Hesabu ya Ligation ya DNA

Utangulizi

Ligation ya DNA ni mbinu muhimu katika biolojia ya molekuli inayotumika kuunganisha vipande vya DNA pamoja kwa kutumia vifungo vya covalent. Hesabu ya Ligation ya DNA ni chombo muhimu kwa watafiti, ikisaidia kubaini kiasi sahihi cha DNA ya vector na ya ingizo kinachohitajika kwa ajili ya mafanikio ya mchakato wa ligation. Kwa kuhesabu uwiano sahihi wa molar kati ya vector (plasmid) na vipande vya DNA vya ingizo, hesabu hii inahakikisha majaribio ya cloning ya molekuli yanafanikiwa huku ikipunguza matumizi ya reagenti na mchakato usiofanikiwa.

Mchakato wa ligation ni msingi wa uhandisi wa jeni, biolojia ya synthetiki, na taratibu za cloning ya molekuli. Inawawezesha wanasayansi kuunda molekuli za DNA zinazojumuisha kwa kuingiza jeni zinazovutia ndani ya vectors za plasmid kwa ajili ya kubadilishana baadaye katika viumbe wenyeji. Mafanikio ya michakato hii yanategemea sana matumizi ya kiasi sahihi cha vipengele vya DNA, ambacho ndicho hasa hesabu hii inasaidia kubaini.

Iwe unajenga vectors za uonyesho, unaunda maktaba za jeni, au unafanya subcloning za kawaida, hesabu hii ya ligation ya DNA itakusaidia kuboresha hali zako za majaribio na kuongeza kiwango chako cha mafanikio. Kwa kuingiza vigezo kadhaa muhimu kuhusu sampuli zako za DNA, unaweza kupata haraka kiasi sahihi kinachohitajika kwa mchakato wako maalum wa ligation.

Fomula/Hesabu

Hesabu ya ligation ya DNA inatumia fomula ya msingi ya biolojia ya molekuli inayozingatia saizi na viwango tofauti vya vipande vya DNA vinavyounganishwa. Hesabu kuu inahesabu ni kiasi gani cha DNA ya ingizo kinahitajika kulingana na DNA ya vector kwa msingi wa urefu wao na uwiano wa molar unaotakiwa.

Hesabu ya Kiasi cha Ingizo

Kiasi cha DNA ya ingizo kinachohitajika (katika nanograms) kinahesabiwa kwa kutumia fomula ifuatayo:

$\text{ng ya ingizo} = \text{ng ya vector} \times \frac{\text{kb saizi ya ingizo}}{\text{kb saizi ya vector}} \times \text{uwiano wa molar}$

Ambapo:

• ng ya vector = kiasi cha DNA ya vector kinachotumika katika mchakato (kawaida 50-100 ng)
• kb saizi ya ingizo = urefu wa kipande cha DNA cha ingizo katika kilobases (kb)
• kb saizi ya vector = urefu wa DNA ya vector katika kilobases (kb)
• uwiano wa molar = uwiano unaotakiwa wa molekuli za ingizo kwa molekuli za vector (kawaida 3:1 hadi 5:1)

Hesabu za Kiasi

Mara baada ya kubaini kiasi kinachohitajika cha DNA ya ingizo, kiasi kinachohitajika kwa mchakato kinahesabiwa:

$\text{Kiasi cha vector (μL)} = \frac{\text{ng ya vector}}{\text{kituo cha vector (ng/μL)}}$

$\text{Kiasi cha ingizo (μL)} = \frac{\text{ng ya ingizo}}{\text{kituo cha ingizo (ng/μL)}}$

$\text{Kiasi cha buffer/maji (μL)} = \text{Jumla ya kiasi cha mchakato (μL)} - \text{Kiasi cha vector (μL)} - \text{Kiasi cha ingizo (μL)}$

Mfano wa Hesabu

Hebu tufanye mfano wa vitendo:

• Kituo cha vector: 50 ng/μL
• Urefu wa vector: 3000 bp (3 kb)
• Kituo cha ingizo: 25 ng/μL
• Urefu wa ingizo: 1000 bp (1 kb)
• Uwiano wa molar unaotakiwa (ingizo:vector): 3:1
• Kiasi cha jumla cha mchakato: 20 μL
• Kiasi cha vector kinachotumika: 50 ng

Hatua ya 1: Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo $\text{ng ya ingizo} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Hatua ya 2: Hesabu kiasi $\text{Kiasi cha vector} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Kiasi cha ingizo} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Kiasi cha buffer/maji} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Hesabu hii inahakikisha kwamba kuna molekuli tatu za ingizo kwa kila molekuli moja ya vector katika mchakato, ikiboresha nafasi za mafanikio ya ligation.

