🛠️

Whiz Tools

מחשבון נפח דגימות לספיגת BCA לפרוטוקולי מעבדה

חשב נפחי דגימה מדויקים בהתבסס על קריאות ספיגת BCA ומסת החלבון הרצויה. חיוני להעמסה עקבית של חלבון בבלוטים מערביים וביישומים מעבדתיים אחרים.

מחשבון נפח דגימה BCA

כלי זה מחשב את נפח הדגימה הנדרש על בסיס תוצאות הספיגה של BCA ומסת הדגימה. הזן את ערך הספיגה ומסת הדגימה עבור כל דגימה כדי לחשב את נפח הדגימה המתאים.

standardCurveTitle

curveTypeStandard
curveTypeEnhanced
curveTypeMicro
curveTypeCustom

קלטי דגימה

דגימה 1

Copy
N/A μL

נוסחת חישוב

נפח הדגימה מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:

נפח דגימה (מיקרוליטר) = מסת דגימה (מיקרוגרם) / ריכוז חלבון (מיקרוגרם/מיקרוליטר)
usageTipsTitle

• tipAbsorbanceRange

• tipSampleMass

• tipSampleVolume

• tipStandardCurve

📚

תיעוד

מחשבון נפח דגימה של BCA

מבוא

מחשבון נפח דגימה של BCA הוא כלי מיוחד שנועד לעזור לחוקרים וטכנאי מעבדה לקבוע במדויק את נפח הדגימה המתאים לניסויים בהתבסס על תוצאות בדיקת BCA (חומצה ביסינכונינית). מחשבון זה לוקח את קריאות הספיגה מהבדיקה שלך ואת מסה הדגימה הרצויה כדי לחשב את הנפח המדויק הנדרש לטעינה עקבית של חלבונים ביישומים כמו ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים וטכניקות ניתוח חלבונים אחרות.

בדיקת BCA היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לכימות חלבונים במעבדות ביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. על ידי מדידת הספיגה של דגימות החלבון שלך והשוואתן לעקומת סטנדרט, תוכל לקבוע את ריכוז החלבון בדיוק גבוה. המחשבון שלנו מפשט את התהליך הזה על ידי המרת קריאות הספיגה אוטומטית לנפחי דגימה מדויקים הנדרשים לניסויים שלך.

הבנת בדיקת BCA וחישוב נפח דגימה

מהי בדיקת BCA?

בדיקת החומצה הביסינכונינית (BCA) היא בדיקה ביוכימית לקביעת הריכוז הכולל של חלבון בפתרון. העיקרון של בדיקה זו מתבסס על היווצרות קומפלקס Cu²⁺-חלבון בתנאים אלקליניים, ולאחר מכן הפחתת Cu²⁺ ל-Cu¹⁺. כמות ההפחתה היא פרופורציונלית לחלבון הנוכח. BCA יוצרת קומפלקס בצבע סגול עם Cu¹⁺ בסביבות אלקליניות, מה שמספק בסיס לניטור ההפחתה של הנחושת על ידי חלבונים.

עוצמת הצבע הסגול עולה פרופורציונלית לריכוז החלבון, שניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר ב-562 ננומטר. קריאות הספיגה מושוות לאחר מכן לעקומת סטנדרט כדי לקבוע את ריכוז החלבון בדגימות לא ידועות.

הנוסחה לחישוב נפח דגימה

הנוסחה הבסיסית לחישוב נפח הדגימה מתוצאות הספיגה של BCA היא:

נפח דגימה (μL)=מסת דגימה (μg)ריכוז חלבון (μg/μL)\text{נפח דגימה (μL)} = \frac{\text{מסת דגימה (μg)}}{\text{ריכוז חלבון (μg/μL)}}

איפה:

  • נפח דגימה הוא הנפח של הדגימה הנדרשת (במיקרוליטרים, μL)
  • מסת דגימה היא כמות החלבון הרצויה לשימוש (במיקרוגרמים, μg)
  • ריכוז חלבון נגזר מקריאת הספיגה של בדיקת ה-BCA (בμg/μL)

ריכוז החלבון מחושב מקריאת הספיגה באמצעות נוסחת עקומת הסטנדרט:

ריכוז חלבון (μg/μL)=שיפוע×ספיגה+חיתוך\text{ריכוז חלבון (μg/μL)} = \text{שיפוע} \times \text{ספיגה} + \text{חיתוך}

עבור בדיקת BCA סטנדרטית, השיפוע הטיפוסי הוא בערך 2.0, והחיתוך לרוב קרוב לאפס, אם כי ערכים אלה עשויים להשתנות בהתאם לתנאי הבדיקה הספציפיים שלך ועקומת הסטנדרט.

