qPCR učinkovitost kalkulator: Analiza standardnih krivulj in amplifikacije
Izračunajte učinkovitost PCR iz Ct vrednosti in faktorjev redčenja. Analizirajte standardne krivulje, določite amplifikacijsko učinkovitost in potrdite vaše kvantitativne PCR poskuse.
Kalkulator učinkovitosti qPCR
Vhodni parametri
Ct vrednosti
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Rezultati
Standardna krivulja
Vnesite veljavne podatke za generiranje grafikona
Informacije
Učinkovitost qPCR je mera, kako dobro PCR reakcija deluje. Učinkovitost 100 % pomeni, da se količina PCR produkta podvoji v vsakem ciklu med eksponentialno fazo.
Učinkovitost se izračuna iz naklona standardne krivulje, ki jo dobimo s prikazovanjem Ct vrednosti proti logaritmu začetne koncentracije vzorca (serija redčenja).
Učinkovitost (E) se izračuna z uporabo formule:
E = 10^(-1/slope) - 1
Dokumentacija
qPCR Učinkovitost Kalkulator: Optimizirajte Svoje Kvantitativne PCR Eksperimente
Uvod v učinkovitost qPCR
Kvantitativna polimerazna verižna reakcija (qPCR) učinkovitost je ključni parameter, ki neposredno vpliva na natančnost in zanesljivost vaših qPCR eksperimentov. Kalkulator učinkovitosti qPCR pomaga raziskovalcem določiti, kako učinkovito njihovi PCR reakcije amplificirajo ciljne DNA sekvence s vsakim termalnim ciklom. Idealne qPCR reakcije bi morale imeti učinkovitost med 90-110%, kar pomeni, da se količina PCR produkta približno podvoji s vsakim ciklom med eksponentno fazo.
Slaba amplifikacijska učinkovitost lahko vodi do netočnega kvantificiranja, nezanesljivih rezultatov in napačnih eksperimentalnih zaključkov. Z izračunavanjem in spremljanjem vaše qPCR učinkovitosti lahko optimizirate reakcijske pogoje, validirate zasnove primerov in zagotovite kakovost vaših kvantitativnih PCR podatkov.
Ta kalkulator uporablja metodo standardne krivulje, ki grafično prikazuje vrednosti praga cikla (Ct) v primerjavi z logaritmom koncentracije vzorca (predstavljeno s serijskimi razredčitvami), da določi učinkovitost vašega qPCR testa. Rezultantna naklon te standardne krivulje se nato uporabi za izračun amplifikacijske učinkovitosti s preprosto matematično formulo.
Formula in izračun učinkovitosti qPCR
Učinkovitost qPCR reakcije se izračuna iz naklona standardne krivulje z uporabo naslednje formule:
Kjer:
- E je učinkovitost (izražena kot decimalno število)
- Naklon je naklon standardne krivulje (grafično prikazuje Ct vrednosti v primerjavi z logaritmom razredčitve)
Za idealno PCR reakcijo z 100% učinkovitostjo (popolno podvajanje ampliconov s vsakim ciklom) bi bil naklon -3.32. To je zato, ker:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (ali 100%)}
Učinkovitost v odstotkih se izračuna tako, da decimalno učinkovitost pomnožimo s 100:
\text{Učinkovitost (%)} = E \times 100\%
Razumevanje standardne krivulje
Standardna krivulja se ustvari z grafičnim prikazom Ct vrednosti (y-os) v primerjavi z logaritmom začetne koncentracije vzorca ali faktorja razredčitve (x-os). Razmerje med tema spremenljivkama bi moralo biti linearno, kakovost te linearne povezave pa se ocenjuje z uporabo koeficienta determinacije (R²).
Za zanesljive izračune učinkovitosti qPCR:
- R² vrednost bi morala biti ≥ 0.98
- Naklon bi moral biti običajno med -3.1 in -3.6
- Uporabiti bi morali vsaj 3-5 točk razredčitve za ustvarjanje standardne krivulje
Postopek izračuna po korakih
-
Priprava podatkov: Kalkulator vzame vaše Ct vrednosti za vsako točko razredčitve in faktor razredčitve kot vhodne podatke.
