BCA absorbcijos mėginio tūrio skaičiuoklė laboratoriniams protokolams

Apskaičiuokite tikslius mėginio tūrius remiantis BCA analizės absorbcijos rodmenimis ir norima baltymų mase. Būtina nuosekliam baltymų krovimui vakarinėse blotų analizėse ir kitose laboratorinėse taikymuose.

BCA absorbcijos mėginių tūrio skaičiuoklė

Šis įrankis apskaičiuoja reikiamą mėginių tūrį, remiantis BCA absorbcijos rezultatais ir mėginių mase. Įveskite absorbcijos vertę ir mėginio masę kiekvienam mėginiui, kad apskaičiuotumėte atitinkamą mėginio tūrį.

standardCurveTitle

standardCurveTypeLabel

curveTypeStandard

curveTypeEnhanced

curveTypeMicro

curveTypeCustom

Mėginių įvestys

Mėginys 1

Mėginio pavadinimas

BCA absorbcija*

Mėginio masė (μg)*

Mėginio tūris

Copy

N/A μL

Apskaičiavimo formulė

Mėginio tūris apskaičiuojamas naudojant šią formulę:

Mėginio tūris (μL) = Mėginio masė (μg) / Baltymų koncentracija (μg/μL)

usageTipsTitle

• tipAbsorbanceRange

• tipSampleMass

• tipSampleVolume

• tipStandardCurve

📚

Dokumentacija

BCA Absorbance Sample Volume Calculator

Įvadas

BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklė yra specializuotas įrankis, sukurtas padėti tyrėjams ir laboratorijų technikams tiksliai nustatyti tinkamą mėginio tūrį eksperimentams, remiantis BCA (bicinchonino rūgšties) analizės rezultatais. Ši skaičiuoklė naudoja jūsų BCA analizės absorbancijos rodmenis ir norimą mėginio masę, kad apskaičiuotų tikslią tūrį, reikalingą nuosekliam baltymų apkrovimui tokiuose taikymuose kaip vakarų blotavimas, fermentiniai bandymai ir kitos baltymų analizės technikos.

BCA analizė yra viena plačiausiai naudojamų metodų baltymų kiekiui nustatyti biochemijos ir molekulinės biologijos laboratorijose. Išmatuodami savo baltymų mėginių absorbanciją ir palygindami juos su standartine kreive, galite nustatyti baltymų koncentraciją su didele tikslumu. Mūsų skaičiuoklė supaprastina šį procesą automatiškai konvertuodama absorbancijos rodmenis į tikslius mėginių tūrius, reikalingus jūsų eksperimentams.

BCA analizės ir mėginio tūrio skaičiavimo supratimas

Kas yra BCA analizė?

Bicinchonino rūgšties (BCA) analizė yra biocheminis metodas, skirtas nustatyti bendrą baltymų koncentraciją tirpale. Šio metodo principas remiasi Cu²⁺-baltymo komplekso susidarymu šarminėmis sąlygomis, po kurio Cu²⁺ yra redukuojamas į Cu¹⁺. Redukcijos kiekis yra proporcingas esamam baltymui. BCA sudaro violetinį kompleksą su Cu¹⁺ šarminėje aplinkoje, suteikdama pagrindą stebėti vario redukciją baltymais.

Violetinės spalvos intensyvumas didėja proporcingai baltymų koncentracijai, kuri gali būti matuojama naudojant spektrofotometrą maždaug 562 nm. Tada absorbancijos rodmenys palyginami su standartine kreive, kad būtų nustatyta baltymų koncentracija nežinomuose mėginiuose.