כיצד להשתמש במחשבון נפח דגימה של BCA

המחשבון שלנו מפשט את התהליך של קביעת נפחי דגימה מתוצאות בדיקת BCA. עקוב אחרי הצעדים הבאים כדי לקבל חישובים מדויקים:

  1. הזן מידע על הדגימה:

    • ספק שם לדגימה שלך (אופציונלי אך מועיל למעקב אחרי דגימות מרובות)
    • הזן את קריאת הספיגה של בדיקת ה-BCA שלך מהספקטרופוטומטר
    • הכנס את מסת הדגימה הרצויה שלך (כמות החלבון שברצונך להשתמש בμg)

  2. בחר סוג עקומת סטנדרט:

    • סטנדרט (ברירת מחדל): משתמש בפרמטרים טיפוסיים של עקומת ה-BCA
    • משופר: לפרוטוקול רגישות משודרגת
    • מיקרו: לפרוטוקול מיקרופלטה
    • מותאם אישית: מאפשר לך להזין ערכי שיפוע וחיתוך משלך

  3. צפה בתוצאות:

    • המחשבון יציג מיד את נפח הדגימה הנדרש במיקרוליטרים
    • התוצאות מוצגות גם בטבלה מסכמת לנוחות התייחסות
    • עבור דגימות מרובות, תוכל להוסיף יותר כניסות ולשוות תוצאות

  4. העתק או ייצא תוצאות:

    • השתמש בכפתור ההעתקה כדי להעביר תוצאות למחברת המעבדה שלך או ליישומים אחרים
    • כל החישובים יכולים להישמר לעיון בעתיד

דוגמה שלב אחר שלב

בואו נעבור על דוגמה מעשית:

  1. ביצעת בדיקת BCA והשגת קריאת ספיגה של 0.75 לדגימת החלבון שלך.
  2. אתה רוצה לטעון 20 μg של חלבון עבור הווסטרן בלוט.
  3. באמצעות עקומת הסטנדרט (שיפוע = 2.0, חיתוך = 0):
    • ריכוז החלבון = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
    • נפח הדגימה הנדרש = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

זה אומר שעליך לטעון 13.33 μL מהדגימה שלך כדי לקבל 20 μg של חלבון.

הבנת התוצאות

המחשבון מספק מספר פרטי מידע חשובים:

  1. ריכוז חלבון: זה מחושב מקריאת הספיגה שלך באמצעות עקומת הסטנדרט שנבחרה. הוא מייצג את כמות החלבון לכל יחידת נפח בדגימה שלך (μg/μL).

  2. נפח דגימה: זהו הנפח של הדגימה שלך שמכילה את כמות החלבון הרצויה שלך. ערך זה הוא מה שתשתמש בו כאשר תכין את ניסוייך.

  3. אזהרות והמלצות: המחשבון עשוי לספק אזהרות עבור:

    • קריאות ספיגה גבוהות מאוד (>3.0) שעשויות להיות מחוץ לטווח הליניארי של הבדיקה
    • קריאות ספיגה נמוכות מאוד (<0.1) שעשויות להיות קרובות לגבול הגילוי
    • נפחים מחושבים שהם גדולים מדי (≥1000 μL) או קטנים מדי (<1 μL)

יישומים ומקרים של שימוש

הכנת דגימות עבור ווסטרן בלוט

אחת מהיישומים הנפוצים ביותר עבור המחשבון הזה היא הכנת דגימות עבור ווסטרן בלוטינג. טעינה עקבית של חלבונים היא קריטית עבור תוצאות אמינות של ווסטרן בלוט, והמחשבון הזה מבטיח שתטעין את אותה כמות חלבון עבור כל דגימה, גם כאשר ריכוזיהם שונים.

זרימת עבודה לדוגמה:

  1. בצע בדיקת BCA על כל דגימות החלבון שלך
  2. קבע כמות חלבון עקבית לטעינה (בדרך כלל 10-50 μg)
  3. השתמש במחשבון כדי לקבוע את הנפח הנדרש עבור כל דגימה
  4. הוסף נפחים מתאימים של בופר דגימה וסוכן מחזר
  5. טען את הנפחים המחושבים על הג'ל שלך

ניסויים אנזימטיים

בניסויים אנזימטיים, לעיתים קרובות יש צורך להשתמש בכמות ספציפית של חלבון כדי לסטנדרטיזציה של תנאי התגובה בין דגימות שונות או ניסויים.