Mwongozo wa Hatua kwa Hatua wa Kutumia Hesabu

Hesabu yetu ya Ligation ya DNA imeundwa kuwa rahisi na ya moja kwa moja. Fuata hatua hizi ili kuhesabu kiasi bora kwa mchakato wako wa ligation:

1. Ingiza Taarifa za Vector:

   • Ingiza kituo cha vector chako katika ng/μL
   • Ingiza urefu wa vector katika base pairs (bp)
   • Taja kiasi cha DNA ya vector unayotaka kutumia katika mchakato (ng)

2. Ingiza Taarifa za Ingizo:

   • Ingiza kituo cha ingizo chako katika ng/μL
   • Ingiza urefu wa ingizo katika base pairs (bp)

3. Weka Vigezo vya Mchakato:

   • Taja uwiano wa molar unaotakiwa (ingizo:vector) - kawaida kati ya 3:1 na 5:1
   • Ingiza kiasi cha jumla cha mchakato katika μL (kawaida 10-20 μL)

4. Tazama Matokeo:

   • Hesabu itatoa moja kwa moja:
     • Kiasi cha vector kinachohitajika (μL)
     • Kiasi cha ingizo kinachohitajika (μL)
     • Kiasi cha buffer/maji kinachohitajika (μL)
     • Jumla ya kiasi cha mchakato (μL)
     • Kiasi cha vector na ingizo katika mchakato (ng)

5. Nakili Matokeo (hiari):

   • Tumia kitufe cha "Nakili Matokeo" ili kunakili hesabu zote kwenye clipboard yako kwa ajili ya daftari la maabara au itifaki zako

Hesabu inafanya ukaguzi wa uthibitisho ili kuhakikisha kuwa ingizo zote ni nambari chanya na kwamba jumla ya kiasi inatosha kwa kiasi kinachohitajika cha DNA. Ikiwa makosa yoyote yanagundulika, ujumbe wa makosa utatoa mwongozo wa kukusaidia kurekebisha ingizo.

Matumizi

Hesabu ya Ligation ya DNA ni ya thamani katika matumizi mengi katika biolojia ya molekuli:

Cloning ya Molekuli

Matumizi ya kawaida ni cloning ya kawaida ya molekuli, ambapo watafiti wanaingiza jeni au vipande vya DNA ndani ya vectors za plasmid. Hesabu inahakikisha hali bora kwa:

• Subcloning ya jeni kati ya vectors tofauti za uonyesho
• Kuunda protini za fusion kwa kuunganisha vipande vingi vya jeni
• Kujenga majaribio ya jeni ya ripoti
• Kujenga maktaba za plasmid

Biolojia ya Synthetiki

Katika biolojia ya synthetiki, ambapo vipande vingi vya DNA mara nyingi vinakusanywa:

• Mchakato wa Gibson Assembly unafaidika na uwiano sahihi wa ingizo:vector
• Mifumo ya Golden Gate inahitaji viwango maalum vya DNA
• Kuunda sehemu za jeni za BioBrick
• Kujenga mizunguko ya jeni za synthetiki

Maendeleo ya Vifaa vya Uchunguzi

Wakati wa kuendeleza zana za uchunguzi wa molekuli:

• Cloning ya alama za jeni maalum za magonjwa
• Kujenga plasmids za udhibiti wa chanya
• Kuendeleza viwango vya kalibrimu kwa qPCR

Mifumo ya Uonyesho wa Protini

Kwa watafiti wanaofanya kazi juu ya uzalishaji wa protini:

• Kuboresha uwiano wa ingizo:vector kwa vectors za uonyesho za nakala nyingi
• Kujenga mifumo ya uonyesho inayoweza kuchochewa
• Kuunda vectors za kutolewa kwa ajili ya kusafisha protini

Maombi ya CRISPR-Cas9

Katika maombi ya uhariri wa genome:

• Cloning ya RNA za mwongozo ndani ya vectors za CRISPR
• Kuunda templeti za wahusika kwa ajili ya ukarabati wa homology
• Kujenga maktaba za RNA za mwongozo kwa ajili ya uchunguzi

Ligation Zenye Changamoto

Hesabu hii ni muhimu hasa kwa hali za ligation zenye changamoto:

• Cloning ya ingizo kubwa (>5 kb)
• Kuingiza vipande vidogo sana (<100 bp)
• Ligation za mwisho za blunt ambazo zina ufanisi wa chini
• Mchakato wa kuunganisha vipande vingi

Mbadala

Ingawa Hesabu yetu ya Ligation ya DNA inatoa hesabu sahihi kwa mchakato wa ligation wa jadi, njia kadhaa mbadala zinaweza kuwepo kwa kuunganisha vipande vya DNA:

1. Gibson Assembly: Inatumia exonuclease, polymerase, na ligase katika mchakato mmoja wa bomba ili kuunganisha vipande vya DNA vinavyoshirikiana. Hakuna hesabu ya ligation ya jadi inayohitajika, lakini uwiano wa viwango bado ni muhimu.

