Hesabu kiasi sahihi cha sampuli kulingana na viwango vya kunyonya vya BCA na uzito wa protini unaotakiwa. Muhimu kwa upakiaji thabiti wa protini katika blot za magharibi na matumizi mengine ya maabara.
Chombo hiki kinakadiria kiasi kinachohitajika cha sampuli kulingana na matokeo ya kunyonya ya BCA na uzito wa sampuli. Weka thamani ya kunyonya na uzito wa sampuli kwa kila sampuli ili kukadiria kiasi kinachohusiana cha sampuli.
Kiasi cha sampuli kinakadiria kwa kutumia fomula ifuatayo:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Kihesabu cha Kiasi cha Sampuli ya BCA ni chombo maalum kilichoundwa kusaidia watafiti na wahandisi wa maabara kubaini kwa usahihi kiasi sahihi cha sampuli kwa majaribio kulingana na matokeo ya jaribio la BCA (asidic ya bicinchoninic). Kihesabu hiki kinachukua usomaji wa absorbance kutoka kwa jaribio lako la BCA na uzito wa sampuli unaotakiwa ili kuhesabu kiasi sahihi kinachohitajika kwa upakiaji wa protini thabiti katika matumizi kama vile blotting ya magharibi, majaribio ya enzymatic, na mbinu nyingine za uchambuzi wa protini.
Jaribio la BCA ni moja ya mbinu zinazotumika sana kwa ajili ya kuhesabu protini katika maabara za biokemia na biolojia ya molekuli. Kwa kupima absorbance ya sampuli zako za protini na kuzipeleka kwenye curve ya kawaida, unaweza kubaini mkusanyiko wa protini kwa usahihi wa juu. Kihesabu chetu kinarahisisha mchakato huu kwa kubadilisha moja kwa moja usomaji wa absorbance kuwa kiasi sahihi cha sampuli kinachohitajika kwa majaribio yako.
Jaribio la Asidi ya Bicinchoninic (BCA) ni jaribio la kibaolojia kwa ajili ya kubaini mkusanyiko wa jumla wa protini katika suluhisho. Kanuni ya jaribio hili inategemea uundaji wa mchanganyiko wa Cu²⁺-protini chini ya hali za alkali, ikifuatiwa na kupunguzwa kwa Cu²⁺ kuwa Cu¹⁺. Kiasi cha kupunguzwa kinategemea protini iliyo hapo. BCA inaunda mchanganyiko wa rangi ya zambarau na Cu¹⁺ katika mazingira ya alkali, ikitoa msingi wa kufuatilia kupunguzwa kwa shaba na protini.
Upeo wa rangi ya zambarau huongezeka kwa uwiano na mkusanyiko wa protini, ambao unaweza kupimwa kwa kutumia spectrophotometer kwa takriban 562 nm. Usomaji wa absorbance kisha unalinganishwa na curve ya kawaida ili kubaini mkusanyiko wa protini katika sampuli zisizo na majibu.
Formula ya msingi ya kuhesabu kiasi cha sampuli kutokana na matokeo ya absorbance ya BCA ni:
Ambapo:
Mkusanyiko wa protini unahesabiwa kutoka kwa usomaji wa absorbance kwa kutumia equation ya curve ya kawaida:
Kwa jaribio la kawaida la BCA, mteremko wa kawaida ni takriban 2.0, na kipande mara nyingi ni karibu sifuri, ingawa thamani hizi zinaweza kutofautiana kulingana na hali zako maalum za jaribio na curve ya kawaida.
Kihesabu chetu kinarahisisha mchakato wa kubaini kiasi cha sampuli kutoka kwa matokeo ya jaribio la BCA. Fuata hatua hizi ili kupata hesabu sahihi:
Ingiza Taarifa za Sampuli:
Chagua Aina ya Curve ya Kawaida:
Tazama Matokeo:
Nakili au Export Matokeo:
Hebu tufanye mfano wa vitendo:
Hii inamaanisha unapaswa kupakia 13.33 μL ya sampuli yako ili kupata 20 μg ya protini.
Kihesabu kinatoa vipande kadhaa muhimu vya habari:
Mkusanyiko wa Protini: Hii inahesabiwa kutoka kwa usomaji wako wa absorbance kwa kutumia curve ya kawaida iliyochaguliwa. Inawakilisha kiasi cha protini kwa kila kitengo cha ujazo katika sampuli yako (μg/μL).