זרימת עבודה לדוגמה:

  1. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA
  2. חישב את הנפח הנדרש כדי להשיג את כמות החלבון הרצויה
  3. הוסף נפח זה לתערובת התגובה שלך
  4. המשך עם ניסוי האנזים שלך

ניסויים של אימונופרציפיטציה

בניסויים של אימונופרציפיטציה (IP), חשוב להתחיל עם כמות חלבון עקבית כדי להשוות תוצאות בין תנאים שונים.

זרימת עבודה לדוגמה:

  1. מדוד את ריכוז החלבון של תמציות תאים או רקמות באמצעות בדיקת BCA
  2. חישב את הנפחים הנדרשים כדי להשיג כמות חלבון שווה (בדרך כלל 500-1000 μg)
  3. התאם את כל הדגימות לנפח זהה עם בופר ליזיס
  4. המשך עם אינקובציה עם נוגדן והפרדה

טיהור חלבונים

במהלך טיהור חלבונים, לעיתים קרובות יש צורך לעקוב אחרי ריכוז החלבון ולחשב את התשואות בשלבים שונים.

זרימת עבודה לדוגמה:

  1. אסוף פר fractions במהלך הטיהור
  2. בצע בדיקת BCA על פר fractions נבחרות
  3. חישב את ריכוז החלבון וכמות החלבון הכוללת
  4. קבע נפחים הנדרשים ליישומים הבאים

תכונות מתקדמות ושיקולים

עקומות סטנדרט מותאמות אישית

בעוד שהמחשבון מספק פרמטרים ברירת מחדל עבור בדיקות BCA סטנדרטיות, תוכל גם להזין ערכים מותאמים אישית אם יצרת עקומת סטנדרט משלך. זה מועיל במיוחד כאשר:

  • עובדים עם דגימות חלבון שאינן סטנדרטיות
  • משתמשים בפרוטוקולי BCA מותאמים
  • עובדים בנוכחות חומרים שעשויים להפריע לבדיקה

כדי להשתמש בעקומת סטנדרט מותאמת אישית:

  1. בחר "מותאם אישית" מאופציות עקומת הסטנדרט
  2. הזן את ערכי השיפוע והחיתוך שלך
  3. המחשבון ישתמש בערכים אלה לכל החישובים הבאים

טיפול בדגימות מרובות

המחשבון מאפשר לך להוסיף דגימות מרובות ולחשב את הנפחים שלהן בו זמנית. זה מועיל במיוחד כאשר מכינים דגימות לניסויים שדורשים טעינה עקבית של חלבון בין תנאים שונים.

יתרונות של עיבוד קבוצתי:

  • חיסכון בזמן על ידי חישוב כל הנפחים בבת אחת
  • הבטחת עקביות בין כל הדגימות שלך
  • השוואת ריכוזי חלבון בין דגימות
  • זיהוי חריגות או שגיאות מדידה פוטנציאליות

התמודדות עם מקרים קצה

קריאות ספיגה גבוהות מאוד

אם קריאת הספיגה שלך גבוהה מ-2.0, היא עשויה להיות מחוץ לטווח הליניארי של בדיקת ה-BCA. במקרה כזה:

  1. דלל את הדגימה שלך וחזור על בדיקת ה-BCA
  2. לחלופין, השתמש במערכת האזהרות של המחשבון, שתסמן קריאות פוטנציאליות בעייתיות

קריאות ספיגה נמוכות מאוד

עבור קריאות ספיגה מתחת ל-0.1, ייתכן שאתה קרוב לגבול הגילוי של הבדיקה, מה שעשוי להשפיע על הדיוק. שקול:

  1. לרכז את הדגימה שלך אם אפשר
  2. להשתמש בשיטת כימות חלבון רגישה יותר
  3. להתאים את העיצוב הניסויי שלך כדי להתחשב בכמויות חלבון נמוכות יותר

נפחים מחושבים גדולים מדי

אם המחשבון מציע נפח שהוא גדול מדי עבור היישום שלך:

  1. שקול לרכז את דגימת החלבון שלך
  2. התאם את כמות החלבון הרצויה כלפי מטה אם הניסוי שלך מאפשר זאת
  3. השתמש בנפח המקסימלי המעשי ושים לב לכמות החלבון בפועל ששימשה

היסטוריה של כימות חלבונים ובדיקת BCA

הכימות המדויק של חלבונים היה דרישה בסיסית בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית מאז שהתחומים הללו צצו. שיטות מוקדמות התבססו על קביעת תוכן חנקן, שהייתה גוזלת זמן ודורשת ציוד מיוחד.

