Kipima Utulivu wa Protini - Zana Huru ya pH na Joto

Kikokotoo cha umumunyifu wa protini hukadiria mkusanyiko wa juu zaidi wa protini unaobaki umeeyushwa katika kiyeyusho chini ya pH, halijoto na nguvu ya ioni fulani. Hubadilisha kemia ya msingi kuwa nambari moja, ya miligramu za protini kwa mililita ya kiyeyusho.

Umumunyifu wa protini ni muhimu katika biokemia, uundaji wa dawa na sayansi ya chakula. Protini ambayo haibaki ikiwa imeyeyuka hutengeneza mikusanyiko au mashapo, jambo linaloweza kuharibu jaribio au kufanya dawa isiweze kudungwa.

Jinsi ya kukokotoa umumunyifu wa protini

Umumunyifu hutegemea mambo matano: nukta ya isoelektriki ya protini (pH ambayo chaji yake halisi ni sifuri), nukta yake ya kuyeyuka (halijoto ambayo huanza kufunuka), konstanti ya dielektriki ya kiyeyusho (kipimo cha jinsi kinavyotenganisha chembe zenye chaji), pH ya myeyusho, na nguvu ya ioni (kipimo cha kiasi cha chumvi iliyoyeyushwa).

Kikokotoo huanza na umumunyifu unaojulikana wa kila protini katika maji chini ya hali za marejeo: 25 °C, pH 7.0, na nguvu ya ioni ya 0.15 M (takribani kiwango cha chumvi katika damu). Kisha huzidisha thamani hiyo ya marejeo kwa uwiano minne, mmoja kwa kila hali iliyobadilika.

Formula ya umumunyifu wa protini

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ ni umumunyifu unaojulikana wa protini katika maji chini ya hali za marejeo, kwa mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, ambapo $pI$ ni nukta ya isoelectric ya protini. Umumunyifu huwa wa chini zaidi kwenye nukta ya isoelectric na huongezeka pH inaposogea mbali nayo, kisha kutulia ndani ya takribani vitengo viwili vya pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, ambapo $I$ ni nguvu ya ioni katika moles kwa lita. Katika viwango vya chini vya chumvi, kipengele hiki huongeza kidogo umumunyifu (kuongezeka kwa umumunyifu kutokana na chumvi). Katika viwango vya juu vya chumvi, hupunguza umumunyifu (kupungua kwa umumunyifu kutokana na chumvi).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, ambapo $T_m$ ni joto la kuyeyuka la protini katika °C. Umumunyifu huongezeka taratibu kadiri halijoto inavyoongezeka, kisha hupungua kwa kasi halijoto inapokaribia $T_m$ na protini kuanza kufunuka.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, ambapo $\varepsilon$ ni konstanti ya dielektriki ya kiyeyusho. Maji yana konstanti ya dielektriki ya 78.4, hivyo kipengele hiki ni sawa na 1 katika maji. Viyeyusho vinavyotenganisha chaji kwa ufanisi mdogo kuliko maji, kama ethanoli, hupunguza umumunyifu.

Thamani za marejeo zinazotumiwa na kikokotoo

Makundi ya umumunyifu

Mfano: albumini katika bafa ya fosfati

Tafuta umumunyifu wa albumini katika bafa ya fosfati kwenye 25 °C, pH 7.4, na nguvu ya ioni ya 0.15 M.

Thamani za marejeo za albumini ni $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL, na $T_m = 63°C$. Bafa ya fosfati ina konstanti ya dielektriki ya 76.0.

1. Kipengele cha pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Uwiano: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Kipengele cha ioni: nguvu ya ioni (0.15 M) ni sawa na thamani ya marejeo, hivyo uwiano ni 1.
3. Kipengele cha halijoto: halijoto (25 °C) ni sawa na thamani ya marejeo, hivyo uwiano ni 1.
4. Kipengele cha kiyeyusho: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kikokotoo kinaripoti 492.12 mg/mL, ambayo iko katika kundi la “mumunyifu sana”.

