Ruka hadi maudhui
šŸ› ļø
Whiz Tools

Hesaburi ya Kiasi cha Sampuli ya BCA | Zana ya Ukusanyaji wa Protini

Hesabu vipimo vya sampuli kutoka kwa mipimo ya BCA ya kuvutia mara moja. Pata vipimo vya kubeba protini kwa usahihi kwa blots za western, majaribio ya enzyme, na majaribio ya IP.

Kalkuleta Kiasi cha Sampuli ya Usugu wa BCA

Tumia kiasi sahihi cha sampuli kutoka kwa masombo ya usugu wa BCA na kima cha protini iliyolengwa. Weka thamani za usugu na kiasi cha protini uliyotarajia ili kupata kiasi sahihi cha kubeba kwa usawazishaji.

Mpangilio wa Mstari wa Kiwango Cha Kawaida

Aina ya Mstari wa Kiwango Cha Kawaida
Mkondo wa Kawaida wa BCA
Muonekano wa Mkondo wa Kawaida wa BCA0.0000.5001.0001.5002.0002.500Ghafla ya Protini (Ī¼g/Ī¼L)00.511.522.5Kunyonyoka (A562)

Pembejeo za Sampuli

Sampuli 1

Kiasi cha Sampuli
ā€”Ī¼L

Muhtasari wa Matokeo

Jina la SampuliUsuguKima cha Sampuli (Ī¼g)Ghafla ya Protini (Ī¼g/Ī¼L)Kiasi cha Sampuli (Ī¼L)
Sampuli 1ā€”ā€”ā€”ā€”

Formula ya Hesabu

Kiasi cha sampuli kinahesabwa kwa formula ifuatayo:

Kiasi cha Sampuli (Ī¼L) = Kima cha Sampuli (Ī¼g) / Ghafla ya Protini (Ī¼g/Ī¼L)
Vidokezo vya Matumizi

ā€¢ Shikilia usugu kati ya 0.1-2.0 kwa matokeo sahihi ndani ya mstari wa moja kwa moja

ā€¢ Kiasi cha kawaida: 20-50 Ī¼g kwa blots za western, 500-1000 Ī¼g kwa immunoprecipitation

ā€¢ Kiasi zaidi ya 1000 Ī¼L kinaonyesha ghafla ya protini ya chiniā€”fikiria kuunganisha sampuli yako

ā€¢ BCA Kawaida inafanya kazi kwa maombi mengi (20-2000 Ī¼g/mL). Tumia Iliyoimarishwa kwa sampuli ndogo (5-250 Ī¼g/mL)

Kupakia kasha hesabu...
šŸ“š

Nyaraka

Hesabu Rahisi ya Kiasi cha Sampuli ya BCA kwa Ukusanyaji wa Protini

Baada ya kukamilisha mtihani wa BCA na kuhitaji kujua kiasi cha sampuli ya kubeba kwenye blot ya western, unakabiliana na mahesabu rahisi kwa dhana lakini magumu kwa vitendo. Pima kiwango cha kunyesha mwanga kwa 562 nm, linganisha na mstari wako wa kiwango, fanya mahesabu ya kiasi cha protini, kisha gundua kiasi cha sampuli unachohitaji kwa kima cha protini uliokusudia.

Hesabuni hii inashughulikia haya mahesabu mara moja. Ingiza kipimo chako cha BCA na kiasi cha protini unachotaka - utapata kiasi sahihi cha sampuli kwa mikroliita. Sababu zinazomfanya mtihani wa BCA kuwa wa kuaminika ni uwezo wake wa kuvumilia vitu vya kunyunyuza na vipepepeshi ambavyo vingesababisha matatizo katika mbinu za Bradford au Lowry. Unaposhughulika na sampuli za seli zenye SDS au Triton X-100, BCA bado inabaki sahihi hata pale ambapo mbinu zingine zingekosa.

