektivitetberegning: Ved hjelp av skråningsverdien beregnes effektiviteten ved hjelp av formelen E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Resultatfortolkning: Kalkulatoren viser effektiviteten som en prosentandel, sammen med skråningen og R²-verdien for å hjelpe deg med å vurdere påliteligheten til qPCR-analysen din.
Hvordan Bruke qPCR Effektivitetskalkulatoren
Følg disse trinnene for å beregne qPCR-effektiviteten din:
-
Angi antall fortynninger: Velg hvor mange fortynningspunkter du har i standardkurven (mellom 3-7 punkter anbefales).
-
Skriv inn fortynningsfaktoren: Skriv inn fortynningsfaktoren som ble brukt mellom påfølgende prøver (f.eks. 10 for en 10-fold fortynningsserie, 5 for en 5-fold fortynningsserie).
-
Skriv inn Ct-verdier: Skriv inn Ct-verdiene for hvert fortynningspunkt. Typisk inneholder den første fortynningen (Fortynning 1) den høyeste konsentrasjonen av mal, noe som resulterer i den laveste Ct-verdien.
-
Vis resultater: Kalkulatoren vil automatisk beregne og vise:
- PCR-effektivitet (%)
- Skråning av standardkurven
- Y-avskjæring
- R²-verdi (bestemmelseskoeffisient)
- En visuell representasjon av standardkurven
-
Tolk resultater: Vurder om qPCR-effektiviteten din ligger innenfor det akseptable området (90-110%) og om R²-verdien indikerer en pålitelig standardkurve (≥ 0.98).
-
Kopier resultater: Bruk "Kopier Resultater"-knappen for å kopiere alle beregnede verdier for dine opptegnelser eller publikasjoner.
Eksempelberegning
La oss gå gjennom et eksempel:
- Fortynningsfaktor: 10 (10-fold seriefortynning)
- Antall fortynninger: 5
- Ct-verdier:
- Fortynning 1 (høyeste konsentrasjon): 15.0
- Fortynning 2: 18.5
- Fortynning 3: 22.0
- Fortynning 4: 25.5
- Fortynning 5 (laveste konsentrasjon): 29.0
Når det plottes på en standardkurve:
- X-aksen representerer log(fortynning): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-aksen representerer Ct-verdier: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulatoren vil utføre lineær regresjon og bestemme:
- Skråning: -3.5
- Y-avskjæring: 15.0
- R²: 1.0 (perfekt lineært forhold i dette eksemplet)
Ved hjelp av effektivitetsformelen:
Dette indikerer en god qPCR-effektivitet på 93%, som ligger innenfor det akseptable området på 90-110%.
Bruksområder for qPCR Effektivitetsberegninger
1. Primer Validering og Optimalisering
Før du bruker et nytt primerpar for kvantitative eksperimenter, er det viktig å validere ytelsen. Beregning av qPCR-effektivitet hjelper til med å:
- Vurdere primerens spesifisitet og ytelse
- Optimalisere primerkonsentrasjoner
- Bestemme optimal annealingstemperatur
- Validere primerpar på tvers av forskjellige malekonsentrasjoner
2. Analyseutvikling og Validering
Når du utvikler nye qPCR-analyser, er effektivitetsberegninger avgjørende for:
- Å sikre pålitelig kvantifisering over det dynamiske området
- Validere nedre grense for deteksjon
- Bekrefte reproduserbarhet av analysen
- Sammenligne forskjellige deteksjonskjemier (SYBR Green vs. TaqMan-prober)
3. Genuttrykksstudier
I relative kvantifiseringseksperimenter er det viktig å kjenne PCR-effektiviteten for:
- Å bruke passende kvantifiseringsmodeller (ΔΔCt vs. effektivitet-korrigerte modeller)
- Normalisere målgener mot referansegener med forskjellige effektivitet
- Sikre nøyaktige fold-endringsberegninger
- Validere resultater på tvers av forskjellige eksperimentelle forhold
4. Diagnostiske og Kliniske Applikasjoner
I kliniske og diagnostiske innstillinger er qPCR-effektivitet viktig for:
- Å validere diagnostiske analyser før klinisk implementering
- Å sikre konsistent ytelse på tvers av forskjellige prøvetyper
- Å møte regulatoriske krav for analysevalidering
- Å overvåke kvalitetskontroll i rutinetesting
5. Miljø- og Mattesting
For miljø- og matsikkerhetsapplikasjoner hjelper effektivitetsberegninger til med å:
- Validere deteksjonsmetoder for patogener eller GMOer
- Sikre konsistent ytelse på tvers av komplekse prøvematriser
- Bestemme deteksjonsgrenser i utfordrende prøver
- Overholde teststandarder og forskrifter
Alternativer til Standardkurvemetoden
Selv om standardkurvemetoden er den vanligste tilnærmingen for å beregne qPCR-effektivitet, finnes det alternative metoder:
1. Enkelt Amplicon Effektivitetsanalyse
Denne metoden beregner effektivitet fra fluorescensdataene til en enkelt amplifikasjonskurve, uten å kreve en fortynningsserie. Programvare som LinRegPCR analyserer den eksponentielle fasen av individuelle reaksjoner for å bestemme effektivitet.