Mfano: lisozimu katika gliceroli kwenye halijoto ya chini

Tafuta umumunyifu wa lisozimu katika myeyusho wa gliceroli kwenye 4 °C, pH 5.0, na nguvu ya ioni ya 0.1 M. Hizi ni hali zinazofanana na uhifadhi wa kimeng’enya kwenye baridi.

Thamani za marejeo za lisozimu ni $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL, na $T_m = 72°C$. Gliseroli ina konstanti ya dielektriki ya 42.5.

1. Kipengele cha pH: kusogea kutoka pH 7.0 hadi pH 5.0 (zote zikiwa chini sana ya pI ya 11.35) hubadilisha kipengele cha pH kidogo tu. Uwiano: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Kipengele cha ioni: kupunguza nguvu ya ioni kutoka 0.15 M hadi 0.1 M huongeza kidogo umumunyifu kupitia athari ya kuongezeka kwa umumunyifu kutokana na chumvi. Uwiano: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Kipengele cha halijoto: kupoza kutoka 25 °C hadi 4 °C, chini sana ya nukta ya kuyeyuka, hupunguza kipengele hicho. Uwiano: 0.8106.
4. Kipengele cha kiyeyusho: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kikokotoo kinaripoti 35.88 mg/mL, ambayo iko katika kundi la “huyeyuka”. Konstanti ya chini ya dielektriki ya gliceroli, si halijoto ya baridi, ndicho kinachoshusha matokeo kutoka kwenye thamani ya marejeo.

Jinsi ya kutumia kikokotoo cha umumunyifu wa protini

1. Chagua protini kutoka kwenye orodha: albumini, insulini, lisozimu, hemoglobini, mioglobini, kolajeni, kaseini au fibrinojeni.
2. Chagua kiyeyusho: maji, bafa ya fosfati, bafa ya Tris, gliceroli, DMSO, metanoli, ethanoli au asetoni.
3. Weka halijoto katika °C (0 hadi 100), pH (0 hadi 14), na nguvu ya ioni katika molari (0 hadi 2).
4. Soma umumunyifu uliokokotolewa katika mg/mL na kundi lake. Upau ulio chini ya matokeo huonyesha thamani kwenye kipimo cha 0 hadi 100 mg/mL, na hujaa kabisa kwenye 100 mg/mL au zaidi.

Nini huathiri umumunyifu wa protini

pH na nukta ya isoelectric. Kila protini ina nukta ya isoelectric, yaani pH ambayo uso wake hauna chaji ya umeme halisi. Kwenye pH hiyo, molekuli za protini hazisukumani, hivyo hushikamana na kutoka kwenye myeyusho kwa urahisi zaidi. Kusogeza pH mbali na nukta ya isoelectric, katika upande wowote, huipa protini chaji halisi. Molekuli zenye chaji husukumana, jambo linalozitenganisha na kuzifanya zibaki zimeyeyushwa.

Nguvu ya ioni. Ioni za chumvi iliyoyeyushwa huzunguka vikundi vya uso vyenye chaji vya protini. Katika viwango vya chini hadi vya wastani, ioni hizi huzuia chaji ambazo vinginevyo zingevuta molekuli mbili za protini pamoja, hivyo kuongeza umumunyifu. Hii huitwa kuongezeka kwa umumunyifu kutokana na chumvi. Katika viwango vya juu vya chumvi, ioni hushindana na protini kupata molekuli za maji, na kuondoa tabaka la maji linaloifanya protini ibaki imeyeyushwa. Hii huitwa kupungua kwa umumunyifu kutokana na chumvi, na ndiyo msingi wa njia ya kawaida ya kusafisha inayotumia salfati ya amonia kuleta protini zitoke kama mashapo kutoka kwenye mchanganyiko.

Halijoto. Kupasha myeyusho kwa kawaida huongeza umumunyifu, hadi kiwango fulani. Halijoto inapokaribia joto la kuyeyuka la protini, protini huanza kufunuka. Kufunuka huku hufichua sehemu za haidrofobiki (zinazokataa maji) za protini ambazo kwa kawaida hufichika ndani ya muundo wake uliokunjika. Sehemu hizo zilizofichuka hushikamana, na kusababisha protini kujikusanya, hivyo umumunyifu hupungua kwa kasi karibu na joto la kuyeyuka na juu yake.