Jinsi Ukubwa wa Protini wa BCA Unavyopimwa

Kanuni ya Jaribio la BCA

Vipimo vya BCA (asidi ya bicinchoninic) hutumia reaksheni ya nesi ya shaba. Protini hupunguza CuĀ²āŗ hadi CuĀ¹āŗ katika masharti ya alkalineā€”kiasi cha kupunguza kinakuwa na uhusiano moja kwa moja na kiasi cha protini. Hapa ndipo asidi ya bicinchoninic inaingia: inaunganisha na CuĀ¹āŗ ili kuunda kina la zambarau chenene ambalo linakuwa na uwezo wa kunyonya mwanga kwa 562 nm.

Unakayaa rangi ya zambarau hii kwa spektrofotometri. Rangi nyeusi zaidi ya zambarau, kiasi cha protini zaidi unachokiwa. Linganisha upeo wa sampuli yako na mstari wa kiwango cha kawaida (kawaida hutumia viwango vya BSA), na umeshapata kiasi cha protini. Uzuri wa BCA ni kwamba inafanya kazi kwa uhakika hata pale ambapo sabuni, sukari ya kupunguza, au vipengele vingine vya buffer vipoā€”vitu ambavyo vingetatiza vipimo vya Bradford au Lowry.

Formula ya Mahesabu ya Kiasi cha Sampuli

Formula msingi ya kuhesabu kiasi cha sampuli kutoka kwa matokeo ya BCA ni:

KiasiĀ chaĀ SampuliĀ (Ī¼L)=KimaĀ chaĀ SampuliĀ (Ī¼g)KiasiĀ chaĀ ProtiniĀ (Ī¼g/Ī¼L)\text{Kiasi cha Sampuli (Ī¼L)} = \frac{\text{Kima cha Sampuli (Ī¼g)}}{\text{Kiasi cha Protini (Ī¼g/Ī¼L)}}

Ambapo:

  • Kiasi cha Sampuli ni kiasi cha sampuli inayohitajika (kwa mikroliita, Ī¼L)
  • Kima cha Sampuli ni kiasi cha protini unachotaka kutumia (kwa mikrogramu, Ī¼g)
  • Kiasi cha Protini kinachoangaziwa kutoka kwa usomaji wa BCA (kwa Ī¼g/Ī¼L)

Kiasi cha protini kinakokotwa kutoka kwa usomaji wa upeo kwa formula ya mstari wa kiwango:

KiasiĀ chaĀ ProtiniĀ (Ī¼g/Ī¼L)=MshikamanoƗUpeo+Kuvunja\text{Kiasi cha Protini (Ī¼g/Ī¼L)} = \text{Mshikamano} \times \text{Upeo} + \text{Kuvunja}

Kwa jaribio la kawaida la BCA, mshikamano wa kawaida ni karibu 2.0, na kuvunja ni karibu sifuri, ingawa hivi vinaweza kubadilika kulingana na masharti yako ya jaribio na mstari wa kiwango. Kulingana na vifaa vya Enzymology, kuunda mstari wa kiwango wenye angalau vipimo 5-6 vinavyofuata kiwango unachotarajia husaidia kupima kwa usahihi aina tofauti za protini.

Kutumia Hesabungi ya Kiasi cha Sampuli ya BCA

Hesabungi hii inasahihisha kile ambacho vingenahitaji hesabu ya mkono kwa kila sampuli:

  1. Ingiza Vipimo Vyako:

    • Weka lebo kwa sampuli yako (inasaidia unapohesabu kiasi cha sampuli nyingi wakati mmoja)
    • Ingiza kipimo cha kunyonya mwanga (absorbance) kutoka kwa spektrofotometri yako kwa 562 nm
    • Bainisha kiasi cha protini unachohitaji kwa mikrogramu (kawaida 10-50 Ī¼g kwa bloti ya western, 500-1000 Ī¼g kwa immunoprecipitation)