2. Golden Gate Assembly: Inatumia enzymes za kukata za Type IIS kwa kuunganisha kwa kuelekeza, bila alama ya kuondoa ya vipande vingi. Inahitaji viwango sawa vya vipande vyote.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Inatumia exonuclease kuunda overhangs za single-stranded ambazo huungana pamoja. Kawaida hutumia uwiano sawa wa vipande.

4. In-Fusion Cloning: Mfumo wa kibiashara unaoruhusu kuunganisha vipande na overlaps za 15 bp. Inatumia uwiano maalum kulingana na saizi za vipande.

5. Gateway Cloning: Inatumia uhamasishaji maalum badala ya ligation. Inahitaji vectors maalum za kuingia na za marudio.

6. Kujaribu Kitaalamu: Maabara zingine hupendelea kuweka mchakato wa ligation na uwiano tofauti wa ingizo:vector (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) na kubaini ni ipi inafanya kazi bora kwa muundo wao maalum.

7. Programu za Hesabu: Pakiti za programu za kibiashara kama Vector NTI na SnapGene zina hesabu za ligation zenye vipengele vya ziada kama uchambuzi wa tovuti za kukata.

Historia

Maendeleo ya hesabu za ligation ya DNA yanaendana na maendeleo ya mbinu za cloning ya molekuli, ambazo zimeleta mapinduzi katika biolojia ya molekuli na bioteknolojia.

Maendeleo ya Mapema (1970s)

Dhana ya ligation ya DNA kwa ajili ya cloning ya molekuli ilitokea katika miaka ya mapema ya 1970 na kazi ya awali ya Paul Berg, Herbert Boyer, na Stanley Cohen, ambao walikuza molekuli za kwanza za DNA zinazojumuisha. Wakati huu, mchakato wa ligation ulikuwa kwa kiasi kikubwa wa majaribio, huku watafiti wakitumia jaribio na makosa kubaini hali bora.

Ugunduzi wa enzymes za kukata na DNA ligase ulitoa zana muhimu za kukata na kuunganisha molekuli za DNA. T4 DNA ligase, iliyotengwa kutoka kwa E. coli iliyoambukizwa na virusi vya T4, ikawa enzyme ya kawaida kwa ajili ya kuunganisha vipande vya DNA kutokana na uwezo wake wa kuunganisha mwisho wa blunt na wa kushikamana.

Kipindi cha Kuboresha (1980s-1990s)

Kadri cloning ya molekuli ilivyokuwa ya kawaida zaidi, watafiti walianza kuendeleza mbinu za kimfumo zaidi kwa ajili ya mchakato wa ligation. Umuhimu wa uwiano wa molar kati ya DNA ya vector na ya ingizo ulionekana wazi, na kusababisha maendeleo ya fomula ya msingi inayotumika hadi leo.

Katika kipindi hiki, watafiti walithibitisha kwamba matumizi ya ziada ya DNA ya ingizo (kawaida uwiano wa 3:1 hadi 5:1) kwa ujumla iliboresha ufanisi wa ligation kwa matumizi ya cloning ya kawaida. Maarifa haya yalishirikiwa kwanza kupitia itifaki za maabara na polepole yakafika kwenye vitabu vya mwongozo wa biolojia ya molekuli na vitabu vya masomo.

Enzi ya Kisasa (2000s-Hadi Sasa)

Kuanzishwa kwa zana za kompyuta na hesabu za mtandaoni katika miaka ya 2000 kulifanya hesabu sahihi za ligation kuwa rahisi zaidi kwa watafiti. Kadri mbinu za biolojia ya molekuli zilivyozidi kuwa za kisasa, hitaji la hesabu sahihi liliongezeka, hasa kwa miradi ya cloning yenye changamoto inayohusisha vipande vingi au ingizo kubwa.

Leo, hesabu za ligation ya DNA ni sehemu muhimu ya michakato ya cloning ya molekuli, huku hesabu maalum kama hii ikisaidia watafiti kuboresha majaribio yao. Fomula ya msingi imebaki kuwa bila mabadiliko mengi, ingawa uelewa wetu wa mambo yanayoathiri ufanisi wa ligation umeimarika.