Fordeler:
- Ingen behov for fortynningsserier
- Kan beregne effektivitet for hver enkelt reaksjon
- Nyttig når prøvematerialet er begrenset
Ulemper:
- Kan være mindre nøyaktig enn standardkurvemetoden
- Krever spesialisert programvare for analyse
- Mer følsom for bakgrunnsfluorescensproblemer
2. Absolutt Kvantifisering med Digital PCR
Digital PCR (dPCR) gir absolutt kvantifisering uten å kreve en standardkurve eller effektivitetsberegninger.
Fordeler:
- Ingen behov for effektivitetsberegninger
- Høyere presisjon for lav-abundansmål
- Mindre påvirket av hemmere
Ulemper:
- Krever spesialisert utstyr
- Høyere kostnad per prøve
- Begrenset dynamisk område sammenlignet med qPCR
3. Sammenlignende Kvantifiseringsmetoder
Noen qPCR-analyseprogramvare tilbyr sammenlignende kvantifiseringsmetoder som estimerer effektivitet uten en full standardkurve.
Fordeler:
- Krever færre prøver enn en komplett standardkurve
- Kan utføres sammen med eksperimentelle prøver
- Nyttig for rutineanalyse
Ulemper:
- Kan være mindre nøyaktig enn en komplett standardkurve
- Begrenset validering av det lineære dynamiske området
- Kan ikke oppdage inhibisjonsproblemer
Historie om qPCR og Effektivitetsberegninger
Utviklingen av qPCR og effektivitetsberegninger har utviklet seg betydelig de siste tiårene:
Tidlig Utvikling (1980-tallet-1990-tallet)
Polymerase Chain Reaction (PCR) ble oppfunnet av Kary Mullis i 1983, og revolusjonerte molekylærbiologi. Imidlertid var tradisjonell PCR kun kvalitativ eller semi-kvantitativ. Det første sanntids PCR-systemet ble utviklet på tidlig 1990-tall av Russell Higuchi og kolleger, som demonstrerte at overvåking av PCR-produkter etter hvert som de akkumulerte (ved hjelp av etidiumbromidfluorescens) kunne gi kvantitativ informasjon.
Etablering av qPCR Standarder (1990-tallet-2000-tallet)
Etter hvert som qPCR-teknologien avanserte, innså forskere viktigheten av standardisering og validering. Konseptet med PCR-effektivitet ble sentralt for pålitelig kvantifisering:
- I 1998 introduserte Pfaffl effektivitetskorrigerte kvantifiseringsmodeller
- Standardkurvemetoden for beregning av effektivitet ble allment akseptert
- Kommersiell qPCR-systemer med forbedrede deteksjonskjemier dukket opp
Moderne Utviklinger (2000-tallet-Nåtid)
Feltet har fortsatt å utvikle seg med:
- Publisering av MIQE-retningslinjene (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) i 2009, som understreker viktigheten av å rapportere PCR-effektivitet
- Utvikling av avansert analyseprogramvare for effektivitetsberegninger
- Integrering av effektivitetsberegninger i qPCR-instrumenter og programvare
- Fremveksten av digital PCR som en komplementær teknologi
I dag anses beregning og rapportering av qPCR-effektivitet som essensielt for publisering av pålitelige qPCR-data, og verktøy som denne kalkulatoren hjelper forskere med å overholde beste praksis innen feltet.