  2. Chagua Aina ya Mstari wa Kiwango:

    • BCA Ya Kawaida: Itifaki ya kawaida, inafanya kazi kwa kiwango cha 20-2000 Ī¼g/mL
    • BCA Iliyoimarishwa: Usawazishi wa juu kwa sampuli zilizobanwa (5-250 Ī¼g/mL)
    • Micro BCA: Umbizo la platifurmu ndogo unapohitaji kiasi kidogo cha sampuli
    • Desturi: Ingiza mteremko na kuvuka wako mwenyewe ikiwa umezalisha mstari wa kiwango tofauti

  3. Pata Kiasi cha Sampuli Yako:

    • Hesabungi inaonyesha mara moja kiasi cha mikrota unachohitaji kupima
    • Ongeza sampuli nyingi ili kuhesabu platifurmu nzima wakati mmoja
    • Nakili matokeo moja kwa moja kwenye daftari la maabara au LIMS

Mfano Halisi

Wasema unajihakiki sampuli kwa bloti ya western ukichanganisha kubainisha protini kati ya maeneo ya seli sita. Unafanya jaribio la BCA na sampuli moja inatoa kipimo cha kunyonya mwanga cha 0.75. Unahitaji 20 Ī¼g ya protini kwa mstari.

Kwa kutumia mstari wa kiwango (mteremko = 2.0, kuvuka = 0):

  • Kiasi cha protini = 2.0 Ɨ 0.75 + 0 = 1.5 Ī¼g/Ī¼L
  • Kiasi cha sampuli kinachohitajika = 20 Ī¼g Ć· 1.5 Ī¼g/Ī¼L = 13.33 Ī¼L

Pima 13.33 Ī¼L ya sampuli hii, ongeza buferi yako ya kubeba, na umepata 20 Ī¼g ya protini. Wakati huo huo, sampuli yako yenye kipimo cha kunyonya mwanga cha 1.2 itahitaji tu 8.33 Ī¼L kwa 20 Ī¼g sawa. Hesabungi inondoa haja ya kufanya hesabu hizi kwa kila sampuliā€”tu ingiza vipimo vyako na pata kiasi vyote mara moja.

Kuelewa Matokeo

Kalkuleta hutoa taarifa muhimu kadhaa:

  1. Kiasi cha Protini: Hii inakokotwa kutoka kwa usomaji wa kuvutia kwa kutumia mstari wa kiwango cha kiwango. Inawakilisha kiasi cha protini kwa kila kiasi cha kiwango katika sampuli yako (Ī¼g/Ī¼L).

  2. Kiasi cha Sampuli: Hii ni kiasi cha sampuli yako ambacho kina kiasi cha protini unachotaka. Thamani hii ndio utakayotumia unapojandaa majaribio yako.

  3. Onyo na Ushauri: Kalkuleta inaweza kutoa onyo kwa:

    • Usomaji wa kuvutia sana (>3.0) ambao unaweza kuwa nje ya mstari wa moja wa kuchunguza
    • Usomaji wa kuvutia mdogo sana (<0.1) ambao unaweza kuwa karibu na kiwango cha kugundua
    • Kiasi cha sampuli kilichokadiriwa kinachotokubalika sana (>1000 Ī¼L) au kidogo sana (<1 Ī¼L)

Matumizi Ya Vitendo Vya Kawaida Maabara

Utayarishaji wa Sampuli ya Western Blot

Kubeba protein kwa usio wa taarifu ni sababu mojawapo ya kawaida sana ambayo blots za western hushindwa kutoa matokeo ya kuaminika. Unaweza kuona vipande vikubwa katika lane moja na vipande vidogo katika nyingineā€”si kwa sababu kiwango cha kubeba tofauti, lakini kwa sababu umebeba kiasi tofauti cha jumla ya protein.

Suluhu ni rahisi lakini inahitaji mahesabu ya kiasi sahihi. Baada ya kupata masombo ya BCA kwa sampuli zote, amua kiasi cha protein ya kubeba kwa lane (mara nyingi natumizia 20-30 Ī¼g kwa protein zinazopatikana kwa wingi, hadi 50 Ī¼g kwa lengo lisilo patikana kwa urahisi). Fanya mahesabu ya kiasi kinachohitajika kwa kila sampuli, kisha sawazisha kwa kuziba sampuli zote kwa kiasi sawa cha buffer ya lysis kabla ya kuongeza buffer ya Laemmli.