Kuibuka kwa mbinu mbadala za cloning kama Gibson Assembly na Golden Gate cloning kumetambulisha mahitaji mapya ya hesabu, lakini dhana ya msingi ya uwiano wa molar kati ya vipande vya DNA inabaki kuwa muhimu katika mbinu hizi.

Mifano ya Kanuni

Hapa kuna utekelezaji wa hesabu ya ligation ya DNA katika lugha mbalimbali za programu:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo katika ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Hesabu kiasi cha vector katika μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Hesabu kiasi cha ingizo katika μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Hesabu kiasi cha buffer/maji katika μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Mfano wa matumizi katika seli:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Hesabu kiasi kwa ajili ya mchakato wa ligation ya DNA.
5    
6    Parameta:
7    vector_concentration (float): Kituo cha DNA ya vector katika ng/μL
8    vector_length (float): Urefu wa DNA ya vector katika base pairs
9    insert_concentration (float): Kituo cha DNA ya ingizo katika ng/μL
10    insert_length (float): Urefu wa DNA ya ingizo katika base pairs
11    molar_ratio (float): Uwiano wa molar unaotakiwa wa ingizo:vector
12    total_volume (float): Kiasi cha jumla cha mchakato katika μL
13    vector_amount (float): Kiasi cha DNA ya vector kinachotumika katika ng (chaguo: 50)
14    
15    Inarudisha:
16    dict: Kifaa kinachoshikilia kiasi kilichohesabiwa na kiasi
17    """
18    # Hesabu kiasi cha vector
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Hesabu kiasi cha ingizo
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Hesabu kiasi cha buffer/maji
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Mfano wa matumizi
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Ingizo: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Jumla: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Geuza urefu kuwa kb kwa hesabu
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Hesabu kiasi
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Mfano wa matumizi
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Ingizo: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Jumla: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Geuza urefu kuwa kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Hesabu kiasi
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Punguza hadi sehemu 2
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Ingizo: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Jumla: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Geuza urefu kuwa kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Hesabu kiasi kinachohitajika cha ingizo
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Hesabu kiasi
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Punguza hadi sehemu 2
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Ingizo: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Jumla: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Maswali Yanayoulizwa Mara kwa Mara (FAQ)

Ni uwiano bora wa molar kwa ajili ya ligation ya DNA?

Uwiano bora wa molar wa ingizo kwa vector kwa kawaida unategemea kati ya 3:1 hadi 5:1 kwa matumizi ya cloning ya kawaida. Hata hivyo, hii inaweza kutofautiana kulingana na hali maalum ya ligation:

• Kwa ligation za mwisho za kushikamana: 3:1 hadi 5:1
• Kwa ligation za mwisho za blunt: 1:1 hadi 3:1
• Kwa ingizo kubwa (>10 kb): 1:1 hadi 2:1
• Kwa ingizo ndogo (<500 bp): 5:1 hadi 10:1
• Kwa kuunganisha vipande vingi: 3:1 kwa kila ingizo kwa vector

Kwa nini mchakato wangu wa ligation unashindwa licha ya kutumia kiasi kilichohesabiwa?

Sababu kadhaa zinaweza kuathiri ufanisi wa ligation zaidi ya uwiano wa molar:

1. Ubora wa DNA: Hakikisha vector na ingizo zote zina mwisho safi bila uharibifu
2. Kuondoa fosfati: Angalia kama vector yako imeondolewa fosfati, ambayo inazuia ligation ya binafsi
3. Ufanisi wa enzyme: Thibitisha kuwa ligase yako inafanya kazi na inatumika katika joto sahihi
4. Wakati wa kuunganishwa: Ligation zingine zinafaidika na muda mrefu wa kuunganishwa (usiku mzima katika 16°C)
5. Masharti ya buffer: Hakikisha buffer sahihi yenye ATP inatumika
6. Vichafuzi: Safisha DNA ili kuondoa vizuizi kama EDTA au chumvi nyingi

Ni kiasi gani cha DNA ya vector ninapaswa kutumia katika mchakato wa ligation?

Kawaida, 50-100 ng ya DNA ya vector inapendekezwa kwa mchakato wa ligation wa kawaida. Kutumia vector nyingi sana kunaweza kusababisha kuongezeka kwa nyuma ya vector isiyo katwa au iliyounganishwa, wakati kidogo sana inaweza kupunguza ufanisi wa uhamasishaji. Kwa ligation zenye changamoto, unaweza kuhitaji kuboresha kiasi hiki.