Mėginio tūrio skaičiavimo formulė

Pagrindinė formulė, skirta skaičiuoti mėginio tūrį iš BCA absorbancijos rezultatų, yra:

$\text{Mėginio tūris (μL)} = \frac{\text{Mėginio masė (μg)}}{\text{Baltymų koncentracija (μg/μL)}}$

Kur:

Mėginio tūris yra reikalingas mėginio tūris (mikrolitrais, μL)
Mėginio masė yra norima naudoti baltymo kiekis (mikrogramais, μg)
Baltymų koncentracija yra nustatyta iš BCA absorbancijos rodmens (μg/μL)

Baltymų koncentracija apskaičiuojama iš absorbancijos rodmens naudojant standartinės kreivės lygtį:

$\text{Baltymų koncentracija (μg/μL)} = \text{Nuolatinė} \times \text{Absorbancija} + \text{Interceptas}$

Standartinei BCA analizei būdinga nuolatinė yra maždaug 2.0, o interceptas dažnai yra arti nulio, nors šios vertės gali skirtis priklausomai nuo jūsų konkrečių analizės sąlygų ir standartinės kreivės.

Kaip naudoti BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklę

Mūsų skaičiuoklė supaprastina mėginio tūrių nustatymo procesą iš BCA analizės rezultatų. Sekite šiuos žingsnius, kad gautumėte tikslius skaičiavimus:

Įveskite mėginio informaciją:
- Nurodykite mėginio pavadinimą (neprivaloma, bet naudinga sekant kelis mėginius)
- Įveskite BCA absorbancijos rodmenį iš savo spektrofotometro
- Įveskite norimą mėginio masę (baltymo kiekį, kurį norite naudoti μg)
Pasirinkite standartinės kreivės tipą:
- Standartinė (numatytoji): naudoja tipinius BCA standartinės kreivės parametrus
- Pagerinta: pagerintos jautrumo protokolas
- Mikro: mikroplokštelių protokolas
- Pasirinktinis: leidžia įvesti savo nuolatinės ir intercepto vertes
Peržiūrėkite rezultatus:
- Skaičiuoklė akimirksniu parodys reikiamą mėginio tūrį mikrolitrais
- Rezultatai taip pat pateikiami santraukos lentelėje lengvam peržiūrimui
- Daugeliui mėginių galite pridėti daugiau įrašų ir palyginti rezultatus
Kopijuoti arba eksportuoti rezultatus:
- Naudokite kopijavimo mygtuką, kad perkelti rezultatus į savo laboratorinį užrašų knygelę ar kitas programas
- Visi skaičiavimai gali būti išsaugoti ateities nuorodai

Žingsnis po žingsnio pavyzdys

Pažvelkime į praktinį pavyzdį:

Jūs atlikote BCA analizę ir gavote absorbancijos rodmenį 0.75 savo baltymo mėginiui.
Norite įkelti 20 μg baltymo savo vakarų blotui.
Naudodami standartinę kreivę (nuolatinė = 2.0, interceptas = 0):
- Baltymų koncentracija = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
- Reikalingas mėginio tūris = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

Tai reiškia, kad turėtumėte įkelti 13.33 μL savo mėginio, kad gautumėte 20 μg baltymo.

Rezultatų supratimas

Skaičiuoklė pateikia kelis svarbius duomenis:

Baltymų koncentracija: tai apskaičiuojama iš jūsų absorbancijos rodmens naudojant pasirinktos standartinės kreivės. Ji atspindi baltymo kiekį vienam tūrio vienetui jūsų mėginyje (μg/μL).
Mėginio tūris: tai yra jūsų mėginio tūris, kuriame yra norimas baltymo kiekis. Ši vertė yra tai, ką naudosite ruošdami savo eksperimentus.
Įspėjimai ir rekomendacijos: skaičiuoklė gali pateikti įspėjimus dėl:
- Labai aukštų absorbancijos rodmenų (>3.0), kurie gali būti už linijinio analizės diapazono
- Labai žemų absorbancijos rodmenų (<0.1), kurie gali būti arti aptikimo ribos
- Apskaičiuotų tūrių, kurie yra nepriimtinai dideli (>1000 μL) arba maži (<1 μL)

Taikymo sritys ir naudojimo atvejai

Vakarų blotų mėginių paruošimas

Vienas iš dažniausiai naudojamų šios skaičiuoklės taikymų yra mėginių ruošimas vakarų blotavimui. Nuoseklus baltymų apkrovimas yra būtinas patikimiems vakarų blotų rezultatams, o ši skaičiuoklė užtikrina, kad įkeltumėte tą patį baltymo kiekį kiekvienam mėginiui, net jei jų koncentracijos skiriasi.