Kiasi cha Sampuli: Hiki ni kiasi cha sampuli yako kinachohitaji mkusanyiko wako unaotakiwa wa protini. Thamani hii ndiyo utatumia unapokuwa unajiandaa kwa majaribio yako.
Onyo na Mapendekezo: Kihesabu kinaweza kutoa maonyo kwa:
Moja ya matumizi ya kawaida ya kihesabu hiki ni kuandaa sampuli kwa ajili ya blotting ya magharibi. Upakiaji wa protini thabiti ni muhimu kwa matokeo ya kuaminika ya blotting ya magharibi, na kihesabu hiki kinahakikisha unapakua kiasi sawa cha protini kwa kila sampuli, hata wakati mkusanyiko wao unapotofautiana.
Mfano wa mchakato:
Kwa majaribio ya enzymatic, mara nyingi inahitajika kutumia kiasi maalum cha protini ili kuandaa hali za majibu sawa kati ya sampuli tofauti au majaribio.
Mfano wa mchakato:
Katika majaribio ya immunoprecipitation (IP), kuanzia na kiasi thabiti cha protini ni muhimu kwa kulinganisha matokeo kati ya hali tofauti.
Mfano wa mchakato:
Wakati wa usafishaji wa protini, mara nyingi inahitajika kufuatilia mkusanyiko wa protini na kuhesabu mazao katika hatua tofauti.
Mfano wa mchakato:
Ingawa kihesabu kinatoa vigezo vya kawaida kwa jaribio la BCA, unaweza pia kuingiza thamani za kawaida ikiwa umepata curve yako mwenyewe ya kawaida. Hii ni muhimu hasa wakati:
Ili kutumia curve ya kawaida:
Kihesabu kinakuwezesha kuongeza sampuli nyingi na kuhesabu kiasi chao kwa wakati mmoja. Hii ni muhimu hasa wakati wa kuandaa sampuli kwa majaribio ambayo yanahitaji upakiaji thabiti wa protini kati ya hali tofauti.
Manufaa ya usindikaji wa kundi:
Ikiwa usomaji wako wa absorbance uko juu ya 2.0, inaweza kuwa nje ya upeo wa laini wa jaribio la BCA. Katika hali hizi:
Kwa usomaji wa absorbance chini ya 0.1, unaweza kuwa karibu na kikomo cha kugundua cha jaribio, ambacho kinaweza kuathiri usahihi. Fikiria:
Ikiwa kihesabu kinapendekeza kiasi ambacho ni kubwa sana kwa matumizi yako:
Kuangalia kwa usahihi kwa protini kumekuwa hitaji muhimu katika biokemia na biolojia ya molekuli tangu nyanja hizi zilipoibuka. Mbinu za awali zilitegemea kubaini maudhui ya nitrojeni, ambayo yalihitaji muda mwingi na vifaa maalum.
Njia ya Kjeldahl (1883): Mojawapo ya mbinu za awali za kuhesabu protini, inayotegemea kupima maudhui ya nitrojeni.
Jaribio la Biuret (Mwanzo wa 1900s): Mbinu hii inategemea mchanganyiko kati ya viungo vya peptide na ioni za shaba katika suluhisho la alkali, ikitoa rangi ya zambarau.
Jaribio la Lowry (1951): Lilibuniwa na Oliver Lowry, mbinu hii ilichanganya mchakato wa Biuret na wakala wa Folin-Ciocalteu, ikiongeza nyeti.
Jaribio la Bradford (1976): Marion Bradford alibuni mbinu hii kwa kutumia rangi ya Coomassie Brilliant Blue G-250, ambayo inashikamana na protini na kuhamasisha mabadiliko ya ngozi.
Jaribio la BCA (1985): Lilibuniwa na Paul Smith na wenzake katika kampuni ya Pierce Chemical, mbinu hii ilichanganya mchakato wa biuret na ugunduzi wa BCA, ikitoa nyeti iliyoimarishwa na ufanisi na detergents.
Jaribio la BCA lilielezewa kwanza katika karatasi ya 1985 na Smith et al. iliyoitwa "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Ilibuniwa ili kushughulikia mapungufu ya mbinu zilizopo, hasa kuingiliwa na kemikali mbalimbali zinazotumika mara kwa mara katika uchimbaji na usafishaji wa protini.