Kodeeksempler for Beregning av qPCR Effektivitet
Excel
1' Excel-formel for å beregne qPCR-effektivitet fra skråning
2' Plasser i celle B2 hvis skråning er i celle A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel-formel for å konvertere effektivitet til prosent
6' Plasser i celle C2 hvis effektivitet desimal er i celle B2
7=B2*100
8
9' Funksjon for å beregne effektivitet fra Ct-verdier og fortynningsfaktor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Beregn lineær regresjon
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Beregn skråning
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Beregn effektivitet
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R-funksjon for å beregne qPCR-effektivitet fra Ct-verdier og fortynningsfaktor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Opprett log fortynningsverdier
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Utfør lineær regresjon
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Ekstraher skråning og R-kvadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Beregn effektivitet
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Returner resultater
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Eksempel på bruk
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Effektivitet: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Skråning: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Beregn qPCR-effektivitet fra Ct-verdier og fortynningsfaktor.
8
9 Parametere:
10 ct_values (list): Liste over Ct-verdier
11 dilution_factor (float): Fortynningsfaktor mellom påfølgende prøver
12
13 Returnerer:
14 dict: Ordbok som inneholder effektivitet, skråning, r_squared og avskjæring
15 """
16 # Opprett log fortynningsverdier
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Utfør lineær regresjon
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Beregn effektivitet
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plott standardkurven med regresjonslinje.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generer punkter for regresjonslinje
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Fortynning')
48 plt.ylabel('Ct Verdi')
49 plt.title('qPCR Standardkurve')
50
51 # Legg til ligning og R² til plottet
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Effektivitet = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Eksempel på bruk
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Effektivitet: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Skråning: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Avskjæring: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plott standardkurven
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Beregn qPCR-effektivitet fra Ct-verdier og fortynningsfaktor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array av Ct-verdier
4 * @param {number} dilutionFactor - Fortynningsfaktor mellom påfølgende prøver
5 * @returns {Object} Objekt som inneholder effektivitet, skråning, rSquared og avskjæring
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Opprett log fortynningsverdier
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Beregn gjennomsnitt for lineær regresjon
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Beregn skråning og avskjæring
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Beregn R-kvadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Beregn effektivitet
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Eksempel på bruk
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Effektivitet: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Skråning: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Avskjæring: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Ofte Stilte Spørsmål (FAQ)
Hva er en god qPCR-effektivitet prosent?
En god qPCR-effektivitet ligger typisk mellom 90% og 110% (0.9-1.1). En effektivitet på 100% representerer perfekt dobling av PCR-produktet med hver syklus. Effektiviteter utenfor dette området kan indikere problemer med primerdesign, reaksjonsbetingelser eller tilstedeværelse av hemmere.
Hvorfor er qPCR-effektiviteten min høyere enn 100%?
Effektiviteter som er høyere enn 100% kan forekomme på grunn av:
- Pipetteringsfeil i fortynningsserien
- Tilstedeværelse av PCR-hemmere som påvirker høyere konsentrasjoner mer enn lavere
- Ikke-spesifikk amplifikasjon eller primer-dimerer som bidrar til signalet
- Problemer med baseline-korrigering i qPCR-analysen
Hva indikerer en lav R²-verdi i standardkurven min?
En lav R²-verdi (under 0.98) antyder dårlig linearitet i standardkurven din, noe som kan skyldes:
- Pipetteringsfeil under forberedelsen av fortynningsserien
- Inkonsistent amplifikasjon over konsentrasjonsområdet
- Å nå deteksjonsgrenser ved veldig lave eller høye konsentrasjoner
- PCR-hemming som påvirker noen fortynningspunkter mer enn andre
- Dårlig primerytelse eller ikke-spesifikk amplifikasjon
Hvor mange fortynningspunkter bør jeg bruke for å beregne qPCR-effektivitet?