Je, ni lazima nibadilishe hesabu kwa ligation za mwisho za blunt dhidi ya za kushikamana?

Ndio. Ligation za mwisho za blunt kwa kawaida zina ufanisi mdogo kuliko ligation za mwisho za kushikamana. Kwa ligation za mwisho za blunt, tumia:

• Uwiano wa juu zaidi (3:1 hadi 5:1 au hata juu zaidi)
• Ligase ya T4 nyingi zaidi (kawaida mara 2-3 zaidi)
• Muda mrefu wa kuunganishwa
• Fikiria kuongeza PEG ili kuboresha ufanisi wa ligation

Je, naweza kuhesabu ligation kwa vipande vingi?

Kwa kuunganisha vipande vingi:

1. Hesabu kila kiasi cha ingizo kimoja kwa moja kwa kutumia fomula ile ile
2. Hifadhi uwiano wa jumla wa molar sawa (kwa mfano, kwa ingizo mbili, tumia 1.5:1.5:1 ingizo1:ingizo2:vector)
3. Badilisha kiasi cha jumla cha mchakato ili kuzingatia vipande vyote vya DNA
4. Fikiria ligation ya mfululizo au kutumia mbinu kama Gibson Assembly kwa vipande vingi

Je, naweza kutumia hesabu hii kwa Gibson Assembly au Golden Gate Assembly?

Hesabu hii imeundwa mahsusi kwa ajili ya ligation ya jadi inayotumia enzymes za kukata na ligase. Kwa Gibson Assembly, viwango sawa vya vipande vyote kwa kawaida vinapendekezwa (1:1), ingawa hesabu ya msingi ya kiasi cha DNA kulingana na urefu ni sawa. Kwa Golden Gate Assembly, viwango sawa vya vipande vyote pia vinatumika kwa kawaida.

Je, naweza kuzingatia kuondolewa kwa fosfati ya vector katika hesabu zangu?

Kuondolewa kwa fosfati ya vector (kuondoa vikundi vya fosfati vya 5') kunaweza kuzuia ligation ya binafsi lakini hakubadilishi hesabu za kiasi. Hata hivyo, kwa vectors zilizoondolewa fosfati:

1. Tumia DNA ya ingizo mpya yenye vikundi vya fosfati vya 5' vilivyohifadhiwa
2. Fikiria kutumia uwiano wa juu zaidi wa ingizo:vector (4:1 hadi 6:1)
3. Hakikisha kuwa muda wa kuunganishwa ni mrefu (angalau saa 1 katika joto la chumba au usiku mzima katika 16°C)

Ni kiasi gani cha chini cha jumla cha mchakato ninapaswa kutumia?

Kiasi cha chini cha mchakato wa vitendo kwa kawaida ni 10 μL, ambacho kinaruhusu mchanganyiko mzuri na kuzuia matatizo ya uvukizi. Ikiwa kiasi chako kilichohesabiwa cha DNA kinazidi kiasi kinachotakiwa, una chaguzi kadhaa:

1. Tumia sampuli za DNA zenye mkusanyiko zaidi
2. Punguza kiasi cha vector kinachotumika (kwa mfano, 25 ng badala ya 50 ng)
3. Ongeza kiasi cha jumla cha mchakato
4. Fikiria kuzingatia sampuli zako za DNA

Ni muda gani unapaswa kuunganishwa mchakato wangu wa ligation?

Muda bora wa kuunganishwa hutofautiana kulingana na aina ya ligation:

• Ligation za mwisho za kushikamana: saa 1 katika joto la chumba (22-25°C) au saa 4-16 katika 16°C
• Ligation za mwisho za blunt: saa 2-4 katika joto la chumba au usiku mzima (saa 12-16) katika 16°C
• Ligation za haraka (zinazotumia ligase ya mkusanyiko wa juu): dakika 5-15 katika joto la chumba

Je, naweza kutumia mchakato wa ligation uliobaki kwa uhamasishaji?

Ndio, mchanganyiko wa ligation unaweza kwa kawaida kuhifadhiwa katika -20°C na kutumika tena kwa uhamasishaji. Hata hivyo, kila mzunguko wa baridi-uvukizi unaweza kupunguza ufanisi. Kwa matokeo bora:

1. Punguza mchanganyiko wa ligation kabla ya kuf freezing
2. Joto joto ligase (65°C kwa dakika 10) kabla ya kuhifadhi
3. Tumia ndani ya miezi 1-2 kwa matokeo bora

Marejeleo

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (toleo la 3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (toleo la 4). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/