Ubunifu muhimu ulikuwa ni kutumia asidi ya bicinchoninic kugundua ioni za Cu¹⁺ zinazozalishwa na kupunguzwa kwa Cu²⁺ na protini, na kuunda mchanganyiko wa rangi ya zambarau ambao unaweza kupimwa spectrophotometrically. Hii ilitoa faida kadhaa:
Tangu kuanzishwa kwake, jaribio la BCA limekuwa moja ya mbinu zinazotumika sana za kuhesabu protini katika maabara za biokemia na biolojia ya molekuli duniani kote.
1=IF(B2<=0,"Kosa: Absorbance isiyo sahihi",IF(C2<=0,"Kosa: Uzito wa sampuli isiyo sahihi",C2/(2*B2)))
2
3' Ambapo:
4' B2 ina usomaji wa absorbance
5' C2 ina uzito wa sampuli unaotakiwa katika μg
6' Formula inarudisha kiasi kinachohitajika cha sampuli katika μL
7
1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Hesabu mkusanyiko wa protini kutoka kwa absorbance kwa kutumia curve ya kawaida."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbance haiwezi kuwa hasi")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Hesabu kiasi kinachohitajika cha sampuli kulingana na absorbance na uzito unaotakiwa."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Uzito wa sampuli lazima uwe chanya")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Mkusanyiko wa protini uliokadiriwa lazima uwe chanya")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Matumizi ya mfano
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Kwa absorbance {absorbance} na uzito wa protini unaotakiwa {sample_mass} μg:")
31 print(f"Mkusanyiko wa protini: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Kiasi kinachohitajika cha sampuli: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Kosa: {e}")
35
1# Kazi ya kuhesabu mkusanyiko wa protini kutoka kwa absorbance
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbance haiwezi kuwa hasi")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Kazi ya kuhesabu kiasi cha sampuli
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Uzito wa sampuli lazima uwe chanya")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Mkusanyiko wa protini uliokadiriwa lazima uwe chanya")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Matumizi ya mfano
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Kwa absorbance %.2f na uzito wa protini unaotakiwa %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Mkusanyiko wa protini: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Kiasi kinachohitajika cha sampuli: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Kosa: %s\n", e$message))
39})
40
1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbance haiwezi kuwa hasi");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Uzito wa sampuli lazima uwe chanya");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Mkusanyiko wa protini uliokadiriwa lazima uwe chanya");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Matumizi ya mfano
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Kwa absorbance ${absorbance} na uzito wa protini unaotakiwa ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Mkusanyiko wa protini: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Kiasi kinachohitajika cha sampuli: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Kosa: ${error.message}`);
37}
38
Uhusiano kati ya absorbance na mkusanyiko wa protini kwa kawaida huwa wa laini ndani ya upeo fulani. Hapa kuna uonyeshaji wa curve ya kawaida ya BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Mbinu tofauti za kuangalia protini zina faida na mapungufu mbalimbali. Hapa kuna jinsi jaribio la BCA linavyolinganishwa na mbinu nyingine maarufu.
Mbinu | Upeo wa Nyeti | Faida | Mapungufu | Bora Kwa |
---|---|---|---|---|
Jaribio la BCA | 5-2000 μg/mL | • Inafaa na detergents • Kidogo kuathiriwa na tofauti za protini • Maendeleo ya rangi thabiti | • Kuingiliwa na wakala wa kupunguza • Kuathiriwa na baadhi ya wakala wa chelating | • Kuangalia protini kwa ujumla • Sampuli zinazohusisha detergents |
Jaribio la Bradford | 1-1500 μg/mL | • Haraka (dakika 2-5) • Vitu vichache vinavyoweza kuingilia | • Tofauti kubwa kati ya protini • Haifai na detergents | • Vipimo vya haraka • Sampuli zisizo na detergents |
Njia ya Lowry | 1-1500 μg/mL | • Imeanzishwa vizuri • Nyeti nzuri | • Vitu vingi vinavyoweza kuingilia • Hatua nyingi | • Uthibitisho wa kihistoria • Sampuli za protini safi |
UV Absorbance (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Isiyo na uharibifu • Haraka sana • Hakuna vichocheo vinavyohitajika | • Kuathiriwa na asidi za nucleic • Inahitaji sampuli safi | • Suluhisho safi za protini • Ukaguzi wa haraka wakati wa usafishaji |
Fluorometric | 0.1-500 μg/mL | • Nyeti zaidi • Upeo mpana wa nyeti | • Vichocheo ghali • Inahitaji fluorometer | • Sampuli nyembamba sana • Kiasi kidogo cha sampuli |
Jaribio la BCA (asidic ya bicinchoninic) linatumika hasa kwa kuhesabu mkusanyiko wa jumla wa protini katika sampuli. Linatumika sana katika biokemia, biolojia ya seli, na biolojia ya molekuli kwa matumizi kama vile blotting ya magharibi, majaribio ya enzymatic, immunoprecipitation, na usafishaji wa protini.