Pavyzdinė darbo eiga:

Atlikite BCA analizę visiems savo baltymų mėginiams
Pasirinkite nuoseklų baltymo kiekį, kurį norite įkelti (paprastai 10-50 μg)
Naudokite skaičiuoklę, kad nustatytumėte reikiamus tūrius kiekvienam mėginiui
Pridėkite tinkamus mėginio buferio ir redukuojančio agento tūrius
Įkelkite apskaičiuotus tūrius į savo gelį

Fermentiniai bandymai

Fermentiniams bandymams dažnai būtina naudoti tam tikrą baltymo kiekį, kad būtų standartizuotos reakcijos sąlygos tarp skirtingų mėginių ar eksperimentų.

Pavyzdinė darbo eiga:

Nustatykite baltymų koncentraciją naudodami BCA analizę
Apskaičiuokite reikalingą tūri, kad gautumėte norimą baltymo kiekį
Pridėkite šį tūrį prie savo reakcijos mišinio
Tęskite savo fermentinį bandymą

Imunoprecipitation eksperimentai

Imunoprecipitation (IP) eksperimentuose svarbu pradėti nuo nuoseklaus baltymo kiekio, kad būtų galima palyginti rezultatus tarp skirtingų sąlygų.

Pavyzdinė darbo eiga:

Išmatuokite baltymų koncentraciją ląstelių ar audinių lizatuose naudodami BCA analizę
Apskaičiuokite tūrius, reikalingus, kad gautumėte vienodą baltymo kiekį (paprastai 500-1000 μg)
Pridėkite visus mėginius į tą patį tūrį su lizuojančiu buferiu
Tęskite su antikūnų inkubacija ir nusodinimu

Baltymų valymas

Baltymų valymo metu dažnai reikia stebėti baltymų koncentraciją ir apskaičiuoti derlių skirtinguose etapuose.

Pavyzdinė darbo eiga:

Rinkite frakcijas valymo metu
Atlikite BCA analizę pasirinktinėms frakcijoms
Apskaičiuokite baltymų koncentraciją ir bendrą baltymų kiekį
Nustatykite tūrius, reikalingus tolesniems taikymams

Išplėstinės funkcijos ir apsvarstymai

Pasirinktinių standartinių kreivių

Nors skaičiuoklė teikia numatytus parametrus standartinėms BCA analizėms, taip pat galite įvesti pasirinktines vertes, jei sukūrėte savo standartinę kreivę. Tai ypač naudinga, kai:

Dirbate su nestandartiniais baltymų mėginiais
Naudojate modifikuotus BCA protokolus
Dirbate cheminių medžiagų buvimo, kurios gali trukdyti analizei

Naudojant pasirinktines standartines kreives:

Pasirinkite "Pasirinktinis" iš standartinės kreivės parinkčių
Įveskite savo nuolatinės ir intercepto vertes
Skaičiuoklė naudos šias vertes visiems tolesniems skaičiavimams

Dirbant su keliais mėginiais

Skaičiuoklė leidžia pridėti kelis mėginius ir apskaičiuoti jų tūrius vienu metu. Tai ypač naudinga, kai ruošiate mėginius eksperimentams, kuriems reikia nuoseklaus baltymo apkrovimo tarp kelių sąlygų.

Partijų apdorojimo privalumai:

Sutaupykite laiko apskaičiuodami visus tūrius vienu metu
Užtikrinkite nuoseklumą tarp visų savo mėginių
Lengvai palyginkite baltymų koncentracijas tarp mėginių
Identifikuokite išskirtinius atvejus ar galimus matavimo klaidas

Susiduriant su kraštutiniais atvejais

Labai aukšti absorbancijos rodmenys

Jei jūsų absorbancijos rodmuo viršija 2.0, jis gali būti už BCA analizės linijinio diapazono. Tokiais atvejais:

Atskieskite savo mėginį ir pakartokite BCA analizę
Alternatyviai, naudokite skaičiuoklės įspėjimų sistemą, kuri pažymės galimus problematiškus rodmenis