Kiyeyusho. Konstanti ya dielektriki ya kiyeyusho hupima jinsi kinavyopunguza kwa ufanisi mvuto wa umeme kati ya chembe zenye chaji. Maji yana konstanti kubwa ya dielektriki na hutenganisha chaji vizuri, ndiyo sababu protini nyingi huyeyuka vizuri zaidi katika maji kuliko katika vimumunyisho vya kikaboni kama ethanoli au asetoni. Viyeyusho vyenye konstanti ya chini ya dielektriki huruhusu chaji tofauti kwenye molekuli za protini tofauti kuvutana kwa nguvu zaidi, hivyo kuhimiza protini kukusanyika.

Mipaka

Kikokotoo hutumia modeli iliyorahisishwa inayotegemea seti ndogo ya protini za marejeo na vimumunyisho vya kawaida. Haizingatii usafi wa protini, viungio kama deterjenti au vidhibiti, wala viambajengo vya bafa visivyo vya kawaida. Matokeo ni makadirio ya kupanga majaribio, si mbadala wa kupima umumunyifu moja kwa moja katika maabara.

Maswali yanayoulizwa mara kwa mara

Umumunyifu wa protini ni nini? Umumunyifu wa protini ni mkusanyiko wa juu zaidi wa protini unaobaki umeeyushwa kabisa katika kiyeyusho bila kutengeneza mikusanyiko au mashapo yanayoonekana.

Kwa nini protini huwa na umumunyifu mdogo zaidi kwenye nukta yake ya isoelectric? Kwenye nukta ya isoelectric, protini haina chaji ya umeme halisi, hivyo molekuli za protini hazisukumani tena kiumeme. Bila msukumo huo, kuna uwezekano mkubwa wa kushikamana na kutoka kwenye myeyusho.

Kuna tofauti gani kati ya kuongezeka na kupungua kwa umumunyifu kutokana na chumvi? Kuongezeka kwa umumunyifu kutokana na chumvi hutokea katika viwango vya chini vya chumvi, ambapo ioni zilizoyeyushwa huzuia vikundi vyenye chaji vya protini visivutane na huongeza umumunyifu. Kupungua kwa umumunyifu kutokana na chumvi hutokea katika viwango vya juu vya chumvi, ambapo ioni huondoa maji kwenye uso wa protini na kupunguza umumunyifu.

Je, halijoto ya juu huongeza umumunyifu kila wakati? Hapana. Umumunyifu huongezeka kwa halijoto hadi kiwango fulani tu. Halijoto inapokaribia joto la kuyeyuka la protini, protini huanza kufunuka, jambo ambalo kwa kawaida husababisha protini kujikusanya na umumunyifu kushuka kwa kasi.

Kwa nini protini huyeyuka kidogo katika ethanoli au asetoni kuliko katika maji? Maji yana konstanti ya juu ya dielektriki, kumaanisha kwamba hupunguza kwa ufanisi mkubwa mvuto wa umeme kati ya sehemu zenye chaji za molekuli za protini. Ethanoli na asetoni zina konstanti za chini za dielektriki, hivyo vikundi vyenye chaji kwenye molekuli tofauti za protini huvutana kwa nguvu zaidi katika vimumunyisho hivyo, na hivyo kuongeza uwezekano wa kujikusanya.

Kikokotoo hiki ni sahihi kwa kiwango gani? Hutoa makadirio yanayotegemea modeli ya kifizikia na seti ndogo ya protini na vimumunyisho vya marejeo. Ni muhimu kwa kupunguza idadi ya hali za kujaribu, lakini kipimo cha majaribio ndicho njia pekee ya kuthibitisha umumunyifu wa sampuli maalumu ya protini.

Masomo zaidi

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Utaratibu wa kuongezeka na kupungua kwa umumunyifu wa protini kunakosababishwa na chumvi za kationi zenye valensi mbili. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Kupima na kuongeza umumunyifu wa protini. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Protini, Asidi za Amino na Peptidi kama Ioni na Ioni Dipola. Reinhold Publishing.