-
Logaritemska transformacija: Razredčitvena serija se prevede v logaritemsko lestvico (log osnove 10).
-
Linearno regresijo: Kalkulator izvede analizo linearne regresije na logaritemsko transformiranih podatkih, da določi naklon, y-odsek in R² vrednost.
-
Izračun učinkovitosti: Z uporabo vrednosti naklona se učinkovitost izračuna z uporabo formule E = 10^(-1/slope) - 1.
-
Interpretacija rezultatov: Kalkulator prikaže učinkovitost kot odstotek, skupaj z naklonom in R² vrednostjo, da vam pomaga oceniti zanesljivost vašega qPCR testa.
Kako uporabljati kalkulator učinkovitosti qPCR
Sledite tem korakom za izračun vaše qPCR učinkovitosti:
-
Nastavite število razredčitev: Izberite, koliko točk razredčitve imate v svoji standardni krivulji (priporočeno med 3-7 točk).
-
Vnesite faktor razredčitve: Vnesite faktor razredčitve, ki ste ga uporabili med zaporednimi vzorci (npr. 10 za 10-kratno razredčitev, 5 za 5-kratno razredčitev).
-
Vnesite Ct vrednosti: Vnesite Ct vrednosti za vsako točko razredčitve. Običajno prva razredčitev (Razredčitev 1) vsebuje najvišjo koncentracijo vzorca, kar povzroči najnižjo Ct vrednost.
-
Oglejte si rezultate: Kalkulator bo samodejno izračunal in prikazal:
- PCR učinkovitost (%)
- Naklon standardne krivulje
- Y-odsek
- R² vrednost (koeficient determinacije)
- Vizualno predstavitev standardne krivulje
-
Interpretirajte rezultate: Ocenite, ali vaša qPCR učinkovitost pade v sprejemljiv razpon (90-110%) in ali R² vrednost kaže na zanesljivo standardno krivuljo (≥ 0.98).
-
Kopirajte rezultate: Uporabite gumb "Kopiraj rezultate", da kopirate vse izračunane vrednosti za vaše evidence ali publikacije.
Primer izračuna
Poglejmo primer:
- Faktor razredčitve: 10 (10-kratna serijska razredčitev)
- Število razredčitev: 5
- Ct vrednosti:
- Razredčitev 1 (najviša koncentracija): 15.0
- Razredčitev 2: 18.5
- Razredčitev 3: 22.0
- Razredčitev 4: 25.5
- Razredčitev 5 (najnižja koncentracija): 29.0
Ko so prikazane na standardni krivulji:
- X-os predstavlja log(dilucija): 0, 1, 2, 3, 4
- Y-os predstavlja Ct vrednosti: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0
Kalkulator bo izvedel linearno regresijo in določil:
- Naklon: -3.5
- Y-odsek: 15.0
- R²: 1.0 (popolna linearna povezava v tem primeru)
Z uporabo formule za učinkovitost:
To kaže na dobro qPCR učinkovitost 93%, kar pade v sprejemljiv razpon 90-110%.