Labai žemi absorbancijos rodmenys

Jei absorbancijos rodmuo yra žemesnis nei 0.1, galbūt esate arti analizės aptikimo ribos, kas gali paveikti tikslumą. Apsvarstykite:

Galimybę koncentruoti savo mėginį, jei tai įmanoma
Naudokite jautresnį baltymų kiekių nustatymo metodą
Pritaikykite savo eksperimentinį dizainą, kad atsižvelgtumėte į mažesnius baltymų kiekius

Nepriimtino dydžio apskaičiuoti tūriai

Jei skaičiuoklė rodo tūrius, kurie yra per dideli jūsų taikymui:

Apsvarstykite galimybę koncentruoti savo baltymo mėginį
Jei jūsų eksperimentas leidžia, sumažinkite norimą baltymo kiekį
Naudokite maksimalų praktišką tūrį ir užfiksuokite faktinį naudojamą baltymo kiekį

Baltymų kiekių nustatymo istorija ir BCA analizė

Tiksli baltymų kiekių nustatymas buvo pagrindinis reikalavimas biochemijoje ir molekulinėje biologijoje nuo šių sričių atsiradimo. Ankstyvieji metodai remiasi azoto kiekio nustatymu, kuris buvo laiko reikalaujantis ir reikalavo specializuotos įrangos.

Baltymų kiekių nustatymo metodų evoliucija

Kjeldahl metodas (1883): Vienas iš ankstyviausių baltymų kiekių nustatymo metodų, pagrįstas azoto kiekio matavimu.
Biuret testas (XX a. pradžia): Šis metodas remiasi reakcija tarp peptidinių ryšių ir vario jonų šarminėje tirpale, sukuriant violetinę spalvą.
Lowry analizė (1951): Sukūrė Oliveris Lowry, šis metodas sujungė Biuret reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu, padidindamas jautrumą.
Bradford analizė (1976): Marion Bradford sukūrė šį metodą, naudodama Coomassie Brilliant Blue G-250 dažus, kurie jungiasi su baltymais ir keičia absorbcijos maksimumą.
BCA analizė (1985): Sukūrė Paul Smith ir kolegos iš Pierce Chemical Company, šis metodas sujungė biuret reakciją su BCA aptikimu, siūlydamas padidintą jautrumą ir suderinamumą su plovikliais.

BCA analizės plėtra

BCA analizė pirmą kartą buvo aprašyta 1985 m. straipsnyje, kurį parašė Smith ir kt. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Ji buvo sukurta siekiant spręsti esamų metodų trūkumus, ypač trukdžių iš įvairių cheminių medžiagų, dažnai naudojamų baltymų ekstrakcijoje ir valyme.

Pagrindinis naujovė buvo bicinchonino rūgšties naudojimas aptikti Cu¹⁺ jonus, kuriuos sukelia baltymo sukeltas Cu²⁺ redukcija, formuojant violetinį kompleksą, kurį galima matuoti spektrofotometriškai. Tai suteikė keletą privalumų:

Didesnis jautrumas nei Biuret metodas
Mažesnis jautrumas trukdžiams nei Lowry metodas
Geresnis suderinamumas su plovikliais nei Bradford analizė
Paprastesnis protokolas su mažiau reagentų ir žingsnių

Nuo savo pristatymo BCA analizė tapo viena plačiausiai naudojamų baltymų kiekių nustatymo metodų biochemijos ir molekulinės biologijos laboratorijose visame pasaulyje.