התפתחות שיטות כימות חלבונים

  1. שיטת קיידלה (1883): אחת השיטות הראשונות לכימות חלבונים, המתבססת על מדידת תוכן החנקן.

  2. בדיקת ביורט (תחילת המאה ה-20): שיטה זו מתבססת על התגובה בין קשרי פפטיד ליון נחושת בתמיסה אלקלינית, המייצרת צבע סגול.

  3. בדיקת לורי (1951): פותחה על ידי אוליבר לורי, שיטה זו שילבה את תגובת הביורט עם ריאגנט פולין-צ'וקלטו, והגדילה את הרגישות.

  4. בדיקת ברדפורד (1976): מריון ברדפורד פיתחה שיטה זו באמצעות צבע קואומסיה בריליאנט בלו G-250, הקושר חלבונים ומעביר את מקסימום הספיגה.

  5. בדיקת BCA (1985): פותחה על ידי פול סמית וצוותו בחברת פירס כימיקל, שיטה זו שילבה את תגובת הביורט עם גילוי BCA, והציעה רגישות משופרת והתאמה טובה יותר עם דטרגנטים.

פיתוח בדיקת BCA

בדיקת BCA תוארה לראשונה במאמר מ-1985 על ידי סמית ואחרים שכותרתו "Measurement of protein using bicinchoninic acid." היא פותחה כדי להתמודד עם המגבלות של השיטות הקיימות, במיוחד ההפרעה מחומרים שונים הנמצאים בדרך כלל בשימוש בהפקת חלבונים וטיהור.

החדשנות המרכזית הייתה השימוש בחומצה ביסינכונינית לגילוי יוני Cu¹⁺ המיוצרים על ידי הפחתת Cu²⁺ על ידי חלבונים, מה שיוצר קומפלקס בצבע סגול שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית. זה סיפק מספר יתרונות:

  1. רגישות גבוהה יותר מאשר שיטת הביורט
  2. פחות רגישות להפרעות מחומרים שאינם חלבוניים בהשוואה לשיטת לורי
  3. התאמה טובה יותר לדטרגנטים מאשר בדיקת ברדפורד
  4. פרוטוקול פשוט יותר עם פחות ריאגנטים ושלבים

מאז השקת הבדיקה, בדיקת BCA הפכה לאחת משיטות כימות החלבונים הנפוצות ביותר במעבדות ביוכימיה וביולוגיה מולקולרית ברחבי העולם.

דוגמאות קוד לחישוב נפח דגימה

נוסחת Excel

1=IF(B2<=0,"שגיאה: ספיגה לא חוקית",IF(C2<=0,"שגיאה: מסה לא חוקית",C2/(2*B2)))
2
3' היכן ש:
4' B2 מכילה את קריאת הספיגה
5' C2 מכילה את מסת הדגימה הרצויה בμg
6' הנוסחה מחזירה את נפח הדגימה הנדרש בμL
7

יישום בפייתון

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """חשב את ריכוז החלבון מתוך ספיגה באמצעות עקומת סטנדרט."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """חשב את נפח הדגימה הנדרש בהתבסס על ספיגה ומסה רצויה."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# דוגמת שימוש
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"עבור ספיגה {absorbance} ומסה רצויה של חלבון {sample_mass} μg:")
31    print(f"ריכוז חלבון: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"נפח דגימה נדרש: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"שגיאה: {e}")
35

קוד R לניתוח

1# פונקציה לחישוב ריכוז חלבון מתוך ספיגה
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# פונקציה לחישוב נפח דגימה
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# דוגמת שימוש
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("עבור ספיגה %.2f ומסה רצויה של חלבון %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("ריכוז חלבון: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("נפח דגימה נדרש: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("שגיאה: %s\n", e$message))
39})
40

יישום ב-JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("ספיגה לא יכולה להיות שלילית");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// דוגמת שימוש
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`עבור ספיגה ${absorbance} ומסה רצויה של חלבון ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`ריכוז חלבון: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`נפח דגימה נדרש: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`שגיאה: ${error.message}`);
37}
38