Jaribio la BCA kwa ujumla lina usahihi ndani ya 5-10% linapofanywa kwa usahihi. Usahihi wake unategemea mambo kadhaa ikiwa ni pamoja na ubora wa curve ya kawaida, kutokuwepo kwa vitu vinavyoweza kuingilia, na kama muundo wa protini isiyo na majibu ni sawa na protini ya kawaida iliyotumika.
Vitu kadhaa vinaweza kuingilia kati na matokeo ya jaribio la BCA, ikiwa ni pamoja na:
Tofauti kuu ni:
Ikiwa kihesabu kinapendekeza kiasi kikubwa sana, kwa kawaida inaashiria mkusanyiko wa chini wa protini katika sampuli yako. Hii inaweza kutokana na:
Fikiria kuongeza mkusanyiko wa sampuli yako au kubadilisha muundo wa majaribio yako ili kukidhi mkusanyiko wa chini wa protini.
Kihesabu hiki kimeundwa mahsusi kwa matokeo ya jaribio la BCA. Ingawa kanuni ya msingi (kubadilisha mkusanyiko kuwa kiasi) inatumika kwa mbinu nyingine, uhusiano kati ya absorbance na mkusanyiko wa protini hutofautiana kati ya jaribio tofauti. Kwa mbinu nyingine kama Bradford au Lowry, unahitaji kutumia vigezo tofauti vya curve ya kawaida.
Kwa usomaji wa absorbance nje ya upeo wa laini (kawaida >2.0):
Albumin ya Serum ya Ng'ombe (BSA) ndiyo kiwango kinachotumika sana kwa jaribio la BCA kwa sababu ni:
Hata hivyo, ikiwa sampuli zako zina protini inayotawala ambayo inatofautiana sana na BSA, fikiria kutumia protini hiyo kama kiwango chako kwa matokeo sahihi zaidi.
Rangi ya zambarau inayoendelezwa katika mchakato wa BCA inakaa kwa masaa kadhaa kwenye joto la kawaida na inaweza kupimwa wakati wowote ndani ya kipindi hicho. Hata hivyo, kwa matokeo bora, inashauriwa kupima viwango vyote na sampuli kwa takriban wakati sawa baada ya maendeleo ya rangi.
Ingawa inawezekana kutumia curve ya kawaida, haitashauriwa kwa kuhesabu kwa usahihi. Tofauti katika vichocheo, hali za kuingiza, na kalibra ya kifaa zinaweza kuathiri uhusiano kati ya absorbance na mkusanyiko wa protini. Kwa matokeo ya kuaminika, tengeneza curve mpya ya kawaida kila wakati unapofanya jaribio.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Maelekezo. Inapatikana kwenye: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." Katika: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Sasa kwamba unaelewa kanuni za kuangalia protini za BCA na kuhesabu kiasi cha sampuli, jaribu kihesabu chetu ili kuharakisha mchakato wako wa maabara. Ingiza tu usomaji wako wa absorbance na uzito wa sampuli unaotakiwa ili kupata hesabu za mara moja, sahihi za kiasi cha sampuli.
Iwe unajiandaa kwa sampuli za blotting ya magharibi, majaribio ya enzymatic, au majaribio mengine yoyote yanayotegemea protini, kihesabu chetu kitakusaidia kuhakikisha matokeo thabiti na ya kuaminika. Okoa muda, punguza makosa, na ongeza kurudiwa kwa majaribio yako kwa Kihesabu cha Kiasi cha Sampuli ya BCA.
Gundua zana zaidi ambazo zinaweza kuwa na manufaa kwa mtiririko wako wa kazi