For pålitelige effektivitetsberegninger kreves et minimum på 3 fortynningspunkter, men 5-6 punkter anbefales for mer nøyaktige resultater. Disse punktene bør dekke hele det dynamiske området av forventede malekonsentrasjoner i eksperimentelle prøver.
Hvordan påvirker qPCR-effektivitet relative kvantifiseringsberegninger?
I relativ kvantifisering ved bruk av ΔΔCt-metoden antas det lik effektivitet mellom mål- og referansegener (ideelt 100%). Når effektivitetene avviker betydelig:
- Kan den standard ΔΔCt-metoden føre til betydelige kvantifiseringsfeil
- Effektivitetskorrigerte beregningsmodeller (som Pfaffl-metoden) bør brukes
- Størrelsen på feilen øker med større Ct-differanser mellom prøver
Kan jeg bruke den samme effektiviteten for alle mine qPCR-experimenter?
Nei, effektivitet bør bestemmes for hvert primerpar og bør re-valideres:
- Når du bruker nye primerpartier
- Når du endrer reaksjonsbetingelser eller mastermix
- Når du arbeider med forskjellige prøvetyper eller ekstraksjonsmetoder
- Periodisk som en del av kvalitetskontroll
Hvordan påvirker PCR-hemmere effektivitetberegninger?
PCR-hemmere kan:
- Redusere den totale effektiviteten
- Påvirke høyere konsentrasjoner mer alvorlig
- Skape ikke-linearitet i standardkurven
- Føre til undervurdering av målabundance
- Forårsake inkonsekvent amplifikasjon over replikater
Hva er forskjellen mellom qPCR-effektivitet og PCR-effektivitet?
Begrepene brukes ofte om hverandre, men:
- qPCR-effektivitet refererer spesifikt til effektiviteten målt i sanntids kvantitativ PCR
- PCR-effektivitet kan referere til det generelle konseptet i enhver PCR-reaksjon
- qPCR-effektivitet måles kvantitativt ved hjelp av standardkurver eller andre metoder
- Tradisjonell PCR-effektivitet vurderes ofte kvalitativt ved gelelektroforese
Hvordan kan jeg forbedre qPCR-effektiviteten min?
For å forbedre qPCR-effektiviteten:
- Optimaliser primerdesign (18-22 bp lengde, 50-60% GC-innhold, Tm rundt 60°C)
- Test forskjellige annealingstemperaturer
- Optimaliser primerkonsentrasjoner
- Bruk høykvalitets DNA/RNA-mal
- Vurder å bruke PCR-forsterkere for vanskelige maler
- Sørg for riktig prøveforberedelse for å fjerne potensielle hemmere
- Test forskjellige kommersielle mastermix
Kan jeg sammenligne prøver med forskjellige effektivitet?
Å sammenligne prøver med betydelig forskjellige effektivitet anbefales ikke fordi:
- Det kan føre til betydelige kvantifiseringsfeil
- Størrelsen på feilen øker med større Ct-differanser
- Hvis uunngåelig, må effektivitetskorrigerte beregningsmodeller brukes
- Resultater bør tolkes med forsiktighet og ytterligere validering
Referanser
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Vår qPCR Effektivitetskalkulator gir et enkelt, men kraftig verktøy for forskere til å validere og optimalisere kvantitative PCR-experimenter. Ved å nøyaktig beregne effektivitet fra standardkurver kan du sikre pålitelig kvantifisering, feilsøke problematiske analyser og overholde beste praksis i qPCR-eksperimentering.
Prøv kalkulatoren vår i dag for å forbedre kvaliteten og påliteligheten til qPCR-dataene dine!
Tilbakemelding
Klikk på tilbakemeldings-toasten for å begynne å gi tilbakemelding om dette verktøyet
Relaterte verktøy
Oppdag flere verktøy som kan være nyttige for arbeidsflyten din