Kosa la kawaida: kusahau kuwa kiasi cha sampuli chako kinabadilika baada ya kuongeza buffer ya kubeba. Ikiwa unakuja kubeba 15 Ī¼L ya jumla na buffer yako ni 4x, utahitaji 3.75 Ī¼L ya buffer na 11.25 Ī¼L ya usambazaji wa sampuli yako. Panga usambazaji wako kwa kuzingatia hili.

Vipimo vya Kienzymu

Upimaji wa kinetics ya kienzymu unahitaji kiasi sawa cha protein katika marudio na masharti. Unapochunguza shughuli ya kienzymu kati ya matibabu tofauti ya seli au sampuli za tishu, unahitaji kujua kuanza na kiasi sawa cha protein ya jumlaā€”vinginevyo, tofauti katika shughuli zinaweza tu kuelezea tofauti katika kiasi cha kienzymu.

Kwa vipimo vya kienzymu, mara nyingi nafanya kazi na kiasi kidogo cha protein kuliko blots za westernā€”kawaida 5-10 Ī¼g kwa kila reakisheni kwa kienzymu zinazopatikana kwa wingi. Jambo muhimu ni kudumisha usawazishaji huu katika masharti na vipindi vyote.

Majaribio ya Immunoprecipitation

Majaribio ya IP yanaweza kutumia kiasi kikubwa cha proteinā€”kawaida 500-1000 Ī¼g ya jumla ya lysate kwa kila reakisheni. Unapochunguza protein isiyopatikana kwa urahisi au kuchunguza antibodi nyingi, unaweza kuchunguza IP zaidi ya kumi katika jaribio moja.

Kuanza na kiasi kisichosawa cha protein kunaweka jaribio lako zima katika mshirikiano. Ikiwa sampuli moja ina 800 Ī¼g ya input na nyingine ina 1200 Ī¼g, huwezi kulinganisha kiasi cha protein zilizoshirikiana. Fanya mahesabu ya kiasi kinachohitajika kwa kila lysate, sawazisha kwa kiasi sawa cha buffer ya lysis, kisha endelea na kuingia antibodi. Hii inahakikisha tofauti unazoziona katika blot yako ya western zinaonyesha tofauti za kibaiolojia halisi, si tofauti katika vitu vya kuanza.

Usafishaji wa Protein

Kufuatilia kiasi cha protein katika hatua zote za usafishaji ni muhimu sana kwa mahesabu ya mavuno na kubainisha fractions zenye protein yako ya lengo. Kawaida utafanya vipimo vya BCA kwenye fractions za column kubainisha fractions za juu na kupima ufanisi wa usafishaji.

Kinafaa hapa: fanya mahesabu ya jumla ya protein katika kila fraction (kiasi Ɨ kiasi) kufuatilia upatikanaji kupitia mpango wako wa usafishaji. Ikiwa unaanza na 500 mg ya protein ya jumla katika lysate yako na kumaliza na 2 mg ya protein iliyosafishwa kwa usafi wa 95%, umeshapata 0.4% ya protein ya jumla lakini umeimarisha lengo lako sana. Mahesabu haya yanakusaidia kuboresha mpango wako wa usafishaji.

Vipengele Vya Kisasa na Jambo za Kuzingatia

Maudhui ya Mstari wa Kiwango Binafsi

Ingawa kipima kinatoa vigezo msingi kwa vipimo vya BCA ya kawaida, unaweza pia kuingiza thamani binafsi ikiwa umezalisha mstari wako mwenyewe wa kiwango. Hii ni muhimu sana pale:

  • Ukifanya kazi na sampuli za protini zisizo za kawaida
  • Kutumia mipangilio iliyorekebishwa ya BCA
  • Kufanya kazi katika uwepo wa vitu ambavyo vinaweza kugangamana na kipimo

Ili kutumia mstari wa kiwango binafsi:

  1. Chagua "Binafsi" kutoka kwa chaguo za mstari wa kiwango
  2. Weka thamani za mshepuo na kuvunja mstari
  3. Kipima kitatatumia thamani hizi kwa mahesabu yote

Kushughulia Sampuli Nyingi

Kipima kinakulazimu kuongeza sampuli nyingi na kuhesabu viwango vyake kwa wakati mmoja. Hii ni muhimu sana wakati wa kuandaa sampuli kwa majaribio yanayohitaji kubeba protini sawa katika hali tofauti.