Kodo pavyzdžiai mėginio tūrio skaičiavimui

Excel formulė

1=IF(B2<=0,"Klaida: Neteisinga absorbancija",IF(C2<=0,"Klaida: Neteisinga mėginio masė",C2/(2*B2)))
2
3' Kur:
4' B2 yra absorbancijos rodmuo
5' C2 yra norima mėginio masė μg
6' Formulė grąžina reikiamą mėginio tūrį μL
7

Python įgyvendinimas

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Apskaičiuokite baltymų koncentraciją iš absorbancijos naudojant standartinę kreivę."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Absorbancija negali būti neigiama")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Apskaičiuokite reikiamą mėginio tūrį remiantis absorbancija ir norima mase."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Mėginio masė turi būti teigiama")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Pavyzdžio naudojimas
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Absorbancijai {absorbance} ir norimam baltymo masei {sample_mass} μg:")
31    print(f"Baltymų koncentracija: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"Reikalingas mėginio tūris: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"Klaida: {e}")
35

R kodas analizei

1# Funkcija baltymų koncentracijai apskaičiuoti iš absorbancijos
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Absorbancija negali būti neigiama")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija mėginio tūriui apskaičiuoti
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Mėginio masė turi būti teigiama")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Pavyzdžio naudojimas
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Absorbancijai %.2f ir norimam baltymo masei %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Baltymų koncentracija: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Reikalingas mėginio tūris: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Klaida: %s\n", e$message))
39})
40

JavaScript įgyvendinimas

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Absorbancija negali būti neigiama");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Mėginio masė turi būti teigiama");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Pavyzdžio naudojimas
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Absorbancijai ${absorbance} ir norimam baltymo masei ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`Baltymų koncentracija: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`Reikalingas mėginio tūris: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Klaida: ${error.message}`);
37}
38

Standartinės kreivės vizualizacija

Ryšys tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos paprastai yra linijinis tam tikrame diapazone. Žemiau pateikiama standartinės BCA kreivės vizualizacija:

<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0.0

<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Absorbancija (562 nm) Baltymų koncentracija (μg/μL)

Standartinė kreivė Standartiniai mėginiai

BCA standartinė kreivė

Palyginimas su kitais baltymų kiekių nustatymo metodais

Skirtingi baltymų kiekių nustatymo metodai turi įvairių privalumų ir trūkumų. Štai kaip BCA analizė palyginama su kitais dažnai naudojamais metodais:

Metodas	Jautrumo diapazonas	Privalumai	Trūkumai	Geriausiai tinka
BCA analizė	5-2000 μg/mL	• Suderinama su plovikliais • Mažesnė baltymų variacija • Stabilus spalvos vystymasis	• Trukdo redukuojantys agentai • Paveikta kai kurių chelatuojančių agentų	• Bendras baltymų kiekių nustatymas • Mėginiai, kuriuose yra ploviklių
Bradford analizė	1-1500 μg/mL	• Greitas (2-5 min) • Mažai trukdančių medžiagų	• Didelė baltymų variacija • Nesuderinama su plovikliais	• Greiti matavimai • Mėginiai be ploviklių
Lowry metodas	1-1500 μg/mL	• Gerai žinomas • Geras jautrumas	• Daug trukdančių medžiagų • Daug žingsnių	• Istorinis nuoseklumas • Gryni baltymų mėginiai
UV absorbancija (280 nm)	20-3000 μg/mL	• Nedestruktyvus • Labai greitas • Reikia jokių reagentų	• Paveikta nukleorūgščių • Reikalauja grynų mėginių	• Gryni baltymų tirpalai • Greiti patikrinimai valymo metu
Fluorometrinis	0.1-500 μg/mL	• Didžiausias jautrumas • Platus dinaminis diapazonas	• Brangūs reagentai • Reikia fluorometro	• Labai skiedžiami mėginiai • Ribotas mėginio tūris

Dažnai užduodami klausimai

Kam naudojama BCA analizė?

BCA (bicinchonino rūgšties) analizė pirmiausia naudojama nustatyti bendrą baltymų koncentraciją mėginyje. Ji plačiai naudojama biochemijoje, ląstelių biologijoje ir molekulinėje biologijoje tokiose taikymuose kaip vakarų blotavimas, fermentiniai bandymai, imunoprecipitation ir baltymų valymas.

Kiek tiksliai yra BCA analizė?

BCA analizė paprastai yra tiksli per 5-10%, kai atliekama teisingai. Jos tikslumas priklauso nuo kelių veiksnių, įskaitant standartinės kreivės kokybę, trukdančių medžiagų nebuvimą ir ar nežinomo baltymo sudėtis yra panaši į naudojamo standartinio baltymo.