Uporabni primeri za izračune učinkovitosti qPCR
1. Validacija in optimizacija primerov
Pred uporabo novega para primerov za kvantitativne eksperimente je nujno preveriti njihovo delovanje. Izračunavanje učinkovitosti qPCR pomaga:
- Oceniti specifičnost in delovanje primerov
- Optimizirati koncentracije primerov
- Določiti optimalno temperaturo aneliranja
- Validirati pare primerov pri različnih koncentracijah vzorca
2. Razvoj in validacija testov
Pri razvoju novih qPCR testov so izračuni učinkovitosti ključni za:
- Zagotavljanje zanesljive kvantifikacije v celotnem dinamičnem razponu
- Validacijo spodnje meje zaznavanja
- Potrditev ponovljivosti testa
- Primerjavo različnih detekcijskih kemij (SYBR Green proti TaqMan sondam)
3. Študije izražanja genov
V eksperimentih relativne kvantifikacije je poznavanje PCR učinkovitosti bistveno za:
- Uporabo ustreznih modelov kvantifikacije (ΔΔCt proti modelom, popravljenim za učinkovitost)
- Normalizacijo ciljnih genov proti referenčnim genom z različnimi učinkovitostmi
- Zagotavljanje natančnih izračunov sprememb
- Validacijo rezultatov pri različnih eksperimentalnih pogojih
4. Diagnostične in klinične aplikacije
V kliničnih in diagnostičnih nastavitvah je qPCR učinkovitost pomembna za:
- Validacijo diagnostičnih testov pred klinično implementacijo
- Zagotavljanje dosledne učinkovitosti pri različnih tipih vzorcev
- Izpolnjevanje regulativnih zahtev za validacijo testov
- Spremljanje nadzora kakovosti pri rutinskem testiranju
5. Okoljski in prehrambeni testi
Za okoljske in varnostne aplikacije hrane izračuni učinkovitosti pomagajo:
- Validirati metode odkrivanja patogenov ali GSO
- Zagotoviti dosledno učinkovitost pri kompleksnih vzorčnih matricah
- Določiti meje zaznavanja v zahtevnih vzorcih
- Izpolnjevati standarde in regulative testiranja
Alternativne metode za metodo standardne krivulje
Medtem ko je metoda standardne krivulje najpogostejši pristop za izračunavanje učinkovitosti qPCR, obstajajo alternativne metode:
1. Analiza učinkovitosti enega amplicona
Ta metoda izračuna učinkovitost iz fluorescenčnih podatkov enega amplifikacijskega krivulje, ne da bi potrebovala serijo razredčitev. Programska oprema, kot je LinRegPCR, analizira eksponentno fazo posameznih reakcij, da določi učinkovitost.
Prednosti:
- Ni potrebe po seriji razredčitev
- Lahko izračuna učinkovitost za vsako posamezno reakcijo
- Koristno, ko je material vzorca omejen
Slabosti:
- Morda manj natančno kot metoda standardne krivulje
- Zahteva specializirano programsko opremo za analizo
- Bolj občutljivo na težave s fluorescenco ozadja
2. Absolutna kvantifikacija z digitalnim PCR
Digitalni PCR (dPCR) omogoča absolutno kvantifikacijo brez potrebe po standardni krivulji ali izračunih učinkovitosti.
Prednosti:
- Ni potrebe po izračunih učinkovitosti
- Višja natančnost za nizkokoličinske tarče
- Manj vpliva na inhibitorje
Slabosti:
- Zahteva specializirano opremo
- Višji strošek na vzorec
- Omejen dinamični razpon v primerjavi z qPCR
3. Metode primerjalne kvantifikacije
Nekatera programska oprema za analizo qPCR ponuja metode primerjalne kvantifikacije, ki ocenjujejo učinkovitost brez popolne standardne krivulje.
Prednosti:
- Zahteva manj vzorcev kot popolna standardna krivulja
- Lahko se izvede skupaj z eksperimentalnimi vzorci
- Koristno za rutinsko analizo
Slabosti:
- Morda manj natančno kot popolna standardna krivulja
- Omejena validacija linearnega dinamičnega razpona
- Morda ne zazna težav z inhibicijo
Zgodovina qPCR in izračunov učinkovitosti
Razvoj qPCR in izračunov učinkovitosti se je v zadnjih nekaj desetletjih znatno razvil:
Zgodnji razvoj (1980-1990)
Polimerazna verižna reakcija (PCR) je bila izumljena s strani Kary Mullis leta 1983, kar je revolucioniralo molekularno biologijo. Vendar je bila tradicionalna PCR le kvalitativna ali pol-kvantitativna. Prvi sistem realnočasnega PCR je bil razvit v zgodnjih 90-ih letih s strani Russella Higuchija in njegovih sodelavcev, ki so pokazali, da lahko spremljanje PCR produktov, ko se kopičijo (z uporabo fluorescencije etidija bromida), zagotovi kvantitativne informacije.