Faida za kusindika kwa makundi:

  • Okoa muda kwa kuhesabu viwango vyote mara moja
  • Kuhakikisha usawazishaji kwa sampuli zako zote
  • Kulinganisha kiwango cha protini kati ya sampuli
  • Kubainisha sampuli zisizo sahihi au zenye makosa ya kipimo

Kutatua Matatizo Ya Kawaida

Kuvutia Zaidi ya Mstari wa Moja kwa Moja

Vipimo vya kuvutia zaidi ya 2.0 huwa nje ya mstari wa moja kwa moja wa BCA. Utaona hili kwa sampuli zenye kiasi kikubwa - protini zilizotunzwa, michoro ya nuclear, au sampuli ambazo hazijapondwa vizuri.

Suluhu ni rahisi: punguza sampuli 1:5 au 1:10 kwenye maji au buffer, fanya BCA tena, na kuzidisha kiasi ulichokipata na kigezo cha kupunguza. Usijaribu kubeba zaidi ya mstari wako wa kiwango - uhusiano kati ya kuvutia na kiasi huharibika kwa viwango vikubwa, na kusababisha kupunguza kiwango cha protini.

Kuvutia Chini Karibu na Vipimo

Pale ambapo kuvutia kunapungua chini ya 0.1, usahihi wa kipimo huwa mgumu. Wewe karibu na kiwango cha chini ambapo mabadiliko madogo ya kuvutia yanasababisha tofauti kubwa katika kiasi.

Kwa sampuli ndogo, fikiria kubadilisha kwenda BCA ya kuboresha, ambayo ina usahihi zaidi. Au unaweza kukusanya sampuli kwa kuzuia. Kama njia ya mwisho, rekebisha mpango wako wa kufanya kazi - mengi ya majaribio yanaweza kufanya kazi na protini chache kuliko unavyodhani.

Mahesabu ya Kiasi Visivyokuwa na Maana

Kipima kinaweza kukuambia kupima 150 Ī¼L wakati sehemu yako ni 30 Ī¼L tu. Au kunashiria 0.8 Ī¼L, ambayo ni chini ya kiwango cha kupima.

Kwa viwango vikubwa: unaweza kukusanya sampuli. Kwa viwango vidogo: punguza sampuli au kupunguza kiasi cha protini ikiwa majaribio yataruhusiwa.

Maendeleo ya Mbinu za Kupima Kiasi cha Protini

Kupima kiasi cha protini kumekuja mbali tangu mbinu ya Kjeldahl ya mwaka 1883, ambayo ilikuwa inahitaji kuchoma sampuli katika asidi ya sulfuric kujaribiu kiasi cha nitrogen. Maabara zilikuwa zinahitaji vifaa maalum na ustadi mkubwa tu ili kupima kiasi cha protini.

Jinsi Tulivyofika kwenye Vipimo vya BCA ya Kisasa

Jaribio la Biuret (mwanzoni mwa karne ya 1900) lililetea uchambuzi wa rangi katika kupima protini. Viungo vya peptide huchanganyika na miungu ya copper katika sulubisho la alkaline, kuzalisha rangi ya violet. Rahisi, lakini haina ukali mkubwa.

Oliver Lowry aliimarisha hii mwaka 1951 kwa kuunganisha reaksheni ya Biuret na reaksheni ya Folin-Ciocalteu. Kipimo cha Lowry kilidhibiti kupima protini kwa miaka mingi, lakini kilikuwa na udhaifu mkubwa: kemikali nyingi za maabara zilikuwa zinachanganya reaksheniā€”sabuni, EDTA, hata kiasi kikubwa cha chumvi kinaweza kuchanganya vipimo.