ויזואליזציה של עקומת הסטנדרט

הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון הוא בדרך כלל ליניארי בטווח מסוים. להלן ויזואליזציה של עקומת BCA סטנדרטית:

עקומת סטנדרט של BCA לכימות חלבונים ויזואליזציה של הקשר הליניארי בין ספיגה לריכוז חלבון בבדיקת BCA 0.0 
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
0.0 
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

ספיגה (562 ננומטר) ריכוז חלבון (μg/μL)

עקומת סטנדרט דגימות סטנדרט

עקומת הסטנדרט של BCA

השוואה עם שיטות כימות חלבונים אחרות

שיטות כימות חלבונים שונות מציעות יתרונות ומגבלות שונות. להלן כיצד בדיקת BCA משווה לשיטות אחרות נפוצות:

שיטהטווח רגישותיתרונותמגבלותהכי טוב עבור
בדיקת BCA5-2000 μg/mL• מתאימה לדטרגנטים
• פחות שונות בין חלבונים
• יציבות פיתוח צבע		• מושפעת מחומרים מחזרים
• מושפעת מחלק מהחומרים הקושרים		• כימות חלבונים כללי
• דגימות המכילות דטרגנטים
בדיקת ברדפורד1-1500 μg/mL• מהירה (2-5 דקות)
• מעט חומרים מפריעים		• שונות גבוהה בין חלבונים
• לא מתאימה לדטרגנטים		• מדידות מהירות
• דגימות ללא דטרגנטים
שיטת לורי1-1500 μg/mL• מבוססת היטב
• רגישות טובה		• חומרים מפריעים רבים
• מספר שלבים		• עקביות היסטורית
• דגימות חלבון טהור
ספיגת UV (280 ננומטר)20-3000 μg/mL• לא הרסנית
• מאוד מהירה
• ללא צורך בריאגנטים		• מושפעת מחומצות גרעין
• דורשת דגימות טהורות		• פתרונות חלבון טהורים
• בדיקות מהירות במהלך טיהור
פלורומטרי0.1-500 μg/mL• הרגישות הגבוהה ביותר
• טווח דינמי רחב		• ריאגנטים יקרים
• דורש פלורומטר		• דגימות מדוללות מאוד
• נפח דגימה מוגבל

שאלות נפוצות

מהי בדיקת BCA?

בדיקת BCA (חומצה ביסינכונינית) משמשת בעיקר לכימות הריכוז הכולל של חלבון בדגימה. היא בשימוש נרחב בביוכימיה, ביולוגיה תאית וביולוגיה מולקולרית עבור יישומים כמו ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים, אימונופרציפיטציה וטיהור חלבונים.

עד כמה מדויקת בדיקת BCA?

בדיקת BCA מדויקת בדרך כלל בטווח של 5-10% כאשר היא מתבצעת כראוי. הדיוק שלה תלוי במספר גורמים כולל איכות עקומת הסטנדרט, היעדר חומרים מפריעים, והאם הרכב החלבון הלא ידוע דומה לחלבון הסטנדרט שבו השתמשת.

מה יכול להפריע לתוצאות בדיקת BCA?

מספר חומרים יכולים להפריע לתוצאות בדיקת BCA, כולל:

  • חומרים מחזרים (DTT, β-מרקפטואתנול, גלוטתיון)
  • חומרים קושרים (EDTA, EGTA)
  • ריכוזים גבוהים של סוכרים פשוטים
  • שומנים
  • חלק מהדטרגנטים בריכוזים גבוהים
  • חומרים אמוניה

מה ההבדל בין בדיקות BCA וברדפורד?

ההבדלים העיקריים הם:

  • בדיקת BCA מתאימה יותר לדטרגנטים וסורפקטנטים
  • בדיקת ברדפורד מהירה יותר (2-5 דקות מול 30+ דקות עבור BCA)
  • ל-BCA יש פחות שונות בין חלבונים
  • ברדפורד רגיש יותר לחומצות אמינו בסיסיות
  • BCA מושפעת מחומרים מחזרים, בעוד שברדפורד לא

למה נפח הדגימה המחושב שלי גדול מדי?

אם המחשבון שלך מציג נפח גדול מאוד, זה בדרך כלל מצביע על ריכוז חלבון נמוך בדגימה שלך. זה יכול להיות בגלל:

  1. תוכן חלבון נמוך בפועל בדגימה המקורית שלך
  2. אובדן חלבון במהלך ההכנה
  3. שגיאות בהליך בדיקת ה-BCA
  4. קריאת ספיגה לא מדויקת

שקול לרכז את הדגימה שלך או להתאים את העיצוב הניסויי שלך כדי להתחשב בריכוז החלבון הנמוך יותר.