Kas gali trukdyti BCA analizės rezultatams?

Kelios medžiagos gali trukdyti BCA analizės rezultatams, įskaitant:

Redukuojančius agentus (DTT, β-merkaptopropioninė rūgštis, glutathionas)
Chelatuojančius agentus (EDTA, EGTA)
Aukštas paprastų cukrų koncentracijas
Lipidus
Kai kuriuos ploviklius didelėmis koncentracijomis
Ammonio junginius

Koks skirtumas tarp BCA ir Bradford analizės?

Pagrindiniai skirtumai yra:

BCA analizė yra labiau suderinama su plovikliais ir paviršinio aktyvumo medžiagomis
Bradford analizė yra greitesnė (2-5 minutės prieš 30+ minučių BCA)
BCA turi mažesnę baltymų variaciją
Bradford yra jautresnė bazinėms amino rūgštims
BCA yra paveikta redukuojančių agentų, o Bradford - ne

Kodėl mano apskaičiuotas mėginio tūris yra per didelis?

Jei jūsų skaičiuoklė rodo labai didelį mėginio tūrį, tai paprastai rodo, kad jūsų mėginyje yra mažai baltymų koncentracijos. Tai gali būti dėl:

Tikro mažo baltymų kiekio jūsų pradiniame mėginyje
Baltymų praradimo paruošimo metu
Klaidos BCA analizės procedūroje
Neteisingo absorbancijos rodmens

Apsvarstykite galimybę koncentruoti savo mėginį arba sumažinti norimą baltymo kiekį, jei jūsų eksperimentas leidžia.

Ar galiu naudoti šią skaičiuoklę kitoms baltymų kiekių nustatymo metodams?

Ši skaičiuoklė specialiai sukurta BCA analizės rezultatams. Nors pagrindinė principas (koncentracijos konvertavimas į tūrį) taikomas ir kitiems metodams, ryšys tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos skiriasi tarp skirtingų analizių. Kitiems metodams, tokiems kaip Bradford ar Lowry, reikės naudoti skirtingas standartinės kreivės parametrus.

Kaip elgtis su mėginiais, kurių absorbancija yra už linijinio diapazono?

Jei absorbancijos rodmenys yra už linijinio diapazono (paprastai >2.0):

Atskieskite savo mėginį ir pakartokite BCA analizę
Naudokite kitą baltymų kiekių nustatymo metodą
Pritaikykite standartinę kreivę, kad įtrauktumėte didesnės koncentracijos standartus

Koks baltymas turėtų būti naudojamas kaip standartas?

Bovine serum albuminas (BSA) yra dažniausiai naudojamas standartas BCA analizėms, nes jis yra:

Lengvai prieinamas ir pigus
Labai tirpus
Stabilus tirpale
Gerai apibūdintas

Tačiau, jei jūsų mėginiai turi dominuojantį baltymą, kuris žymiai skiriasi nuo BSA, apsvarstykite galimybę naudoti tą baltymą kaip savo standartą, kad gautumėte tikslesnius rezultatus.

Kiek laiko BCA reakcija yra stabili?

Violetinė spalva, išsivysčiusi BCA reakcijoje, yra stabili kelias valandas kambario temperatūroje ir gali būti matuojama bet kuriuo metu per tą laikotarpį. Tačiau geriausiems rezultatams rekomenduojama matuoti visus standartus ir mėginius maždaug tuo pačiu metu po spalvos vystymosi.

Ar galiu pakartotinai naudoti standartinę kreivę iš ankstesnio eksperimento?

Nors techniškai galima pakartotinai naudoti standartinę kreivę, tai nerekomenduojama, kad būtų užtikrinti tikslesni kiekių nustatymai. Reagentų, inkubacijos sąlygų ir prietaisų kalibravimo svyravimai gali paveikti ryšį tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos. Patikimiems rezultatams kiekvieną kartą atlikdami analizę sukurkite naują standartinę kreivę.

Nuorodos

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instrukcijos. Prieinama adresu: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Išbandykite mūsų BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklę šiandien!