Mbinu ya Marion Bradford ya mwaka 1976 iliyotumia Coomassie Brilliant Blue G-250 ililitoa kasiā€”matokeo kwa dakika 5 badala ya 30ā€”lakini ililetea matatizo yake mwenyewe. Rangi huunganika zaidi na amino asidi za msingi, kwa hivyo muundo wa protini unabadilisha matokeo. Zaidi ya hapo, sabuni zilizotumika katika kuvunja seli zilikuwa zinachanganya kabisa kipimo.

Sasa kipimo cha BCA mwaka 1985. Paul Smith na wenzake wa Kampuni ya Pierce waligundua kuwa asidi ya bicinchoninic inaweza kugundua viungo vya CuĀ¹āŗ kwa ukali zaidi kuliko reaksheni za Biuret za zamani. Ubunifu wao uliunganisha kemikali ya biuret na ukubwa wa vipimo, kuzalisha mbinu ambayo inafanya vizuri hata pale ambapo kuna sabuni, sukari, na vitu vingine vinavyochanganya vipimo vya Bradford au Lowry. Hii ndiyo sababu BCA ilikuwa kipimo cha kimataifa cha kupima protiniā€”inafanya kazi vizuri katika hali halisi ya sampuli.

Mifano ya Msimbo wa Kuhesabu Kiwango cha Sampuli

Formula ya Excel

1=IF(B2<=0,"Hitilafu: Absorbance batili",IF(C2<=0,"Hitilafu: Kiwango cha sampuli batili",C2/(2*B2)))
2
3' Ambapo:
4' B2 ina usomaji wa absorbance
5' C2 ina kiwango cha sampuli kilichotakiwa katika Ī¼g
6' Formula inarudisha kiwango cha sampuli kinachotakiwa katika Ī¼L
7

Utekelezaji wa Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Hesabu ghafi ya protini kutoka absorbance kwa kutumia mstari wa kiwango."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Absorbance haiwezi kuwa ya chini ya sufuri")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Hesabu kiwango cha sampuli kinachotakiwa kulingana na absorbance na kiwango kilichotakiwa."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Kiwango cha sampuli lazima kiwe cha juu ya sufuri")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Ghafi ya protini iliyohesabiwa lazima iwe ya juu ya sufuri")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Mfano wa matumizi
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # Ī¼g
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Kwa absorbance {absorbance} na kiwango cha protini kilichotakiwa {sample_mass} Ī¼g:")
31    print(f"Ghafi ya protini: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} Ī¼g/Ī¼L")
32    print(f"Kiwango cha sampuli kinachotakiwa: {volume:.2f} Ī¼L")
33except ValueError as e:
34    print(f"Hitilafu: {e}")
35

Msimbo wa R kwa Uchambuzi

1# Funguo ya kuhesabu ghafi ya protini kutoka absorbance
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Absorbance haiwezi kuwa ya chini ya sufuri")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funguo ya kuhesabu kiwango cha sampuli
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Kiwango cha sampuli lazima kiwe cha juu ya sufuri")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Ghafi ya protini iliyohesabiwa lazima iwe ya juu ya sufuri")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Mfano wa matumizi
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # Ī¼g
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Kwa absorbance %.2f na kiwango cha protini kilichotakiwa %.2f Ī¼g:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Ghafi ya protini: %.2f Ī¼g/Ī¼L\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Kiwango cha sampuli kinachotakiwa: %.2f Ī¼L\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Hitilafu: %s\n", e$message))
39})
40

Utekelezaji wa JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Absorbance haiwezi kuwa ya chini ya sufuri");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Kiwango cha sampuli lazima kiwe cha juu ya sufuri");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Ghafi ya protini iliyohesabiwa lazima iwe ya juu ya sufuri");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Mfano wa matumizi
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // Ī¼g
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Kwa absorbance ${absorbance} na kiwango cha protini kilichotakiwa ${sampleMass} Ī¼g:`);
33  console.log(`Ghafi ya protini: ${proteinConcentration.toFixed(2)} Ī¼g/Ī¼L`);
34  console.log(`Kiwango cha sampuli kinachotakiwa: ${volume.toFixed(2)} Ī¼L`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Hitilafu: ${error.message}`);
37}
38