Uveljavitev standardov qPCR (1990-2000)
Ko se je tehnologija qPCR razvijala, so raziskovalci prepoznali pomen standardizacije in validacije. Koncept učinkovitosti PCR je postal osrednjega pomena za zanesljivo kvantifikacijo:
- Leta 1998 je Pfaffl uvedel modele kvantifikacije, popravljene za učinkovitost
- Metoda standardne krivulje za izračunavanje učinkovitosti je postala široko sprejeta
- Pojavile so se komercialne qPCR sisteme z izboljšanimi detekcijskimi kemijami
Sodobni razvoj (2000-danes)
Področje se je nadalje razvijalo z:
- Objavo smernic MIQE (Minimalne informacije za objavo kvantitativnih realnočasnih PCR eksperimentov) leta 2009, ki poudarjajo pomen poročanja o PCR učinkovitosti
- Razvojem napredne analitične programske opreme za izračune učinkovitosti
- Integracijo izračunov učinkovitosti v qPCR instrumente in programsko opremo
- Pojavom digitalnega PCR kot dopolnilne tehnologije
Danes je izračunavanje in poročanje o učinkovitosti qPCR obvezno za objavo zanesljivih qPCR podatkov, orodja, kot je ta kalkulator, pa raziskovalcem pomagajo, da se držijo najboljših praks na tem področju.
Kode za izračunavanje učinkovitosti qPCR
Excel
1' Excel formula for calculating qPCR efficiency from slope
2' Place in cell B2 if slope is in cell A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formula to convert efficiency to percentage
6' Place in cell C2 if efficiency decimal is in cell B2
7=B2*100
8
9' Function to calculate efficiency from Ct values and dilution factor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Calculate linear regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Calculate slope
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Calculate efficiency
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33R
1# R function to calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Create log dilution values
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Perform linear regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extract slope and R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Calculate efficiency
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Return results
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Example usage
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Učinkovitost: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Naklon: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
32Python
1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor.
8
9 Parameters:
10 ct_values (list): List of Ct values
11 dilution_factor (float): Dilution factor between consecutive samples
12
13 Returns:
14 dict: Dictionary containing efficiency, slope, r_squared, and intercept
15 """
16 # Create log dilution values
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Perform linear regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Calculate efficiency
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot the standard curve with regression line.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generate points for regression line
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Razredčitev')
48 plt.ylabel('Ct Vrednost')
49 plt.title('qPCR Standardna Krivulja')
50
51 # Add equation and R² to plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Učinkovitost = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Example usage
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Učinkovitost: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Naklon: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-odsek: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot the standard curve
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76JavaScript
1/**
2 * Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array of Ct values
4 * @param {number} dilutionFactor - Dilution factor between consecutive samples
5 * @returns {Object} Object containing efficiency, slope, rSquared, and intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Create log dilution values
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Calculate means for linear regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Calculate slope and intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Calculate R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Calculate efficiency
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Example usage
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Učinkovitost: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Naklon: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-odsek: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Pogosta vprašanja (FAQ)
Kakšna je dobra qPCR učinkovitost v odstotkih?
Dobra qPCR učinkovitost običajno pade med 90% in 110% (0.9-1.1). Učinkovitost 100% predstavlja popolno podvajanje PCR produkta s vsakim ciklom. Učinkovitosti izven tega razpona lahko kažejo na težave z zasnovo primerov, reakcijskimi pogoji ali prisotnostjo inhibitorjev.
Zakaj je moja qPCR učinkovitost večja od 100%?
Učinkovitosti, ki so večje od 100%, se lahko pojavijo zaradi:
- Napak pri pipetiranju v seriji razredčitev
- Prisotnosti inhibitorjev PCR, ki vplivajo na višje koncentracije bolj kot na nižje
- Neposebne amplifikacije ali primer-dimerov, ki prispevajo k signalu
- Težav s korekcijo ozadja v analizi qPCR
Kaj pomeni nizka R² vrednost v moji standardni krivulji?
Nizka R² vrednost (pod 0.98) nakazuje slabo linearno povezavo v vaši standardni krivulji, kar lahko povzroči:
- Napake pri pipetiranju med pripravo serije razredčitev
- Nekonsistentno amplifikacijo v celotnem razponu koncentracij
- Dosego mej zaznavanja pri zelo nizkih ali visokih koncentracijah
- Inhibicijo PCR, ki vpliva na nekatere točke razredčitve bolj kot na druge
- Slabo delovanje primerov ali nepodobno amplifikacijo
Koliko točk razredčitve bi moral uporabiti za izračun učinkovitosti qPCR?