Dabar, kai suprantate principus, susijusius su BCA baltymų kiekių nustatymu ir mėginio tūrio skaičiavimu, išbandykite mūsų skaičiuoklę, kad supaprastintumėte savo laboratorijos darbo eigą. Tiesiog įveskite savo absorbancijos rodmenis ir norimą mėginio masę, kad gautumėte akimirksniu, tikslius mėginio tūrio skaičiavimus.

Ar ruošiate mėginius vakarų blotavimui, fermentiniams bandymams ar bet kuriam kitam baltymų pagrindu paremtam eksperimentui, mūsų skaičiuoklė padės užtikrinti nuoseklius ir patikimus rezultatus. Sutaupykite laiko, sumažinkite klaidas ir pagerinkite savo eksperimentų reprodukuojamumą su BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuokle.

🔗

Susiję įrankiai

Raskite daugiau įrankių, kurie gali būti naudingi jūsų darbo eiga.

BCA absorbcijos mėginio tūrio skaičiuoklė laboratoriniams protokolams

BCA absorbcijos mėginių tūrio skaičiuoklė

standardCurveTitle

Mėginių įvestys

Mėginys 1

Apskaičiavimo formulė

Dokumentacija

BCA Absorbance Sample Volume Calculator

Įvadas

BCA analizės ir mėginio tūrio skaičiavimo supratimas

Kas yra BCA analizė?

Mėginio tūrio skaičiavimo formulė

Kaip naudoti BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklę

Žingsnis po žingsnio pavyzdys

Rezultatų supratimas

Taikymo sritys ir naudojimo atvejai

Vakarų blotų mėginių paruošimas

Fermentiniai bandymai

Imunoprecipitation eksperimentai

Baltymų valymas

Išplėstinės funkcijos ir apsvarstymai

Pasirinktinių standartinių kreivių

Dirbant su keliais mėginiais

Susiduriant su kraštutiniais atvejais

Labai aukšti absorbancijos rodmenys

Labai žemi absorbancijos rodmenys

Nepriimtino dydžio apskaičiuoti tūriai

Baltymų kiekių nustatymo istorija ir BCA analizė

Baltymų kiekių nustatymo metodų evoliucija

BCA analizės plėtra

Kodo pavyzdžiai mėginio tūrio skaičiavimui

Excel formulė

Python įgyvendinimas

R kodas analizei

JavaScript įgyvendinimas

Standartinės kreivės vizualizacija

Palyginimas su kitais baltymų kiekių nustatymo metodais

Dažnai užduodami klausimai

Kam naudojama BCA analizė?

Kiek tiksliai yra BCA analizė?

Kas gali trukdyti BCA analizės rezultatams?

Koks skirtumas tarp BCA ir Bradford analizės?

Kodėl mano apskaičiuotas mėginio tūris yra per didelis?

Ar galiu naudoti šią skaičiuoklę kitoms baltymų kiekių nustatymo metodams?

Kaip elgtis su mėginiais, kurių absorbancija yra už linijinio diapazono?

Koks baltymas turėtų būti naudojamas kaip standartas?

Kiek laiko BCA reakcija yra stabili?

Ar galiu pakartotinai naudoti standartinę kreivę iš ankstesnio eksperimento?

Nuorodos

Išbandykite mūsų BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklę šiandien!

Susiję įrankiai

Cilindrinių, sferinių ir stačiakampių talpyklų tūrio skaičiuoklė

Skysčių padengimo tūrio ir ploto skaičiuoklė

Skylės tūrio skaičiuoklė: cilindriniai ir stačiakampiai iškasimai

Skylės tūrio skaičiuoklė: Išmatuokite cilindrinių iškasų tūrius

Kubinio ląstelės tūrio skaičiuoklė: rasti tūrį pagal kraštinės ilgį

Paprastas skiedimo faktoriaus skaičiuoklė laboratorinėms tirpalams

Smėlio tūrio skaičiuoklė: apskaičiuokite medžiagas bet kokiam projektui

Dvių fotonų absorbcijos koeficiento skaičiuoklė

Molarumo skaičiuoklė: tirpalo koncentracijos įrankis