האם אני יכול להשתמש במחשבון הזה עבור שיטות כימות חלבונים אחרות?

המחשבון הזה מיועד במיוחד לתוצאות בדיקת BCA. בעוד שהעיקרון הבסיסי (המרת ריכוז לנפח) חל על שיטות אחרות, הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון משתנה בין בדיקות שונות. עבור שיטות אחרות כמו ברדפורד או לורי, תצטרך להשתמש בפרמטרים שונים של עקומת הסטנדרט.

כיצד אני מתמודד עם דגימות עם ספיגה מחוץ לטווח הליניארי?

עבור קריאות ספיגה מחוץ לטווח הליניארי (בדרך כלל >2.0):

  1. דלל את הדגימה שלך וחזור על בדיקת ה-BCA
  2. השתמש בשיטת כימות חלבון אחרת
  3. התאם את עקומת הסטנדרט לכלול סטנדרטים בריכוזים גבוהים יותר

איזה חלבון עלי להשתמש כסטנדרט?

חלבון הסרום הבקרי (BSA) הוא הסטנדרט הנפוץ ביותר עבור בדיקות BCA מכיוון שהוא:

  • זמין בקלות וזול
  • מסיס מאוד
  • יציב בפתרון
  • מאופיין היטב

עם זאת, אם הדגימות שלך מכילות חלבון דומיננטי השונה באופן משמעותי מ-BSA, שקול להשתמש בחלבון זה כסטנדרט שלך עבור תוצאות מדויקות יותר.

כמה זמן התגובה של BCA יציבה?

הצבע הסגול המפותח בתגובה של BCA יציב במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר וניתן למדוד אותו בכל עת במהלך התקופה הזו. עם זאת, עבור תוצאות הטובות ביותר, מומלץ למדוד את כל הסטנדרטים והדגימות באותו זמן בערך לאחר פיתוח הצבע.

האם אני יכול להשתמש בעקומת הסטנדרט מניסוי קודם?

בעוד שניתן טכנית להשתמש בעקומת סטנדרט קודמת, לא מומלץ לעשות זאת עבור כימות מדויק. שינויים בריאגנטים, תנאי אינקובציה וכיול מכשירים יכולים להשפיע על הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון. עבור תוצאות אמינות, יש ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שאתה מבצע את הבדיקה.

מקורות

  1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

  2. Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." הוראות. זמין ב: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf

  3. Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3

  4. Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48

  5. Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

נסה את מחשבון נפח דגימה של BCA Absorbance היום!

עכשיו כשאתה מבין את העקרונות מאחורי כימות חלבונים של BCA וחישוב נפח הדגימה, נסה את המחשבון שלנו כדי לפשט את זרימת העבודה במעבדה שלך. פשוט הזן את קריאות הספיגה שלך ואת מסת הדגימה הרצויה כדי לקבל חישובי נפח דגימה מדויקים ומיידיים.

בין אם אתה מכין דגימות עבור ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים או כל ניסוי אחר המבוסס על חלבונים, המחשבון שלנו יעזור להבטיח תוצאות עקביות ואמינות. חסוך זמן, הפחת שגיאות ושפר את השחזור של ניסוייך עם מחשבון נפח דגימה של BCA Absorbance.

🔗

כלים קשורים

גלה עוד כלים שעשויים להיות שימושיים עבור זרימת העבודה שלך

מחשבון נפח מיכלים עגלגלים, כדוריים ומלבניים

נסה את הכלי הזה

מחשבון נפח לשטח לכיסוי נוזלי

נסה את הכלי הזה

מחשבון נפח חורים: חפירות צילינדריות ומלבניות

נסה את הכלי הזה

מחשבון נפח חורים: מדוד נפחי חפירות צילינדריות

נסה את הכלי הזה

מחשבון נפח תא קובייתי: מצא נפח מאורך קצה

נסה את הכלי הזה

מחשבון פשוט לגורם דילול עבור פתרונות מעבדה

נסה את הכלי הזה

מחשבון נפח חול: הערכת חומר לכל פרויקט

נסה את הכלי הזה

מחשבון מקדם ספיגת פוטונים כפולים

נסה את הכלי הזה

מחשבון מולריות: כלי לריכוז פתרונות

נסה את הכלי הזה