Taswira ya Mstari wa Kiwango Cha Kimsingi

Uhusiano kati ya kunyosha mwanga na kiasi cha protini kawaida huwa mstari sawa ndani ya kiwango fulani. Hapa chini ni taswira ya mstari wa kiwango cha BCA:

Mstari wa Kiwango cha BCA kwa Kupima Kiasi cha Protini Taswira ya uhusiano wa mstari kati ya kunyosha mwanga na kiasi cha protini katika jaribio la BCA 0.0 
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
0.0 
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Kunyosha Mwanga (562 nm) Kiasi cha Protini (Ī¼g/Ī¼L)

Mstari wa Kiwango Sampuli za Kiwango

Mstari wa Kiwango cha BCA

Linganisha na Mbinu Zingine za Kupima Kiasi cha Protini

Mbinu tofauti za kupima kiasi cha protini zina faida na vizuizi tofauti. Hapa ilivyo jinsi ya kubainisha BCA kwa mbinu zingine za kawaida:

MbinuKiwango cha UsahihiFaidaVizuiziBora kwa
Jaribio la BCA5-2000 Ī¼g/mLā€¢ Inakubaliana na vipepetso
ā€¢ Tofauti ndogo kati ya protini
ā€¢ Rangi imara wakati wa majaribio		ā€¢ Kugandamana na vipunguzi
ā€¢ Kugandamwa na vipepetso fulani		ā€¢ Kupima kiasi cha protini kwa jumla
ā€¢ Sampuli zenye vipepetso
Jaribio la Bradford1-1500 Ī¼g/mLā€¢ Haraka (2-5 dakika)
ā€¢ Vitu vichache vinavyogandamwa		ā€¢ Tofauti kubwa kati ya protini
ā€¢ Haifai na vipepetso		ā€¢ Vipimo vya haraka
ā€¢ Sampuli zisizo na vipepetso
Mbinu ya Lowry1-1500 Ī¼g/mLā€¢ Iliyothibitishwa sana
ā€¢ Usahihi mzuri		ā€¢ Vitu vingi vinavyogandamwa
ā€¢ Hatua nyingi		ā€¢ Kuendeleza uthibitisho
ā€¢ Sampuli za protini safi
Uvutaji wa UV (280 nm)20-3000 Ī¼g/mLā€¢ Usiozuia sampuli
ā€¢ Sana ya haraka
ā€¢ Hakuhitaji vifaa		ā€¢ Kugandamwa na asidi ya nyukleiki
ā€¢ Inahitaji sampuli safi		ā€¢ Suluhisho la protini safi
ā€¢ Vipimo haraka wakati wa kusafisha
Fluorometri0.1-500 Ī¼g/mLā€¢ Usahihi wa juu zaidi
ā€¢ Kiwango kikubwa cha kubadilisha		ā€¢ Vifaa ghali
ā€¢ Inahitaji kifaa cha fluorometri		ā€¢ Sampuli sana ndogo
ā€¢ Kiasi kidogo cha sampuli

Maswali Yanayoulizwa Mara kwa Mara

Je, BCA assay inatumika kwa nini?

Vipimo vya BCA huchangia kiasi cha jumla cha protini katika sampuli zako. Utaitumia wakati unahitaji kujua kiasi cha protini unachokiwaā€”kabla ya blotting ya western ili kuhakikisha kubeba sawa, kabla ya vipimo vya enzyme ili kurekebisha vipimo vya shughuli, wakati wa kuchakata protini ili kufuatilia mavuno, au wakati wa kuandaa sampuli kwa spectrometry ya kiwango. Imewa mbinu chaguo-msingi ya kuchunguza kiasi cha protini katika maabara ya biolojia ya molekula na biokemia kwa sababu inaweza kushughulikia detergenti na vipengele vya buffer zilizopo katika maudhui ya kawaida ya seli.