Za zanesljive izračune učinkovitosti je potrebna najmanj 3 točke razredčitve, vendar je priporočljivo 5-6 točk za bolj natančne rezultate. Te točke bi morale pokrivati celoten dinamični razpon pričakovanih koncentracij vzorca v vaših eksperimentalnih vzorcih.
Kako učinkovitost qPCR vpliva na izračune relativne kvantifikacije?
Pri relativni kvantifikaciji z uporabo metode ΔΔCt se predpostavlja, da sta učinkovitosti med ciljnimi in referenčnimi geni enaki (ideally 100%). Ko se učinkovitosti znatno razlikujejo:
- Standardna metoda ΔΔCt lahko vodi do znatnih napak pri kvantifikaciji
- Uporabiti je treba modele kvantifikacije, popravljene za učinkovitost (kot je Pfafflov model)
- Velikost napake se povečuje z večjimi Ct razlikami med vzorci
Ali lahko uporabim isto vrednost učinkovitosti za vse svoje qPCR eksperimente?
Ne, učinkovitost je treba določiti za vsak par primerov in jo je treba ponovno validirati:
- Ko uporabljate nove serije primerov
- Ko spreminjate reakcijske pogoje ali mešanico
- Ko delate z različnimi tipi vzorcev ali metodami ekstrakcije
- Periodično kot del nadzora kakovosti
Kako inhibitorji PCR vplivajo na izračune učinkovitosti?
Inhibitorji PCR lahko:
- Zmanjšajo skupno učinkovitost
- Bolj vplivajo na višje koncentracije vzorcev
- Ustvarijo nelinearnost v standardni krivulji
- Povedo do podcenjevanja prisotnosti tarče
- Povzročijo nekonsistentno amplifikacijo med ponovitvami
Kakšna je razlika med učinkovitostjo qPCR in učinkovitostjo PCR?
Izrazi se pogosto uporabljajo izmenično, vendar:
- Učinkovitost qPCR se specifično nanaša na učinkovitost, izmerjeno v realnočasnem kvantitativnem PCR
- Učinkovitost PCR se lahko nanaša na splošni koncept v kateri koli PCR reakciji
- Učinkovitost qPCR se kvantitativno meri z uporabo standardnih krivulj ali drugih metod
- Tradicionalna učinkovitost PCR se pogosto ocenjuje kvalitativno z gelno elektroforezo
Kako lahko izboljšam svojo qPCR učinkovitost?
Za izboljšanje učinkovitosti qPCR:
- Optimizirajte zasnovo primerov (dolžina 18-22 bp, 50-60% GC vsebnosti, Tm okoli 60°C)
- Preizkusite različne temperature aneliranja
- Optimizirajte koncentracije primerov
- Uporabite visokokakovostni DNA/RNA vzorec
- Razmislite o uporabi PCR izboljševalcev za težke vzorce
- Zagotovite pravilno pripravo vzorcev za odstranitev potencialnih inhibitorjev
- Preizkusite različne komercialne mešanice
Ali lahko primerjam vzorce z različnimi učinkovitostmi?
Primerjanje vzorcev z znatno različnimi učinkovitostmi ni priporočljivo, ker:
- Lahko vodi do znatnih napak pri kvantifikaciji
- Velikost napake se povečuje z večjimi Ct razlikami
- Če je neizogibno, je treba uporabiti modele kvantifikacije, popravljene za učinkovitost
- Rezultate je treba interpretirati previdno in dodatno validirati
Reference
-
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
-
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
-
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
-
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
-
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
-
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
-
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
-
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Naš kalkulator učinkovitosti qPCR zagotavlja preprosto, a močno orodje za raziskovalce, da validirajo in optimizirajo svoje kvantitativne PCR eksperimente. Z natančnim izračunavanjem učinkovitosti iz standardnih krivulj lahko zagotovite zanesljivo kvantifikacijo, odpravite težave s testi in se držite najboljših praks v eksperimentiranju qPCR.
Preizkusite naš kalkulator danes, da izboljšate kakovost in zanesljivost vaših qPCR podatkov!
Povratne informacije
Kliknite na povratno informacijo, da začnete dajati povratne informacije o tem orodju
Povezana orodja
Odkrijte več orodij, ki bi lahko bila koristna za vaš delovni proces