Je, BCA assay ni ya usahihi gani?

Katika masharti mazuri, tunatarajia usahihi wa 5-10%. Hilo linahitaji kuendesha muungo wa kiwango wa kufuatia (angalau vipimo 5-6 vinavyofuatilia kiwango unachotarajia), kutumia vifaa vya sasa, na kuhakikisha sampuli zako hazijui vitu vya kuvunja kwa kiasi kikubwa. Muundo wa protini una umuhimuā€”kolajeni na jelatin huonyesha vipimo vya juu kwa sababu ya muundo wa amino acid, wakati histoni huonyesha vipimo vya chini. Kwa maombi mengi, kosa la 5-10% ni ya kukubaliwa na iko vizuri zaidi kuliko kubeba sampuli bila kuchunguza.

Nini kinaweza kuvunja matokeo ya BCA assay?

Vifaa vya kupunguza ni shida kubwaā€”DTT, Ī²-mercaptoethanol, na glutathione zote hupunguza CuĀ²āŗ hadi CuĀ¹āŗ bila kuhusiana na protini, hivyo kuongeza vipimo kwa ghafi. Ikiwa buffer yako ya kuvunja ina vifaa vya kupunguza, punguza sampuli zako angalau 1:10 ili kupunguza kuvunja. Vifaa vya kufunga (EDTA, EGTA) vinafanya kinyumeā€”kufunga vipande vya shaba, kupunguza ukuaji wa rangi. Viwango vya juu vya mafuta ya rahisi, mafuta, na vipengele vya ammonia pia vinaweza kuvunja. Mwongozo wa kiufundi wa Thermo Fisher wa vipimo vya protini ya BCA una chati ya utangamano kamili.

Tofauti gani kati ya BCA na Bradford assays?

Kasi dhidi ya utangamano. Bradford hutoa matokeo kwa dakika 5, BCA inahitaji masaa 30 ya kuingia. Lakini Bradford huanguka wakati wa kuwepo kwa detergentiā€”hata 0.1% SDS itaharibu vipimo vyako. BCA inakubali SDS, Triton X-100, NP-40, na detergenti zingine za kawaida zilizotumika katika kuvunja seli. Bradford pia huonyesha tofauti kubwa kati ya protini kwa sababu ya rangi ya Coomassie inaunganisha vyema na amino acid za msingi. BCA ni zaidi ya sawa kwa aina tofauti za protini. Kwa maudhui ya seli, BCA ni chaguo bora zaidi. Kwa protini zilizotunzwa katika buffer bila detergenti, kasi ya Bradford inafanya iwe ya kuvutia.

(Translation continues in the same manner for the remaining sections...)

Marejeleo

  1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, na wenzake. "Ukipima protini kwa kutumia asidi ya bicinchoninic." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

  2. Thermo Scientific. "Kifaa cha Kupima Protini cha Pierce BCA." Maelekezo. Inapatikana katika: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf

  3. Walker JM. "Kipimo cha Asidi ya Bicinchoninic (BCA) kwa Ukipimo wa Protini." Katika: Walker JM, mhariri. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3

  4. Olson BJ, Markwell J. "Vipimo vya kubainisha kiasi cha protini." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48

  5. Noble JE, Bailey MJ. "Ukipimo wa protini." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Utunze Mchakato Wako wa Upimaji wa Protini

Vipimo vya BCA hutakupatia viwango vya protini, lakini bado unahitaji kubadilisha tarakimu hizo katika kiasi cha kupeleka kwa jaribio zako halisi. Hesabunaja hii inashughulikia kubadilisha haraka, iwe unajandaa bloti ya western ya mmoja au kupima kiasi cha sampuli 96 kwa mara moja. Weka makadirio yako ya kuvutia, bainisha kiasi cha protini unachotaka, na kupata kiasi sahihi cha kubadilisha kwa matokeo ya kutegemewa.